用于化学发光免疫检测aep的非特异性吸附清洗液
阅读说明：本技术 用于化学发光免疫检测aep的非特异性吸附清洗液 (Non-specific adsorption cleaning solution for chemiluminescence immunoassay AEP ) 是由 郭方 陈峻崧 徐文克 李锐 于 2021-07-21 设计创作，主要内容包括：一种用于化学发光免疫检测AEP的非特异性吸附清洗液,每升包括10-100mMol/L缓冲液、0.01-1wt％表面活性剂、100-300mMol/L无机盐、0.5-0.1g/L防腐剂,余量为水。本发明能够去除蛋白粘附,并使样品中内源脂溶性物质增溶分散,降低了分析结果的偏差,提高了检测的准确度,对内源性干扰物清洗效果极佳,一定程度上保证了临床样本检测的准确性。(A non-specific adsorption cleaning solution for AEP of chemiluminescence immunoassay comprises 10-100mMol/L buffer solution, 0.01-1 wt% of surfactant, 100-300mMol/L inorganic salt, 0.5-0.1g/L preservative and the balance of water per liter. The invention can remove protein adhesion, solubilize and disperse endogenous fat-soluble substances in a sample, reduce the deviation of an analysis result, improve the detection accuracy, has excellent cleaning effect on endogenous interferents and ensures the accuracy of clinical sample detection to a certain extent.)
技术领域
本发明涉及的是一种化学发光免疫分析领域的技术，具体是一种用于化学发光免疫检测AEP的非特异性吸附清洗液。
背景技术
化学发光免疫分析CLIA是继放免RIA、酶免ELISA、荧光免疫FFIA后的一种新型免疫技术，它联合应用了高灵敏度的化学发光技术和具有高度特异性的免疫反应，可用于检测微量抗体或抗原。其原理为：将发光物或酶标记在抗原/抗体上，在孵育过程中抗原抗体形成免疫复合物，随后借助清洗液洗去多余的抗原/抗体，最后加入氧化剂或底物，测定发光信号。信号的强弱与待测物的浓度成相关性。
AEP属于天冬酰胺酰肽链内切酶，当采用化学发光免疫方法检测人体液中AEP浓度时，现有化学发光清洗缓冲液无法消除其他蛋白非特异性吸附，血红蛋白和胆红素等造成的结果偏差。
发明内容
本发明针对现有技术在AEP检测过程中，无法较好消除其复杂样本中非AEP蛋白的吸附，血红蛋白和胆红素的干扰，致使在AEP检测时产生偏差，提出一种用于化学发光免疫检测AEP的非特异性吸附清洗液，能够去除蛋白粘附，并使样品中内源脂溶性物质增溶分散，降低了分析结果的偏差，提高了检测的准确度，对内源性干扰物清洗效果极佳，一定程度上保证了临床样本检测的准确性。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明涉及一种用于化学发光免疫检测AEP的非特异性吸附清洗液，其中每升包括10-100mMol/L缓冲液、0.01-1wt％表面活性剂、100-300mMol/L无机盐、0.5-0.1g/L防腐剂，余量为水。
所述的非特异性吸附清洗是指：通过在特定缓冲液，离子强度存在条件下，利用不同表面活性剂组合改变清洗缓冲液HLB值和CMC值，以达到解除非特异性吸附、粘附及增加非极性物质的水溶性，从而满足在AEP检测过程中对特异性和敏感性要求。
所述的表面活性剂为阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性表面活性剂、非离子表面活性剂或其组合，其中：阴离子表面活性剂包括硫酸酯盐型，阳离子表面活性剂包括烷基季铵盐，两性表面活性剂包括甜菜碱型，非离子表面活性剂包括多元醇类表面活性剂和聚氧乙烯型表面活性剂。
所述的缓冲液包括三羟甲基氨基甲烷、哌嗪-1,4-二乙磺酸、3-吗啉丙磺酸、磷酸盐缓冲液或组合，pH值为7.0-8.5，优选为7.5和8.0。
所述的无机盐为氯化钠或氯化钾。
所述的防腐剂为Proclin 300、Proclin 950或叠氮钠。
所述的用于化学发光免疫检测AEP的清洗液，优选为以下任意一种：
①10-200mMol/L三羟甲基氨基甲烷、0.01-1wt％聚氧乙烯十二烷基醚与3-磺丙基十四烷基甜菜碱的混合液、100-300mMol/L氯化钠、0.5-0.1g/LProclin300，其中：聚氧乙烯十二烷基醚与3-磺丙基十四烷基甜菜碱按照重量比为4:1进行配比混合形成复配型表面活性剂，其HLB值和CMC值发生有利于蛋白分散，液体表面张力变小，脂溶性变强，以达到更佳的清洗效果。
②10-200mMol/L三羟甲基氨基甲烷、0.01-1wt％脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠、100-300mMol/L氯化钠、0.5-0.1g/LProclin300。
③10-200mmol/L三羟甲基氨基甲烷、0.01-1wt％非离子表面活性剂、100-300mMol/L氯化钠、0.5-0.1g/LProclin300，其中：非离子表面活性剂采用重量比为1:4:5的NP 40、Tween20和聚氧乙烯十二烷基醚，混合形成复配型表面活性剂；该复配型表面活性剂的HLB值和CMC值发生有利于蛋白分散，液体表面张力变小，脂溶性变强，以达到更佳的清洗效果。
技术效果
本发明整体解决了现有技术的无法应用于化学发光免疫分析法测定AEP的试剂中，尤其在AEP测定过程中的内源性干扰和非特异性反应问题。本发明通过改变清洗缓冲液中表面活性剂组分和浓度，改变样本中蛋白质表面亲水性，去除蛋白粘附及聚集，同时对甘油三酯，胆红素等脂溶性物质具有增溶分散效果，在清洗过程中使其均匀分撒在洗液中，减少异相颗粒(磁珠)表面的非特异性吸附导致的检测结果偏差，以提高实际检测的准确度和精密度。
具体实施方式
本实施例涉及一种用于化学发光免疫检测AEP的非特异性吸附清洗液，包括：10-200mmol/L缓冲液、0.01-1wt％表面活性剂、100-300mMol/L无机盐、0.5-0.1g/L防腐剂，余量为水。
所述的表面活性剂为阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性表面活性剂或非离子表面活性剂中的任意一类或多类混合。
所述的阴离子表面活性剂采用硫酸酯盐型，分子通式为ROSO3 -X+，烃基R碳原子个数在12-15之间，X多为Na+，K+，NH4 +，具体为包括脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸盐(AES)、聚氧乙烯烷基醚硫酸酯盐、聚氧乙烯多环苯基醚硫酸酯盐。
所述的阳离子表面活性剂采用烷基季铵盐，分子通式为R4N+X-，其中烃基R碳原子总数在10-16之间，4个烃基R可相同，也可不同，X多为卤素负离子如Br-，Cl-。作为烷基季铵盐的市售品，可以列举十烷基三甲基溴化铵(阿拉丁)、十二烷基三甲基溴化铵(Sigma)、十四烷基三甲基氯化铵(Sigma)等。
所述的两性表面活性剂采用甜菜碱型，一种为磺基甜菜碱，分子通式为RN+(CH3)2CH2COO-，烃基R的碳原子个数在12-18之间，另一种为氧化胺甜菜碱，分子通式为R4N+X→O，烃基R的碳原子个数在10-16之间。作为磺基甜菜碱的市售品，可以列举十二烷基羟丙基磺基甜菜碱(上海圣轩生物化学有限公司)，3-磺丙基十四烷基甜菜碱(阿拉丁)。作为氧化胺甜菜碱的市售品，可以列举椰油酰胺丙基甜菜碱(上海源叶生物科技有限公司)等。
所述的非离子表面活性剂采用多元醇类表面活性剂如司盘类和吐温类或聚氧乙烯型表面活性剂，如脂肪醇聚氧乙烯醚(AEO)、烷基酚聚氧乙烯醚，其中AEO的分子通式为RO(CH2CH2O)nH，R为碳原子个数12-18的烃基，n(即聚合度)为6-10之间。烷基酚聚氧乙烯醚采用TX或OP系列，聚合度在8-12之间。以上所有非离子表活亲水亲油平衡(HydrophileLipophilic Balance，HLB)值在8-18之间。作为司盘类市售品，可以列举司盘20(生工生物工程(上海)股份有限公司)。作为吐温类市售品，可以列举吐温20(索莱宝)，吐温40，吐温60，吐温80(以上为生工生物工程(上海)股份有限公司)。作为脂肪醇聚氧乙烯醚的市售品，可以列举脂肪醇聚氧乙烯醚7(HLB值12)，脂肪醇聚氧乙烯醚9(HLB值13)，脂肪醇聚氧乙烯醚10(13.5)，脂肪醇聚氧乙烯醚15(14.5)(以上为临沂绿森)等。作为烷基酚聚氧乙烯醚的市售品，可以列举EMULGEN 105(HLB值9.7)，EMULGEN 106(HLB值10.5)，EMULGEN 108(HLB值12.1),EMULGEN 109P(HLB值13.6)，二苯乙烯基苯酚聚氧乙烯醚(HLB值10.5)(以上为日本花王)，曲拉通X 100(西宝生物科技(上海)股份有限公司)，NP 40(Amresco)等。
所述的缓冲液采用三羟甲基氨基甲烷、哌嗪-1,4-二乙磺酸、3-吗啉丙磺酸、磷酸盐缓冲液中的一种或多种。
所述的无机盐采用氯化钠或氯化钾，防腐剂为Proclin系列或叠氮钠，其中：Proclin系列包括Proclin 300、Proclin 950。
本实施例中的清洗液优选配方为：三羟甲基氨基甲烷20mM、氯化钠150mM、表面活性剂0.01-1wt％、Proclin 3001g/L。
通过将上述组分混合后，调节pH值至7.4-7.8，按照不同表活组合及用量见表1。
表1清洗液中不同表活组合及用量
本实施例采用宁波紫园生产的FC-8小型化学发光免疫分析仪，通过将磁珠试剂、酶标抗体试剂、清洗液及底物试剂、待测样本分别加注于测定试剂卡的相应孔位后，分别取定量样本，酶标抗体加入磁珠试剂孔位混匀，37℃孵育5至10min，收集反应后的免疫磁珠颗粒；分别加入定量清洗液混匀，收集免疫磁珠颗粒(重复2-3次)，将清洗好的免疫磁珠颗粒用底物试剂悬浮，测定其发光信号值，再根据测定获得的发光信号值与样本浓度关系，计算待测样本浓度值。
实施例1
本实施例采用以下配方：10-200mMol/L三羟甲基氨基甲烷；0.01-1wt％聚氧乙烯十二烷基醚与3-磺丙基十四烷基甜菜碱的混合液；100-300mMol/L氯化钠；0.5-0.1g/LProclin300；其中：聚氧乙烯十二烷基醚与3-磺丙基十四烷基甜菜碱按照重量比为4:1进行配比。
本实施例在清洗液清洗效果的验证：按表1组别4配制清洗液，对清洗液进行分装及样本测试。取10位健康人群的全血样本，一份采用清洗，一份采用对照洗液(0.5％的吐温20磷酸盐缓冲液)，除清洗液外其他试剂均相同，进行测试，项目选择肌钙蛋白I，观察发光强度，进行比较。
样本号
对照组
实施例1
1
668
552
2
589
536
3
1056
573
4
814
610
5
730
442
6
621
648
7
884
646
8
557
332
9
619
605
10
863
647
本实施例在清洗液准确性的评价：按表1组别4配制清洗液，对清洗液进行分装及样本测试。取50位患者的全血样本进行测试AEP浓度。
表2实施例1清洗液准确性结果
项目名称
线性回归方程
相关系数
AEP
y＝1.218x+0.225
0.991
从实验结果来看，相关系数达0.975以上，说明清洗效果极佳。
本实施例在清洗液精密性的评价：按表1组别4配制清洗液，对清洗液进行分装及样本测试。取AEP的低中高浓度样本，重复测定20次，与对照清洗缓冲液比较变异系数。
表3实施例1清洗液精密度结果
从实验结果来看，从实验结果看，按本实施例配制清洗液，低中高浓度样本重复测定20次后，变异系数皆小于5％。说明本实施例清洗液清洗效果良好。
本实施例在清洗液稳定性的评价：按表1组别4配制清洗液，对清洗液进行分装及样本测试。2-8℃条件下放置0天、3个月、6个月、9个月、12个月、14个月后进行检测。项目选择肌钙蛋白I，用浓度为2ng/mL的样本重复测定10次，观察其变异系数，结果如表4所示。
表4实施例1稳定性检验结果
实施例2
本实施例采用以下配方：10-200mMol/L三羟甲基氨基甲烷；0.01-1wt％脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠；100-300mMol/L氯化钠；0.5-0.1g/L Proclin300；其中：阴离子表面活性剂采用脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠。
本实施例在清洗液清洗效果的验证：按表1中组别6配制清洗液，对清洗液进行分装及样本测试。取10位健康人群的全血样本，一份采用清洗，一份采用对照洗液(0.5％的吐温20磷酸盐缓冲液)，除清洗液外其他试剂均相同，进行测试，项目选择肌钙蛋白I，观察发光强度，进行比较。
样本号
对照
实施例2
1
668
760
2
589
633
3
1056
857
4
814
648
5
730
538
6
621
602
7
884
652
8
557
484
9
619
585
10
863
826
本实施例在清洗液准确性的评价：
按实施例1中表1组6配制清洗液，对清洗液进行分装及样本测试。取50位患者的全血样本进行测试AEP，与对照清洗缓冲液进行相关性比对。
表6实施例2清洗液准确性结果
项目名称
线性回归方程
相关系数
AEP
y＝1.136x+0.127
0.988
从实验结果来看，相关系数达0.975以上，说明清洗效果极佳。
本实施例在清洗液精密性的评价：按表1中组别6配制清洗液，对清洗液进行分装及样本测试。取AEP的低中高浓度样本，重复测定20次，与对照清洗缓冲液比较变异系数。
表7实施例2清洗液精密度结果
从实验结果看，本实施例配制清洗液，低中高浓度样本重复测定20次后，变异系数皆小于5％。说明本实施例洗液清洗效果良好。
本实施例在清洗液稳定性的评价：按表1组别6配制清洗液，对清洗液进行分装及样本测试。2-8℃条件下放置0天、3个月、6个月、9个月、12个月、14个月后进行检测。AEP浓度为2ng/mL的样本重复测定10次，观察其变异系数，结果如表8所示。
表8实施例2稳定性检验结果
实施例3
本实施例采用以下配方：10-200mMol/L三羟甲基氨基甲烷；0.01-1wt％非离子表面活性剂；100-300mMol/L氯化钠；0.5-0.1g/L Proclin300；其中：非离子表面活性剂采用重量比为1:4:5的NP 40、Tween 20和聚氧乙烯十二烷基醚的混合液。
本实施例在清洗液清洗效果的验证：按表1组别10配制清洗液，对清洗液进行分装及样本测试。取10位健康人群的全血样本，一份采用清洗，一份采用对照洗液(0.5％的吐温20磷酸盐缓冲液)，除清洗液外其他试剂均相同，进行测试，项目选择肌钙蛋白I，观察发光强度，进行比较。
本实施例在清洗液准确性的评价：按表1组别10配制清洗液，对清洗液进行分装及样本测试。取50位患者的全血样本进行测试AEP，与对照清洗缓冲液进行相关性比对。取AEP的低中高浓度样本，重复测定20次，与对照试剂比较变异系数。
表9实施例3清洗液准确性结果
项目名称
线性回归方程
相关系数
AEP
y＝1.537x+0.241
0.987
从实验结果来看，相关系数达0.975以上，说明清洗效果极佳。
本实施例在清洗液精密性的评价：按表1组别10配制清洗液，对清洗液进行分装及样本测试。取AEP的低中高浓度样本，重复测定20次，与对照试剂比较变异系数。
表10实施例3清洗液精密度结果
从实验结果看，按本实施例配制清洗液，低中高浓度样本重复测定20次后，变异系数皆小于5％。说明本实施例配制的清洗液清洗效果良好。
本实施例在清洗液稳定性的评价：按表1组别10配制清洗液，对清洗液进行分装及样本测试。2-8℃条件下放置0天、3个月、6个月、9个月、12个月、14个月后进行检测用AEP浓度为2ng/mL的样本重复测定10次，观察其变异系数，结果如表11所示。
表11实施例1稳定性检验结果
综上，以实施例1-3清洗10个健康人的全血样本，其发光强度皆小于1000，与对照试剂相比背景发光影响更低。
从实验数据看，以实施例1-3配制的清洗液在2-8℃条件下保存时间14个月以内时，样本CV值都在5％以内。从试剂状态来看，3种清洗液澄清透明，未出现白色絮状沉淀，说明此3种洗液稳定性好，且精密度高。
上述具体实施可由本领域技术人员在不背离本发明原理和宗旨的前提下以不同的方式对其进行局部调整，本发明的保护范围以权利要求书为准且不由上述具体实施所限，在其范围内的各个实现方案均受本发明之约束。