具体实施方式

本披露部分基于以下发现：CYP4V2从重组腺相关病毒载体(rAAV)(该重组腺相关病毒载体具有选定的启动子、AAV基因组和衣壳血清型的组合)的表达可为例如，CYP4V2基因突变的受试者提供强力且有效的BCD治疗(表1)。因此，本披露提供了指导CYP4V2编码序列向视网膜表达的重组病毒载体，病毒载体组合物、用于产生病毒载体的质粒、向视网膜递送CYP4V2编码序列的方法、在视网膜RPE细胞中表达CYP4V2编码序列的方法、以及此类病毒载体的使用方法。

表1.与BCD相关的CYP4V2突变

除非另外指明，使用携带病毒基因盒的重组质粒、表达细小病毒rep和/或cap序列的包装质粒以及瞬时和稳定转染的包装细胞，可以使用本领域技术人员已知的标准方法来构建重组细小病毒和rAAV载体。此类技术是本领域技术人员已知的。(例如,Sambrook等人,MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL 2nd Ed[分子克隆：实验室手册第2版].(ColdSpring Harbor[冷泉港实验],N.Y.,1989)；Choi等人,CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULARBIOLOGY[分子生物学最新方案](2007))。

当病毒载体表达特定蛋白质或活性时，一种或多种相关基因不必与自然界发现或本文披露的一种或多种相应基因相同。只要该蛋白质是有功能的，就可以根据本发明的一方面使用。本领域技术人员可以通过检测羟化酶活性来容易地确定CYP4V2编码序列是否编码功能性ω-羟化酶。简而言之，将目的蛋白质与脂肪酸和其他必需因子混合，然后孵育以使羟化反应发生。然后，可以通过质谱法测量羟基化的脂肪酸。参见，例如，功能测定，如Nakano等人,在Drug Metab Dispos[药物代谢和处置]37:2119-2122,2009中所述。然而，通常优选与天然蛋白具有非常高的序列同一性。例如，根据本发明的某些实施例，通常应避免大的缺失(例如，大于约50个氨基酸)。因此，熟练的从业人员将理解，本发明的病毒载体序列可不同于本文所述的序列。在一些实施例中，所述病毒核苷酸或氨基酸序列与本文提供的序列具有大于或约80％的同一性，例如，与本文提供的序列具有大于或约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的同一性。

在一些实施例中，序列改变是保守的取代。这种变化包括用异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)和亮氨酸(L)中的任何一种取代这些疏水性氨基酸中的任何其他氨基酸；用天冬氨酸(D)取代谷氨酸(E)，反之亦然；用谷氨酰胺(Q)取代天冬酰胺(N)，反之亦然；用丝氨酸(S)取代苏氨酸(T)，反之亦然。根据特定氨基酸的环境及其在蛋白质三维结构中的作用，其他取代也可以被认为是保守的。例如，甘氨酸(G)和丙氨酸(A)经常可以互换，丙氨酸(A)和缬氨酸(V)也可以互换。相对疏水的蛋氨酸(M)经常可以与亮氨酸和异亮氨酸互换，有时与缬氨酸互换。赖氨酸(K)和精氨酸(R)在氨基酸残基的显著特征是其电荷的位置方面经常互换并且这两个氨基酸残基的pK差异不显著。在特定环境中，其他变化也可以视为“保守”(参见，例如，US 20110201052的表III；第13-15页“Biochemistry”2nd Ed[生物化学第2版].Stryer编辑(斯坦福大学)；Henikoff等人,Proc Natl Acad Sci USA[美国国家科学院院刊]89:10915-10919,1992；Lei等人,J Biol Chem[生物化学杂志]270:11882-11886,1995)。

病毒载体

本发明涉及指导异源基因向视网膜表达的病毒载体。在本发明的某些方面，表达优先定向到视网膜的RPE细胞。本领域技术人员可以将本领域已知的多种病毒载体用于本发明，例如，重组腺相关病毒、重组腺病毒、重组逆转录酶病毒、重组痘病毒、和重组杆状病毒。

特别地，预期本发明的病毒载体可以是重组腺相关(rAAV)载体。AAV是小的单链DNA病毒，需要辅助病毒才能促进有效复制(Muzyczka N和Berns KI(2001)第69章,FieldsVirology[费氏病毒学].Lippincott Williams&Wilkins[威尔金斯出版公司])。病毒载体包含载体基因组和蛋白质衣壳。病毒载体衣壳可以由本领域已知的任何AAV血清型提供，包括目前鉴定的人和非人AAV血清型和尚未鉴定的AAV血清型(参见，例如，Choi等人,CurrGene Ther[当前基因治疗]5:299-310,2005；Schmidt等人,J Virol[病毒学杂志]82:1399-1406,2008；美国专利号9,193,956；9；186；419；8,632,764；8,663,624；8,927,514；8,628,966；8,263,396；8,734,809；8,889,641；8,632,764；8,691,948；8,299,295；8,802,440；8,445,267；8,906,307；8,574,583；8,067,015；7,588,772；7,867,484；8,163,543；8,283,151；8,999,678；7,892,809；7,906,111；7,259,151；7,629,322；7,220,577；8,802,080；7,198,951；8,318,480；8,962,332；7,790,449；7,282,199；8,906,675；8,524,446；7,712,893；6,491,907；8,637,255；7,186,522；7,105,345；6,759,237；6,984,517；6,962,815；7,749,492；7,259,151；和6,156,303；美国公开号2013/0295614；2015/0065562；2014/0364338；2013/0323226；2014/0359799；2013/0059732；2014/0037585；2014/0056854；2013/0296409；2014/03350542013/0195801；2012/0070899；2011/0275529；2011/0171262；2009/0215879；2010/0297177；2010/0203083；2009/0317417；2009/0202490；2012/0220492；2006/0292117；和2004/0002159；欧洲公开号2692731 Al；2383346 Bl；2359865Bl；2359866 Bl；2359867 Bl；和2357010Bl；1791858Bl；1668143Bl；1660678Bl；1664314Bl；1496944Bl；1456383Bl；2341068Bl；2338900Bl；1456419Bl；1310571Bl；1456383Bl；1633772Bl；和1135468Bl；和PCT公开号WO 2014/124282；WO 2013/170078；WO 2014/160092；WO 2014/103957；WO 2014/052789；WO 2013/174760；WO 2013/123503；WO 2011/038187；WO 2008/124015；和WO 2003/054197)。

为了本文披露的目的，AAV是指病毒本身及其衍生物。除非另外指明，否则术语是指所有亚型或血清型以及复制型和重组型。术语“AAV”包括，但不限于，AAV 1型(AAV1)、AAV2型(AAV2)、AAV 3A型(AAV3A)、AAV 3B型(AAV3B)、AAV 4型(AAV4)、AAV 5型(AAV5)、AAV 6型(AAV6)、AAV 7型(AAV7)、AAV 8型(AAV8)、AAV 9型(AAV9)、AAV 10型(AAV 10或AAVrh10)、鸟AAV、牛AAV、犬AAV、山羊AAV、马AAV、灵长类AAV、非灵长类AAV、和绵羊AAV。“灵长类AAV”是指感染灵长类的AAV，“非灵长类AAV”是指感染非灵长类哺乳动物的AAV，“牛AAV”是指感染牛哺乳动物的AAV等。

各种血清型AAV的基因组序列，以及天然反向末端重复(ITR)序列，Rep蛋白和衣壳亚基的序列是本领域已知的。此类序列可以在文献中或在诸如GenBank的公共数据库中找到。参见，例如，GenBank登录号NC_002077.1(AAV1)、AF063497.1(AAV1)、NC_001401.2(AAV2)、AF043303.1(AAV2)、J01901.1(AAV2)、U48704.1(AAV3A)、NC_001729.1(AAV3A)、AF028705.1(AAV3B)、NC.001829.1(AAV4)、U89790.1(AAV4)、NC_006152.1(AA5)、AF085716.1(AAV-5)、AF028704.1(AAV6)、NC 006260.1(AAV7)、AF513851.1(AAV7)、AF513852.1(AAV8)NC 006261.1(AAV8)、AY530579.1(AAV9)、AAT46337(AAV10)、和AAO88208(AAVrh10)；通过引用将其披露内容并入本文以教导AAV核酸和氨基酸序列。还参见，例如，Srivastava等人,J Virol[病毒学杂志].45:555-564,1983；Chiorini等人,J Virol[病毒学杂志]71:6823-6833,1998；Chiorini等人,J Virol[病毒学杂志]73:1309-1319,1999；Bantel-Schaal等人,J Virol[病毒学杂志]73:939-947,1999；Xiao等人,J Virol[病毒学杂志]73:3994-4003,1999；Muramatsu等人,Virology[病毒学]221:208-217,1996；Shade等人,J Virol[病毒学杂志]58:921-936,1986；Gao等人,Proc Natl Acad Sci USA[美国国家科学院院刊]99:11854-11859,2002；PCT公开号WO 00/28061、WO 99/61601、和WO 98/11244；和美国专利号6,156,303。

病毒衣壳可以与其他载体组分混合并匹配以形成杂合假型病毒载体，例如，病毒载体的ITR和衣壳可以来自不同的AAV血清型。在一个方面，ITR可以来自AAV2血清型，而衣壳则来自，例如AAV8、AAV9、AAV2或AAV5血清型。此外，本领域技术人员将认识到，载体衣壳也可以是镶嵌衣壳(例如，由来自不同血清型的衣壳蛋白的混合物组成的衣壳)，甚至是嵌合衣壳(例如，含有外来或无关蛋白质序列(用于产生标志物和/或改变组织嗜性)的衣壳蛋白)。预期本发明的病毒载体可包含AAV8衣壳(例如，SEQ ID NO:24、25、和26，由例如SEQ IDNO:23编码)。还预期本发明的病毒载体可包含AAV9衣壳(例如，SEQ ID NO:28、29、和30，由例如SEQ ID NO:27编码)。还预期本发明的病毒载体可包含AAV2衣壳(例如，SEQ ID NO:32、33、和34，由例如SEQ ID NO:31编码)。进一步预期本发明可以包括AAV5衣壳(例如，SEQ IDNO:36、37、和38，由例如，SEQ ID NO:35编码)。

在一个方面，AAV是一种自我互补的腺相关病毒(scAAV)。

在其他特定方面，载体基因组，例如单链载体基因组，具有大于或约4.1kb且小于或约4.9kb的长度，例如，大于或约4.2kb且小于或约4.9kb、大于或约4.3kb且小于或约4.9kb、大于或约4.4kb且小于或约4.9kb、大于或约4.5kb且小于或约4.9kb、大于或约4.6kb且小于或约4.9kb、大于或约4.7kb且小于或约4.9kb、大于或约4.8kb且小于或约4.9kb、大于或约4.1kb且小于或约4.8kb、大于或约4.1kb且小于或约4.7kb、大于或约4.1kb且小于或约4.6kb、大于或约4.1kb且小于或约4.5kb、大于或约4.1kb且小于或约4.4kb、大于或约4.1kb且小于或约4.3kb、大于或约4.1kb且小于或约4.2kb、大于或约4.2kb且小于或约4.8kb、大于或约4.3kb且小于或约4.7kb、大于或约4.4kb且小于或约4.6kb、约4.1kb、约4.2kb、约4.3kb、约4.4kb、约4.5kb、约4.6kb、约4.7kb、约4.8kb、或约4.9kb。

在某些方面，本发明涉及载体基因组，例如单链载体基因组，所述载体基因组以5’至3’方向包含：(i)5’ITR，(ii)启动子，(iii)重组核苷酸序列，其包含CYP4V2编码序列，(iv)聚腺苷酸化(聚A)信号序列，以及(v)3’ITR。在本发明的某些方面，载体基因组，例如单链载体基因组，以5’至3’方向包含：(i)5’ITR，(ii)启动子，(iii)内含子，(iv)重组核苷酸序列，其包含CYP4V2编码序列，(v)聚A信号序列，以及(vi)3’ITR。在一些实施例中，载体基因组，例如单链载体基因组，以5’至3’方向包含：(i)5’ITR，(ii)启动子，(iii)重组核苷酸序列，其包含CYP4V2编码序列，(iv)调节元件，(v)聚A信号序列，以及(vi)3’ITR。在本发明的某些方面，载体基因组，例如单链载体基因组，以5’至3’方向包含：(i)5’ITR，(ii)启动子，(iii)内含子，(iv)重组核苷酸序列，其包含CYP4V2编码序列，(v)调节元件，(vi)聚A信号序列，以及(vii)3’ITR。载体的元件可以具有与表2中描述的序列具有大于或约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性的序列。

表2.病毒载体元件的核苷酸和氨基酸序列

在一些实施例中，5’和3’ITR分别包含约130至约145个核苷酸。ITR是AAV基因组高效扩增所必需的，这些序列的对称特征使其具有形成发夹的能力，有助于所谓的自引发作用，使第二条DNA链不依赖于引发酶进行合成。预期可以使用AAV 2血清型的5’和3’ITR(例如，分别与SEQ ID NO:1和22具有大于或约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的同一性的核苷酸序列)。在其他方面，如本文所述，来自其他合适血清型的ITR可以选自本领域已知的任何AAV血清型，例如ITR可以来自AAV8、AAV9或AAV5。这些ITR或其他AAV组分可以使用本领域技术人员可以容易地从已知的任何AAV血清型或尚未鉴定的血清型中分离出来，例如，AAV序列可以是合成的，也可以通过参考文献或数据库(例如GenBank、PubMed等)中公开的序列，通过其他合适的方式获得。可替代地，此类AAV组分也可以从学术、商业或公共来源分离或获得(例如，美国标准菌库(American TypeCulture Collection)，马纳萨斯，弗吉尼亚州)。

在一些实施例中，将AAV载体的5’或3’ITR区域突变以形成ΔITR，例如，通过缺失/突变末端解析位点(trs)，并通过形成二聚的反向重复DNA分子，使所得的AAV基因组变成自我互补(sc)。在一个实施例中，ΔITR序列包含SEQ ID NO:54。另外的ΔITR序列是本领域已知的,例如，描述于如Wang等人,在Gene Therapy[基因疗法],2003,10:2105-2111；McCarty等人,Gene Therapy[基因疗法],2003,10:2112-2118；和McCarty等人,Gene Therapy[基因疗法],2001,8:1248-1254，这些文献各自通过引用以其全文并入。

在某些实施例中，所述启动子可以是遍在启动子，例如，CMV启动子、CBA启动子、或CAG启动子。例如，CMV启动子可以具有与SEQ ID NO:2具有大于或约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性的核苷酸序列，CBA启动子可以具有与SEQ ID NO:3具有大于或约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性的核苷酸序列，以及CAG启动子启动子可以具有与SEQ IDNO:4具有大于或约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性的核苷酸序列。可替代地，RPE特异性启动子可用于CYP4V2优先在视网膜的RPE细胞(例如，人RPE细胞)中的靶向表达。RPE特异性启动子的实例包括ProC2启动子、VMD2启动子、CYP4V2启动子和RPE65启动子。例如，所述ProC2启动子可具有与SEQ ID NO:5具有大于或约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性的核苷酸序列。在一个实施例中，所述VMD2启动子可具有与SEQ ID NO:6具有大于或约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施例中，所述CYP4V2启动子可具有与SEQ ID NO:7或其片段(例如，SEQID NO:7的100、200、300、400、500、600、700、800或900个核苷酸的片段)具有大于或约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性的核苷酸序列。在某些实施例中，所述RPE65启动子可具有与SEQ ID NO:8具有大于或约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性的核苷酸序列。

在一些实施例中，AAV载体基因组包含与包含CYP4V2编码序列的重组核苷酸序列可操作连接的启动子，其中所述启动子可以靶向于CYP4V2在视网膜细胞中的表达，例如非人灵长类动物或人视网膜细胞，并且所述启动子选自下表3：

表3.视网膜特异性启动子的核酸序列

上述参考文献中的每一个均通过引用以其全文并入。

在一个实施例中，AAV载体基因组包含与包含CYP4V2编码序列的重组核苷酸序列可操作地连接的启动子，其中所述启动子包含选自由以下组成的组的核酸序列：SEQ IDNO:55-80。所述启动子可以靶向于CYP4V2在视网膜细胞(例如非人灵长类动物或人视网膜细胞)中的表达。

在一些实施例中，载体基因组，例如，单链载体基因组，可能包含内含子序列。例如，所述内含子可以是人类生长激素(hGH)内含子、猿猴病毒40(SV40)内含子、或人类β戈宾内含子，例如，与SEQ ID NO:9、10或11分别具有大于或约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性的核苷酸序列。

在一个实施例中，载体基因组，例如单链载体基因组，包含含有CYP4V2编码序列，例如人CYP4V2编码序列的重组核苷酸序列。CYP4V2编码序列可具有与SEQ ID NO:13、14、39、41、43、45、47、或49具有大于或约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性的核苷酸序列。在一个特定的实施例中，载体基因组包含含有与SEQ ID NO:14具有大于或约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性的CYP4V2编码序列的重组核苷酸序列。

此外，载体基因组，例如，单链载体基因组，可能包括与异源CYP4V2基因可操作地连接的调控元件。调控元件可以包括适当的转录起始、终止和增强子序列，有效的RNA加工信号，例如剪接信号；稳定细胞质mRNA的序列；增强翻译效率的序列；增强蛋白质稳定性的序列；以及当需要时，增强编码产物分泌的序列。许多调节序列是本领域已知的并且可以被利用。本发明的调控元件序列包括表2中描述的那些，例如，乙型肝炎病毒调控元件(HPRE)和土拨鼠肝炎病毒调控元件(WPRE)，其可以具有分别与SEQ ID NO:16和17具有大于或约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性的核苷酸序列。

在一个实施例中，载体基因组，例如，单链载体基因组，包含聚A信号序列。本发明的聚A信号序列包括表2中所述的序列，例如，牛生长激素(bGH)聚A信号序列和猿猴病毒40(SV40)聚A信号序列，其可以具有分别与SEQ ID NO:18和19具有大于或约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性的核苷酸序列。在一个特定的实施例中，载体基因组包含bGH聚A信号序列，其可具有与SEQ ID NO:18具有大于或约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性的核苷酸序列。

因此，在一个方面，本发明涉及载体基因组，例如单链载体基因组，所述载体基因组以5’至3’方向包含：(i)5’ITR(例如，SEQ ID NO:1)，(ii)启动子(例如，SEQ ID NO:2、3、4、5、6、7、或8)，(iii)重组核苷酸序列，其包含CYP4V2编码序列(例如，SEQ ID NO:13、14、39、41、43、45、47、或49)，(iv)聚A信号序列(例如，SEQ ID NO:18或19)，以及(v)3’ITR(例如，SEQ ID NO:22)。在本发明的某些方面，载体基因组，例如单链载体基因组，以5’至3’方向包含：(i)5’ITR(例如，SEQ ID NO:1)，(ii)启动子(例如，SEQ ID NO:2、3、4、5、6、7、或8)，(iii)内含子(例如，SEQ ID NO:9、10、或11)，(iv)重组核苷酸序列，其包含CYP4V2编码序列(例如，SEQ ID NO:13、14、39、41、43、45、47、或49)，(v)聚A信号序列(例如，SEQ ID NO:18或19)，以及(vi)3’ITR(例如，SEQ ID NO:22)。在一些实施例中，载体基因组，例如单链载体基因组，以5’至3’方向包含：(i)5’ITR(例如，SEQ ID NO:1)，(ii)启动子(例如，SEQ ID NO:2、3、4、5、6、7、或8)，(iii)重组核苷酸序列，其包含CYP4V2编码序列(例如，SEQ ID NO:13、14、39、41、43、45、47、或49)，(iv)调节元件(例如，SEQ ID NO:16或17)，(v)聚A信号序列(例如，SEQ ID NO:18或19)，以及(vi)3’ITR(例如，SEQ ID NO:22)。在本发明的某些方面，载体基因组，例如单链载体基因组，以5’至3’方向包含：(i)5’ITR(例如，SEQ ID NO:1)，(ii)启动子(例如，SEQ ID NO:2、3、4、5、6、7、或8)，(iii)内含子(例如，SEQ ID NO:9、10、或11)，(iv)重组核苷酸序列，其包含CYP4V2编码序列(例如，SEQ ID NO:13、14、39、41、43、45、47、或49)，(v)调节元件(例如，SEQ ID NO:15或17)，(vi)聚A信号序列(例如，SEQ ID NO:18或19)，以及(vii)3’ITR(例如，SEQ ID NO:22)。

在一些实施例中，载体基因组，例如，单链载体基因组，可能进一步包含填充多核苷酸序列。填充多核苷酸序列可以在载体序列中位于任何期望的位置，以使得它不会阻止载体的功能或活性。在一个方面，填充多核苷酸序列位于聚A信号序列和3’ITR之间。通常，填充多核苷酸序列是惰性的或无害的且没有功能或活性。在各个特定方面，填充多核苷酸序列不是细菌多核苷酸序列；填充多核苷酸序列不是编码蛋白质或肽的序列；且所述填充多核苷酸序列不同于ITR序列、启动子、包含CYP4V2编码序列的重组核苷酸序列和聚A信号序列。在一些实施例中，所述填充序列可以是与SEQ ID NO:20或21具有大于或约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性的核苷酸序列。在其他各个方面，填充多核苷酸序列的长度在约1-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-75、75-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-400、400-500、500-750、750-1,000、1,000-1,500、1,500-2,000、2,000-2,500、或2,500-3,000个核苷酸之间。

因此，在某些实施例中，载体基因组，例如单链载体基因组，以5’至3’方向包含：(i)5’ITR(例如，SEQ ID NO:1)，(ii)启动子(例如，SEQ ID NO:2、3、4、5、6、7、或8)，(iii)重组核苷酸序列，其包含CYP4V2编码序列(例如，SEQ ID NO:13、14、39、41、43、45、47、或49)，(iv)聚A信号序列(例如，SEQ ID NO:18或19)，(v)填充序列(例如，SEQ ID NO:20或21)，以及(vi)3’ITR(例如，SEQ ID NO:22)。在本发明的某些方面，载体基因组，例如单链载体基因组，以5’至3’方向包含：(i)5’ITR(例如，SEQ ID NO:1)，(ii)启动子(例如，SEQ ID NO:2、3、4、5、6、7、或8)，(iii)内含子(例如，SEQ ID NO:9、10、或11)，(iv)重组核苷酸序列，其包含CYP4V2编码序列(例如，SEQ ID NO:13、14、39、41、43、45、47、或49)，(v)聚A信号序列(例如，SEQ ID NO:18或19)，(vi)填充序列(例如，SEQ ID NO:20或21)，以及(vii)3’ITR(例如，SEQID NO:22)。在一些实施例中，载体基因组，例如单链载体基因组，以5’至3’方向包含：(i)5’ITR(例如，SEQ ID NO:1)，(ii)启动子(例如，SEQ ID NO:2、3、4、5、6、7、或8)，(iii)重组核苷酸序列，其包含CYP4V2编码序列(例如，SEQ ID NO:13、14、39、41、43、45、47、或49)，(iv)调节元件(例如，SEQ ID NO:16或17)，(v)聚A信号序列(例如，SEQ ID NO:18或19)，(vi)填充序列(例如，SEQ ID NO:20或21)以及(vii)3’ITR(例如，SEQ ID NO:22)。在本发明的某些方面，载体基因组，例如单链载体基因组，以5’至3’方向包含：(i)5’ITR(例如，SEQ ID NO:1)，(ii)启动子(例如，SEQ ID NO:2、3、4、5、6、7、或8)，(iii)内含子(例如，SEQ ID NO:9、10、或11)，(iv)重组核苷酸序列，其包含CYP4V2编码序列(例如，SEQ ID NO:13、14、39、41、43、45、47、或49)，(v)调节元件(例如，SEQ ID NO:16或17)，(vi)聚A信号序列(例如，SEQ IDNO:18或19)，(vii)填充序列(例如，SEQ ID NO:20或21)，以及(viii)3’ITR(例如，SEQ IDNO:22)。

在一些实施例中，载体基因组，例如，单链载体基因组，可能还包含科扎克序列。科扎克序列是在真核mRNA上出现的序列，具有共有的(gcc)gccRccAUGG序列，并在翻译过程的启动中起作用。科扎克序列可以位于紧靠包含CYP4V2编码序列的重组核苷酸序列的上游。在一些实施例中，所述科扎克序列是GCCACC(SEQ ID NO:12)。可替代地，所述载体基因组，例如单链载体基因组，包含GCCGCC(SEQ ID NO:51)、GACACC(SEQ ID NO:52)、或GCCACG(SEQID NO:53)的科扎克序列。

在本发明的某些方面，病毒载体包含AAV8衣壳，所述衣壳包含VP1、VP2和VP3氨基酸序列，分别与SEQ ID NO:24、25和26具有大于或约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的同一性，由例如与SEQ ID NO:23具有大于或约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性的核苷酸序列和以5’至3’方向包含与以下核苷酸序列组之一具有大于或约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性的核苷酸序列的载体基因组编码：

i)SEQ ID NO:1、2、13、18和22；

ii)SEQ ID NO:1、3、13、18和22；

iii)SEQ ID NO:1、4、13、18和22；

iv)SEQ ID NO:1、5、13、18和22；

v)SEQ ID NO:1、6、13、18和22；

vi)SEQ ID NO:1、7、13、18和22；

vii)SEQ ID NO:1、8、13、18和22；

viii)SEQ ID NO:1、2、14、18和22；

ix)SEQ ID NO:1、3、14、18和22；

x)SEQ ID NO:1、4、14、18和22；

xi)SEQ ID NO:1、5、14、18和22；

xii)SEQ ID NO:1、6、14、18和22；

xiii)SEQ ID NO:1、7、14、18和22；

xiv)SEQ ID NO:1、8、14、18和22；

xv)SEQ ID NO:1、2、13、19和22；

xvi)SEQ ID NO:1、3、13、19和22；

xvii)SEQ ID NO:1、4、13、19和22；

xviii)SEQ ID NO:1、5、13、19和22；

xix)SEQ ID NO:1、6、13、19和22；

xx)SEQ ID NO:1、7、13、19和22；

xxi)SEQ ID NO:1、8、13、19和22；

xxii)SEQ ID NO:1、2、14、19和22；

xxiii)SEQ ID NO:1、3、14、19和22；

xxiv)SEQ ID NO:1、4、14、19和22；

xxv)SEQ ID NO:1、5、14、19和22；

xxvi)SEQ ID NO:1、6、14、19和22；

xxvii)SEQ ID NO:1、7、14、19和22；

xxviii)SEQ ID NO:1、8、14、19和22；

xxix)SEQ ID NO:1、2、9、13、18和22；

xxx)SEQ ID NO:1、3、9、13、18和22；

xxxi)SEQ ID NO:1、4、9、13、18和22；

xxxii)SEQ ID NO:1、5、9、13、18和22；

xxxiii)SEQ ID NO:1、6、9、13、18和22；

xxxiv)SEQ ID NO:1、7、9、13、18和22；

xxxv)SEQ ID NO:1、8、9、13、18和22；

xxxvi)SEQ ID NO:1、2、9、14、18和22；

xxxvii)SEQ ID NO:1、3、9、14、18和22；

xxxviii)SEQ ID NO:1、4、9、14、18和22；

xxxix)SEQ ID NO:1、5、9、14、18和22；

xl)SEQ ID NO:1、6、9、14、18和22；

xli)SEQ ID NO:1、7、9、14、18和22；

xlii)SEQ ID NO:1、8、9、14、18和22；

xliii)SEQ ID NO:1、2、9、13、19和22；

xliv)SEQ ID NO:1、3、9、13、19和22；

xlv)SEQ ID NO:1、4、9、13、19和22；

xlvi)SEQ ID NO:1、5、9、13、19和22；

xlvii)SEQ ID NO:1、6、9、13、19和22；

xlviii)SEQ ID NO:1、7、9、13、19和22；

xlix)SEQ ID NO:1、8、9、13、19和22；

l)SEQ ID NO:1、2、9、14、19和22；

li)SEQ ID NO:1、3、9、14、19和22；

lii)SEQ ID NO:1、4、9、14、19和22；

liii)SEQ ID NO:1、5、9、14、19和22；

liv)SEQ ID NO:1、6、9、14、19和22；

lv)SEQ ID NO:1、7、9、14、19和22；

lvi)SEQ ID NO:1、8、9、14、19和22；

lvii)SEQ ID NO:1、2、13、16、18和22；

lviii)SEQ ID NO:1、3、13、16、18和22；

lix)SEQ ID NO:1、4、13、16、18和22；

lx)SEQ ID NO:1、5、13、16、18和22；

lxi)SEQ ID NO:1、6、13、16、18和22；

lxii)SEQ ID NO:1、7、13、16、18和22；

lxiii)SEQ ID NO:1、8、13、16、18和22；

lxiv)SEQ ID NO:1、2、14、16、18和22；

lxv)SEQ ID NO:1、3、14、16、18和22；

lxvi)SEQ ID NO:1、4、14、16、18和22；

lxvii)SEQ ID NO:1、5、14、16、18和22；

lxviii)SEQ ID NO:1、6、14、16、18和22；

lxix)SEQ ID NO:1、7、14、16、18和22；

lxx)SEQ ID NO:1、8、14、16、18和22；

lxxi)SEQ ID NO:1、2、13、16、19和22；

lxxii)SEQ ID NO:1、3、13、16、19和22；

lxxiii)SEQ ID NO:1、4、13、16、19和22；

lxxiv)SEQ ID NO:1、5、13、16、19和22；

lxxv)SEQ ID NO:1、6、13、16、19和22；

lxxvi)SEQ ID NO:1、7、13、16、19和22；

lxxvii)SEQ ID NO:1、8、13、16、19和22；

lxxviii)SEQ ID NO:1、2、14、16、19和22；

lxxix)SEQ ID NO:1、3、14、16、19和22；

lxxx)SEQ ID NO:1、4、14、16、19和22；

lxxxi)SEQ ID NO:1、5、14、16、19和22；

lxxxii)SEQ ID NO:1、6、14、16、19和22；

lxxxiii)SEQ ID NO:1、7、14、16、19和22；

lxxxiv)SEQ ID NO:1、8、14、16、19和22；

lxxxv)SEQ ID NO:1、2、9、13、16、18和22；

lxxxvi)SEQ ID NO:1、3、9、13、16、18和22；

lxxxvii)SEQ ID NO:1、4、9、13、16、18和22；

lxxxviii)SEQ ID NO:1、5、9、13、16、18和22；

lxxxix)SEQ ID NO:1、6、9、13、16、18和22；

xc)SEQ ID NO:1、7、9、13、16、18和22；

xci)SEQ ID NO:1、8、9、13、16、18和22；

xcii)SEQ ID NO:1、2、9、14、16、18和22；

xciii)SEQ ID NO:1、3、9、14、16、18和22；

xciv)SEQ ID NO:1、4、9、14、16、18和22；

xcv)SEQ ID NO:1、5、9、14、16、18和22；

xcvi)SEQ ID NO:1、6、9、14、16、18和22；

xcvii)SEQ ID NO:1、7、9、14、16、18和22；

xcviii)SEQ ID NO:1、8、9、14、16、18和22；

xcix)SEQ ID NO:1、2、9、13、16、19和22；

c)SEQ ID NO:1、3、9、13、16、19和22；

ci)SEQ ID NO:1、4、9、13、16、19和22；

cii)SEQ ID NO:1、5、9、13、16、19和22；

ciii)SEQ ID NO:1、6、9、13、16、19和22；

civ)SEQ ID NO:1、7、9、13、16、19和22；

cv)SEQ ID NO:1、8、9、13、16、19和22；

cvi)SEQ ID NO:1、2、9、14、16、19和22；

cvii)SEQ ID NO:1、3、9、14、16、19和22；

cviii)SEQ ID NO:1、4、9、14、16、19和22；

cix)SEQ ID NO:1、5、9、14、16、19和22；

cx)SEQ ID NO:1、6、9、14、16、19和22；

cxi)SEQ ID NO:1、7、9、14、16、19和22；以及

cxii)SEQ ID NO:1、8、9、14、16、19和22。

在一些实施例中，所述载体基因组以5’至3’方向包含与以下具有大于或约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性的核苷酸序列：SEQ ID NO:1、5、14、18和22；SEQ ID NO:1、5、9、14、18和22；SEQ ID NO:1、5、14、16、18和22；或SEQ ID NO:1、5、9、14、16、18和22。在某些实施例中，所述AAV8衣壳可以包含衣壳蛋白VP1、VP2和/或VP3的亚组合。

预期本发明的病毒载体可以包含AAV9衣壳，所述衣壳包含VP1、VP2和VP3氨基酸序列，分别与SEQ ID NO:28、29和30具有大于或约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的同一性，由例如与SEQ ID NO:27具有大于或约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性的核苷酸序列和以5’至3’方向包含与以下核苷酸序列组之一具有大于或约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性的核苷酸序列的载体基因组编码：

i)SEQ ID NO:1、2、13、18和22；

ii)SEQ ID NO:1、3、13、18和22；

iii)SEQ ID NO:1、4、13、18和22；

iv)SEQ ID NO:1、5、13、18和22；

v)SEQ ID NO:1、6、13、18和22；

vi)SEQ ID NO:1、7、13、18和22；

vii)SEQ ID NO:1、8、13、18和22；

viii)SEQ ID NO:1、2、14、18和22；

ix)SEQ ID NO:1、3、14、18和22；

x)SEQ ID NO:1、4、14、18和22；

xi)SEQ ID NO:1、5、14、18和22；

xii)SEQ ID NO:1、6、14、18和22；

xiii)SEQ ID NO:1、7、14、18和22；

xiv)SEQ ID NO:1、8、14、18和22；

xv)SEQ ID NO:1、2、13、19和22；

xvi)SEQ ID NO:1、3、13、19和22；

xvii)SEQ ID NO:1、4、13、19和22；

xviii)SEQ ID NO:1、5、13、19和22；

xix)SEQ ID NO:1、6、13、19和22；

xx)SEQ ID NO:1、7、13、19和22；

xxi)SEQ ID NO:1、8、13、19和22；

xxii)SEQ ID NO:1、2、14、19和22；

xxiii)SEQ ID NO:1、3、14、19和22；

xxiv)SEQ ID NO:1、4、14、19和22；

xxv)SEQ ID NO:1、5、14、19和22；

xxvi)SEQ ID NO:1、6、14、19和22；

xxvii)SEQ ID NO:1、7、14、19和22；

xxviii)SEQ ID NO:1、8、14、19和22；

xxix)SEQ ID NO:1、2、9、13、18和22；

xxx)SEQ ID NO:1、3、9、13、18和22；

xxxi)SEQ ID NO:1、4、9、13、18和22；

xxxii)SEQ ID NO:1、5、9、13、18和22；

xxxiii)SEQ ID NO:1、6、9、13、18和22；

xxxiv)SEQ ID NO:1、7、9、13、18和22；

xxxv)SEQ ID NO:1、8、9、13、18和22；

xxxvi)SEQ ID NO:1、2、9、14、18和22；

xxxvii)SEQ ID NO:1、3、9、14、18和22；

xxxviii)SEQ ID NO:1、4、9、14、18和22；

xxxix)SEQ ID NO:1、5、9、14、18和22；

xl)SEQ ID NO:1、6、9、14、18和22；

xli)SEQ ID NO:1、7、9、14、18和22；

xlii)SEQ ID NO:1、8、9、14、18和22；

xliii)SEQ ID NO:1、2、9、13、19和22；

xliv)SEQ ID NO:1、3、9、13、19和22；

xlv)SEQ ID NO:1、4、9、13、19和22；

xlvi)SEQ ID NO:1、5、9、13、19和22；

xlvii)SEQ ID NO:1、6、9、13、19和22；

xlviii)SEQ ID NO:1、7、9、13、19和22；

xlix)SEQ ID NO:1、8、9、13、19和22；

l)SEQ ID NO:1、2、9、14、19和22；

li)SEQ ID NO:1、3、9、14、19和22；

lii)SEQ ID NO:1、4、9、14、19和22；

liii)SEQ ID NO:1、5、9、14、19和22；

liv)SEQ ID NO:1、6、9、14、19和22；

lv)SEQ ID NO:1、7、9、14、19和22；

lvi)SEQ ID NO:1、8、9、14、19和22；

lvii)SEQ ID NO:1、2、13、16、18和22；

lviii)SEQ ID NO:1、3、13、16、18和22；

lix)SEQ ID NO:1、4、13、16、18和22；

lx)SEQ ID NO:1、5、13、16、18和22；

lxi)SEQ ID NO:1、6、13、16、18和22；

lxii)SEQ ID NO:1、7、13、16、18和22；

lxiii)SEQ ID NO:1、8、13、16、18和22；

lxiv)SEQ ID NO:1、2、14、16、18和22；

lxv)SEQ ID NO:1、3、14、16、18和22；

lxvi)SEQ ID NO:1、4、14、16、18和22；

lxvii)SEQ ID NO:1、5、14、16、18和22；

lxviii)SEQ ID NO:1、6、14、16、18和22；

lxix)SEQ ID NO:1、7、14、16、18和22；

lxx)SEQ ID NO:1、8、14、16、18和22；

lxxi)SEQ ID NO:1、2、13、16、19和22；

lxxii)SEQ ID NO:1、3、13、16、19和22；

lxxiii)SEQ ID NO:1、4、13、16、19和22；

lxxiv)SEQ ID NO:1、5、13、16、19和22；

lxxv)SEQ ID NO:1、6、13、16、19和22；

lxxvi)SEQ ID NO:1、7、13、16、19和22；

lxxvii)SEQ ID NO:1、8、13、16、19和22；

lxxviii)SEQ ID NO:1、2、14、16、19和22；

lxxix)SEQ ID NO:1、3、14、16、19和22；

lxxx)SEQ ID NO:1、4、14、16、19和22；

lxxxi)SEQ ID NO:1、5、14、16、19和22；

lxxxii)SEQ ID NO:1、6、14、16、19和22；

lxxxiii)SEQ ID NO:1、7、14、16、19和22；

lxxxiv)SEQ ID NO:1、8、14、16、19和22；

lxxxv)SEQ ID NO:1、2、9、13、16、18和22；

lxxxvi)SEQ ID NO:1、3、9、13、16、18和22；

lxxxvii)SEQ ID NO:1、4、9、13、16、18和22；

lxxxviii)SEQ ID NO:1、5、9、13、16、18和22；

lxxxix)SEQ ID NO:1、6、9、13、16、18和22；

xc)SEQ ID NO:1、7、9、13、16、18和22；

xci)SEQ ID NO:1、8、9、13、16、18和22；

xcii)SEQ ID NO:1、2、9、14、16、18和22；

xciii)SEQ ID NO:1、3、9、14、16、18和22；

xciv)SEQ ID NO:1、4、9、14、16、18和22；

xcv)SEQ ID NO:1、5、9、14、16、18和22；

xcvi)SEQ ID NO:1、6、9、14、16、18和22；

xcvii)SEQ ID NO:1、7、9、14、16、18和22；

xcviii)SEQ ID NO:1、8、9、14、16、18和22；

xcix)SEQ ID NO:1、2、9、13、16、19和22；

c)SEQ ID NO:1、3、9、13、16、19和22；

ci)SEQ ID NO:1、4、9、13、16、19和22；

cii)SEQ ID NO:1、5、9、13、16、19和22；

ciii)SEQ ID NO:1、6、9、13、16、19和22；

civ)SEQ ID NO:1、7、9、13、16、19和22；

cv)SEQ ID NO:1、8、9、13、16、19和22；

cvi)SEQ ID NO:1、2、9、14、16、19和22；

cvii)SEQ ID NO:1、3、9、14、16、19和22；

cviii)SEQ ID NO:1、4、9、14、16、19和22；

cix)SEQ ID NO:1、5、9、14、16、19和22；

cx)SEQ ID NO:1、6、9、14、16、19和22；

cxi)SEQ ID NO:1、7、9、14、16、19和22；以及

cxii)SEQ ID NO:1、8、9、14、16、19和22。

在一些实施例中，所述载体基因组以5’至3’方向包含与以下具有大于或约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性的核苷酸序列：SEQ ID NO:1、5、14、18和22；SEQ ID NO:1、5、9、14、18和22；SEQ ID NO:1、5、14、16、18和22；或SEQ ID NO:1、5、9、14、16、18和22。在某些实施例中，所述AAV9衣壳可以包含衣壳蛋白VP1、VP2和/或VP3的亚组合。

在本发明的某些方面，病毒载体包含AAV2衣壳，所述衣壳包含VP1、VP2和VP3氨基酸序列，分别与SEQ ID NO:32、33和34具有大于或约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的同一性，由例如与SEQ ID NO:31具有大于或约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性的核苷酸序列和以5’至3’方向包含与以下核苷酸序列组之一具有大于或约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性的核苷酸序列的载体基因组编码：

i)SEQ ID NO:1、2、13、18和22；

ii)SEQ ID NO:1、3、13、18和22；

iii)SEQ ID NO:1、4、13、18和22；

iv)SEQ ID NO:1、5、13、18和22；

v)SEQ ID NO:1、6、13、18和22；

vi)SEQ ID NO:1、7、13、18和22；

vii)SEQ ID NO:1、8、13、18和22；

viii)SEQ ID NO:1、2、14、18和22；

ix)SEQ ID NO:1、3、14、18和22；

x)SEQ ID NO:1、4、14、18和22；

xi)SEQ ID NO:1、5、14、18和22；

xii)SEQ ID NO:1、6、14、18和22；

xiii)SEQ ID NO:1、7、14、18和22；

xiv)SEQ ID NO:1、8、14、18和22；

xv)SEQ ID NO:1、2、13、19和22；

xvi)SEQ ID NO:1、3、13、19和22；

xvii)SEQ ID NO:1、4、13、19和22；

xviii)SEQ ID NO:1、5、13、19和22；

xix)SEQ ID NO:1、6、13、19和22；

xx)SEQ ID NO:1、7、13、19和22；

xxi)SEQ ID NO:1、8、13、19和22；

xxii)SEQ ID NO:1、2、14、19和22；

xxiii)SEQ ID NO:1、3、14、19和22；

xxiv)SEQ ID NO:1、4、14、19和22；

xxv)SEQ ID NO:1、5、14、19和22；

xxvi)SEQ ID NO:1、6、14、19和22；

xxvii)SEQ ID NO:1、7、14、19和22；

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xliii)SEQ ID NO:1、2、9、13、19和22；

xliv)SEQ ID NO:1、3、9、13、19和22；

xlv)SEQ ID NO:1、4、9、13、19和22；

xlvi)SEQ ID NO:1、5、9、13、19和22；

xlvii)SEQ ID NO:1、6、9、13、19和22；

xlviii)SEQ ID NO:1、7、9、13、19和22；

xlix)SEQ ID NO:1、8、9、13、19和22；

l)SEQ ID NO:1、2、9、14、19和22；

li)SEQ ID NO:1、3、9、14、19和22；

lii)SEQ ID NO:1、4、9、14、19和22；

liii)SEQ ID NO:1、5、9、14、19和22；

liv)SEQ ID NO:1、6、9、14、19和22；

lv)SEQ ID NO:1、7、9、14、19和22；

lvi)SEQ ID NO:1、8、9、14、19和22；

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lix)SEQ ID NO:1、4、13、16、18和22；

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lxx)SEQ ID NO:1、8、14、16、18和22；

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lxxiv)SEQ ID NO:1、5、13、16、19和22；

lxxv)SEQ ID NO:1、6、13、16、19和22；

lxxvi)SEQ ID NO:1、7、13、16、19和22；

lxxvii)SEQ ID NO:1、8、13、16、19和22；

lxxviii)SEQ ID NO:1、2、14、16、19和22；

lxxix)SEQ ID NO:1、3、14、16、19和22；

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lxxxi)SEQ ID NO:1、5、14、16、19和22；

lxxxii)SEQ ID NO:1、6、14、16、19和22；

lxxxiii)SEQ ID NO:1、7、14、16、19和22；

lxxxiv)SEQ ID NO:1、8、14、16、19和22；

lxxxv)SEQ ID NO:1、2、9、13、16、18和22；

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lxxxvii)SEQ ID NO:1、4、9、13、16、18和22；

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xci)SEQ ID NO:1、8、9、13、16、18和22；

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xcvi)SEQ ID NO:1、6、9、14、16、18和22；

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xcviii)SEQ ID NO:1、8、9、14、16、18和22；

xcix)SEQ ID NO:1、2、9、13、16、19和22；

c)SEQ ID NO:1、3、9、13、16、19和22；

ci)SEQ ID NO:1、4、9、13、16、19和22；

cii)SEQ ID NO:1、5、9、13、16、19和22；

ciii)SEQ ID NO:1、6、9、13、16、19和22；

civ)SEQ ID NO:1、7、9、13、16、19和22；

cv)SEQ ID NO:1、8、9、13、16、19和22；

cvi)SEQ ID NO:1、2、9、14、16、19和22；

cvii)SEQ ID NO:1、3、9、14、16、19和22；

cviii)SEQ ID NO:1、4、9、14、16、19和22；

cix)SEQ ID NO:1、5、9、14、16、19和22；

cx)SEQ ID NO:1、6、9、14、16、19和22；

cxi)SEQ ID NO:1、7、9、14、16、19和22；以及

cxii)SEQ ID NO:1、8、9、14、16、19和22。

在一些实施例中，所述载体基因组以5’至3’方向包含与以下具有大于或约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性的核苷酸序列：SEQ ID NO:1、5、14、18和22；SEQ ID NO:1、5、9、14、18和22；SEQ ID NO:1、5、14、16、18和22；或SEQ ID NO:1、5、9、14、16、18和22。在某些实施例中，所述AAV2衣壳可以包含衣壳蛋白VP1、VP2和/或VP3的亚组合。

在本发明的某些方面，病毒载体包含AAV5衣壳，所述衣壳包含VP1、VP2和VP3氨基酸序列，分别与SEQ ID NO:36、37和38具有大于或约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的同一性，由例如与SEQ ID NO:35具有大于或约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性的核苷酸序列和以5’至3’方向包含与以下核苷酸序列组之一具有大于或约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性的核苷酸序列的载体基因组编码：

i)SEQ ID NO:1、2、13、18和22；

ii)SEQ ID NO:1、3、13、18和22；

iii)SEQ ID NO:1、4、13、18和22；

iv)SEQ ID NO:1、5、13、18和22；

v)SEQ ID NO:1、6、13、18和22；

vi)SEQ ID NO:1、7、13、18和22；

vii)SEQ ID NO:1、8、13、18和22；

viii)SEQ ID NO:1、2、14、18和22；

ix)SEQ ID NO:1、3、14、18和22；

x)SEQ ID NO:1、4、14、18和22；

xi)SEQ ID NO:1、5、14、18和22；

xii)SEQ ID NO:1、6、14、18和22；

xiii)SEQ ID NO:1、7、14、18和22；

xiv)SEQ ID NO:1、8、14、18和22；

xv)SEQ ID NO:1、2、13、19和22；

xvi)SEQ ID NO:1、3、13、19和22；

xvii)SEQ ID NO:1、4、13、19和22；

xviii)SEQ ID NO:1、5、13、19和22；

xix)SEQ ID NO:1、6、13、19和22；

xx)SEQ ID NO:1、7、13、19和22；

xxi)SEQ ID NO:1、8、13、19和22；

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xxiii)SEQ ID NO:1、3、14、19和22；

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xxvi)SEQ ID NO:1、6、14、19和22；

xxvii)SEQ ID NO:1、7、14、19和22；

xxviii)SEQ ID NO:1、8、14、19和22；

xxix)SEQ ID NO:1、2、9、13、18和22；

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xxxi)SEQ ID NO:1、4、9、13、18和22；

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lxxvi)SEQ ID NO:1、7、13、16、19和22；

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xcv)SEQ ID NO:1、5、9、14、16、18和22；

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ci)SEQ ID NO:1、4、9、13、16、19和22；

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civ)SEQ ID NO:1、7、9、13、16、19和22；

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cvi)SEQ ID NO:1、2、9、14、16、19和22；

cvii)SEQ ID NO:1、3、9、14、16、19和22；

cviii)SEQ ID NO:1、4、9、14、16、19和22；

cix)SEQ ID NO:1、5、9、14、16、19和22；

cx)SEQ ID NO:1、6、9、14、16、19和22；

cxi)SEQ ID NO:1、7、9、14、16、19和22；以及

cxii)SEQ ID NO:1、8、9、14、16、19和22。

在一些实施例中，所述载体基因组以5’至3’方向包含与以下具有大于或约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性的核苷酸序列：SEQ ID NO:1、5、14、18和22；SEQ ID NO:1、5、9、14、18和22；SEQ ID NO:1、5、14、16、18和22；或SEQ ID NO:1、5、9、14、16、18和22。在某些实施例中，所述AAV5衣壳可以包含衣壳蛋白VP1、VP2和/或VP3的亚组合。

用于产生病毒载体的方法是本领域熟知的并且将允许技术人员产生本发明的病毒载体(参见，例如，美国专利号7,465,583)，包括表4中所述的病毒载体。通常，产生rAAV载体的方法适用于产生本发明的病毒载体；这些方法之间的主要区别是要包装的遗传元件的结构。为了产生根据本发明的病毒载体，表2中描述的遗传元件的序列可以用于产生衣壳化的病毒基因组。

表2中描述的遗传元件是在环状质粒或病毒基因组(例如，单链或自身互补的病毒基因组)的背景下，但是本领域技术人员将理解，DNA底物可以以本领域已知的任何形式提供，包括但不限于质粒、裸DNA载体、细菌人工染色体(BAC)、酵母菌人工染色体(YAC)或病毒载体(例如，腺病毒、疱疹病毒、Epstein-Barr病毒、AAV、杆状病毒、逆转录病毒载体等)。可替代地，表2中的产生本文所述病毒载体所必需的遗传元件可以稳定地掺入包装细胞的基因组中。

可以通过本领域已知的任何方法来产生根据本发明的病毒载体颗粒，例如，通过将要复制和包装的序列引入允许细胞或包装细胞中，如那些术语在本领域中理解的那样(例如，病毒可以感染或转导“允许”细胞；“包装”细胞是提供辅助功能的稳定转化的细胞)。

在一个实施例中，提供了一种用于产生CYP4V2病毒载体的方法，其中所述方法包括向允许细小病毒复制的细胞提供：(a)含有用于产生本发明的载体基因组的遗传元件的核苷酸序列(如下面和表2中详细描述的)；(b)足以用于(a)中的载体基因组序列的复制以产生载体基因组的核苷酸序列；(c)在足以使包含载体基因组的病毒载体在有待在细胞中产生的细小病毒衣壳内衣壳化的条件下，足以将载体基因组包装入细小病毒衣壳的核苷酸序列。优选地，细小病毒复制和/或衣壳编码序列是AAV序列。

可以采用将携带下述基因盒的核苷酸序列引入细胞宿主进行复制和包装的任何方法，包括但不限于，电穿孔、磷酸钙沉淀、线性聚乙烯亚胺聚合物沉淀、显微镜下注射、阳离子或阴离子脂质体、和脂质体结合核定位信号。

本文所述的病毒载体可以使用本领域已知的方法产生，例如，三重转染或杆状病毒介导的病毒产生。可以采用本领域已知的任何合适的允许细胞或包装细胞来产生载体。优选哺乳动物细胞。还优选是反式互补包装细胞系，其提供从复制缺陷性辅助病毒中缺失的功能，例如，293细胞或其他E1a反式互补细胞。还优选本领域已知的DNA修复缺陷的哺乳动物细胞或细胞系，因为这些细胞系在校正引入本文所述的质粒中的突变的能力上将受到损害。

基因盒可以包含细小病毒(例如，AAV)帽和rep基因的一些或全部。优选地，然而，通过将编码衣壳和/或Rep蛋白的一种或多种包装载体引入细胞中，反式提供了一些或全部的帽和rep功能。最优选地，基因盒不编码衣壳或Rep蛋白。可替代地，使用包装细胞系，其被稳定转化以表达cap和/或rep基因(参见，例如，Gao等人,Hum Gene Ther[人类基因治疗]9:2353-2362,1998；Inoue等人,J Virol[病毒学杂志]72:7024-7031,1998；美国专利号5,837,484；WO 98/27207；美国专利号5,658,785；WO 96/17947)。

此外，优选为病毒载体提供辅助病毒功能，以传播新的病毒颗粒。腺病毒和单纯疱疹病毒均可作为AAV的辅助病毒。参见，例如，Bernard N.Fields等人,VIROLOGY[病毒学],第2卷,第69章(第3版,Lippincott-Raven Publishers[Lippincott-Raven出版社])。示例性辅助病毒包括但不限于单纯疱疹(HSV)水痘带状疱疹、巨细胞病毒和Epstein-Barr病毒。感染复数(MOI)和感染的持续时间将取决于所用病毒的类型和所使用的包装细胞系。可以采用任何合适的辅助载体。优选地，辅助载体为质粒，例如，描述于Xiao等人,J Virol[病毒学杂志]72:2224,1998。如上所述，可以通过本领域已知的任何合适方法将载体引入包装细胞。

可以通过本领域已知的任何方法获得不含污染性辅助病毒的载体储备液。例如，重组单链或自身互补病毒和辅助病毒可根据大小容易地区分。还可以根据对肝素底物的亲和力将病毒与辅助病毒分开(Zolotukhin等人,Gene Ther[基因疗法]6:973-985,1999)。优选地，使用缺失的复制缺陷型辅助病毒，以便任何污染性辅助病毒都不具有复制能力。作为进一步的选择，可以使用缺乏晚期基因表达的腺病毒辅助，因为仅需要腺病毒早期基因表达来介导双链病毒的包装。晚期基因表达有缺陷的腺病毒突变体是本领域已知的(例如，ts100K和ts149腺病毒突变体)。

提供辅助功能的一种方法是使用非感染性腺病毒小质粒，所述质粒携带有效产生AAV所需的所有辅助基因(Ferrari等人,Nat Med[自然医学]3:1295-1297,1997；Xiao等人,J Virol[病毒学杂志]72:2224-2232,1998)。用腺病毒小质粒获得的rAAV滴度比用常规野生型腺病毒感染方法获得的rAAV滴度高40倍(Xiao等人,J Virol[病毒学杂志]72:2224-2232,1998)。这种方法消除了与腺病毒进行共转染的需要(等人,J Virol[病毒学杂志]68:7169-7177,1994；Clark等人,Hum Gene Ther[人类基因治疗]6:1329-1341,1995；Trempe和Yang,(1993),in,Fifth Parvovirus Workshop[在第五次细小病毒研讨会中],Crystal River,FL)。

已经描述了其他生产rAAV储备液的方法，包括但不限于将rep和cap基因分开到单独的表达盒上以防止产生具有复制能力的AAV的方法(参见，例如，Allen等人,J Virol[病毒学杂志]71:6816-6822,1997)，采用包装细胞系的方法(参见，例如，Gao等人,Hum GeneTher[人类基因治疗]9:2353-2362,1998；Inoue等人,J Virol[病毒学杂志]72:7024-7031,1998；美国专利号5,837,484；WO 98/27207；美国专利号5,658,785；WO 96/17947)以及其他无辅助病毒的系统(参见，例如，美国专利号5,945,335)。

疱疹病毒也可以在AAV包装方法中用作辅助病毒。编码一种或多种AAV Rep蛋白的杂合疱疹病毒可以有利地促进更可扩展的AAV载体产生方案。已经描述了表达AAV-2rep和cap基因的杂合单纯疱疹病毒I型(HSV-1)载体(Conway等人,Gene Ther[基因疗法]6:986-993,1999,和WO 00/17377)。

总之，将要复制和包装的基因盒、细小病毒帽基因、适当的细小病毒rep基因和(优选地)辅助功能提供给细胞(例如，允许细胞或包装细胞)，以产生携带载体基因组的rAAV颗粒。由基因盒和/或一种或多种包装载体和/或稳定转化的包装细胞编码的rep和cap基因的联合表达导致产生病毒载体颗粒，其中病毒载体衣壳包装了根据本发明的病毒载体基因组。使单链病毒载体在细胞内组装，然后可以通过本领域技术人员已知的并且在实例中描述的任何方法回收。例如，病毒载体可以通过标准的CsCl离心方法(Grieger等人,NatProtoc[自然实验手册]1:1412-1428,2006)、碘克沙醇离心方法或技术人员已知的各种柱色谱法来纯化(参见，例如，Lock等人，Hum Gene Ther[人类基因治疗]21:1259-1271，2010；Smith等人,Mol Ther[分子疗法]17:1888-1896,2009；和Vandenberghe等人,Hum GeneTher[人类基因治疗]21:1251-1257,2010)。

本文公开的试剂和方法可用于产生本发明病毒载体的高滴度储备液，优选基本以野生型滴度。还优选所述细小病毒储备液具有约10¹⁰vg/mL至约10¹³vg/mL的滴度，例如，至少或约10¹⁰vg/mL、6.6x10¹⁰vg/mL、10¹¹vg/mL、5x10¹¹vg/mL、10¹²vg/mL、5x10¹²vg/mL、10¹³vg/mL、5x10¹³vg/mL，或更高。

用于生成病毒载体的核酸

本发明还涉及可用于产生病毒载体的核酸。在本发明的某些方面，用于产生病毒载体的核酸可以是质粒的形式。用于产生病毒载体的质粒，也称为病毒载体质粒，可包含基因盒。病毒载体质粒的基因盒至少包含：启动子，异源CYP4V2基因，聚A信号序列，以及5'和3'ITR。

异源基因和其他元件的组成取决于所得载体的用途。例如，一种类型的异源基因序列包括报告序列，其在表达时产生可检测的信号。此类报告序列包括但不限于编码β-内酰胺酶、β-半乳糖苷酶(LacZ)、碱性磷酸酶、胸苷激酶、绿色荧光蛋白(GFP)、氯霉素乙酰基转移酶(CAT)、荧光素酶、膜结合蛋白(包括例如CD2、CD4、CD8、流感血凝素蛋白和存在针对其的高亲和力抗体或可以通过常规方法产生的本领域熟知的其他蛋白)、以及包含膜结合蛋白的融合蛋白(所述膜结合蛋白适当融合至来自血凝素或Myc的抗原标签结构域)的DNA序列。例如，如果报告序列是LacZ基因，则通过检测β-半乳糖苷酶活性来检测带有信号的载体的存在。当报告序列是GFP或荧光素酶时，可以通过在发光计中通过颜色或发光来目测测量携带信号的载体。

异源基因序列与驱动其表达的元件相关联时，提供可通过常规手段检测到的信号，包括酶促、射线照相、比色、荧光或其他光谱测定、荧光激活细胞分选测定和免疫测定、包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫分析(RIA)和免疫组织化学。

异源基因也可以是编码在生物学和医学上有用的产物(例如蛋白质、肽、RNA、酶、显性负突变体或催化RNA)的非标志物序列。理想的RNA分子包括tRNA、dsRNA、核糖体RNA、催化RNA、siRNA、小发夹RNA、反式剪接RNA和反义RNA。有用的RNA序列的一个实例是在处理的动物中抑制或消除靶核苷酸序列的表达的序列。

异源基因还可以用于纠正或减轻基因缺陷，其中可能包括正常基因的表达水平低于正常水平的缺陷或功能基因产物未表达的缺陷。预期本发明的异源基因序列可以是CYP4V2编码序列。表2提供了CYP4V2编码序列的实例：SEQ ID NO:13、14、39、41、43、45、47和49。

本发明的一个方面涉及包含基因盒的核酸，所述基因盒以5’至3’方向包含与以下核苷酸序列组之一具有大于或约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性的核苷酸序列：

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cx)SEQ ID NO:1、6、9、14、16、19和22；

cxi)SEQ ID NO:1、7、9、14、16、19和22；以及

cxii)SEQ ID NO:1、8、9、14、16、19和22。

在一些实施例中，所述基因盒以5’至3’方向包含与以下具有大于或约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性的核苷酸序列：SEQ ID NO:1、5、14、18和22；SEQ ID NO:1、5、9、14、18和22；SEQ ID NO:1、5、14、16、18和22；或SEQ ID NO:1、5、9、14、16、18和22。在某些实施例中，所述包含基因盒的核酸可以是质粒。

将表2中的元件掺入的方法是本领域众所周知的，并且将允许技术人员使用本文所述的方法产生本发明的核酸和质粒。

药物组合物

在一个方面，本发明提供了包含与药学上可接受的载体一起配制的本发明的病毒载体的药物组合物。所述组合物可另外含有适用于治疗或预防BCD的一种或多种其他治疗剂。药学上可接受的载体增强或稳定所述组合物，或可用于促进组合物的制备。药学上可接受的载体包括生理上相容的溶剂、表面活性剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。

本发明的药物组合物可通过本领域已知的各种方法施用。施用途径和/或方式根据所希望的结果而变化。优选视网膜下施用。药学上可接受的载体应适合于视网膜下、玻璃体内、静脉内、皮下或局部施用。

所述组合物应该是无菌和流动的。可以例如通过使用包衣(如卵磷脂)、通过在分散液的情况下维持所需颗粒大小以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。在许多情况下，优选在组合物中包含等渗剂例如糖、多元醇(如甘露醇或山梨糖醇)和氯化钠。在一个实施例中，所述组合物可以包括具有1X PBS和0.001％PLURONIC^TMF-68作为表面活性剂的缓冲液，其pH为约6.5至8.0，例如pH 6.5至7.5和pH 6.5至7.0。

本发明的药物组合物可以按照本领域公知和常规实施的方法制备。参见例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy[药学科学与实践],MackPublishing Co[麦克出版社].,第20版,2000；和Sustained and Controlled ReleaseDrug Delivery Systems[持续控制释药物递送系统],J.R.Robinson,编辑,马塞尔·德克公司(Marcel Dekker,Inc.),纽约,1978。药物组合物优选在GMP条件下制造。通常，治疗有效(effective或efficacious)剂量的病毒载体用于本发明的药物组合物中。通过本领域技术人员已知的常规方法可以将病毒载体配制成药学上可接受的剂型。调整剂量方案以提供最佳的所需反应(例如，治疗反应)。例如，如由治疗情况的紧急状态所指示的，可以施用单次推注，可以随着时间施用若干个剂量，或可以按比例减少或增加剂量。可以特别有利地以剂量单位形式配制胃外组合物以易于施用和实现剂量均匀性。如本文所使用，单位剂型是指适合作为单一剂量用于待治疗受试者的物理上离散单位；每个单位含有经计算产生期望治疗作用的预定量的活性化合物以及所需药物载剂。

可以改变本发明药物组合物中活性成分的实际剂量水平，以便获得一定量的活性成分，该活性成分的量有效地实现对于特定的患者、组合物和施用方式的所需的治疗反应，而对该患者没有毒性。所选择的剂量水平取决于各种药代动力学因素，包括所采用的本发明特定组合物的活性、施用途径、施用时间、与所采用的特定组合物组合的其他药物、化合物和/或材料、所治疗患者的年龄、性别、体重、状况、一般健康状况和先前病史、以及类似因素。

医生或兽医可以以低于达到期望治疗效果所需的水平开始药物组合物中使用的本发明的病毒载体的剂量，并逐渐增加剂量直至达到期望效果。通常，用于治疗如本文所述的BCD的本发明的组合物的有效剂量根据不同因素而变化，包括施用方式、靶位点、患者的生理状态、患者是人还是人动物、施用的其他药物以及治疗是预防性的还是治疗性的。需要滴定治疗剂量以优化安全性和功效。对于视网膜下施用病毒载体，剂量可以在约1x10⁸个载体基因组(vg)/眼至约1x10¹²vg/眼的范围内。例如，所述剂量可以大于或约1x10⁸vg/眼、2.5x10⁸vg/眼、5x10⁸vg/眼、7.5x10⁸vg/眼、1x10⁹vg/眼、2.5x10⁹vg/眼、5x10⁹vg/眼、7.5x10⁹vg/眼、1x10¹⁰vg/眼、2.5x10¹⁰vg/眼、5x10¹⁰vg/眼、7.5x10¹⁰vg/眼、1x10¹¹vg/眼、2x10¹¹vg/眼、2.5x10¹¹vg/眼、5x10¹¹vg/眼、7.5x10¹¹vg/眼、或1x10¹²vg/眼。

本文所述的病毒载体主要用作每只眼一次剂量，具有重复给药的可能性以治疗先前给药中未覆盖的视网膜区域。施用的剂量可以根据治疗是预防性的还是治疗性的而变。

在上面单个章节和实施例中提及的本发明的各种特征和实施例，作必要的修正的情况下适当时适用于其他章节和实施例。因此，在一个章节或实施例中指定的特征可以适当地与在其他章节或实施例中指定的特征组合。

治疗用途

通过向有需要的受试者施用有效量的本发明的病毒载体，可以以治疗上有用的浓度将本文所述的病毒载体用于治疗与眼有关的疾病。例如，所述病毒载体可以包含AAV8衣壳，所述衣壳包含VP1、VP2和VP3氨基酸序列，分别与SEQ ID NO:24、25和26具有大于或约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的同一性，由例如与SEQ ID NO:23具有大于或约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性的核苷酸序列和以5’至3’方向包含与以下核苷酸序列组之一具有大于或约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性的核苷酸序列的载体基因组编码：

i)SEQ ID NO:1、2、13、18和22；

ii)SEQ ID NO:1、3、13、18和22；

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lxvi)SEQ ID NO:1、4、14、16、18和22；

lxvii)SEQ ID NO:1、5、14、16、18和22；

lxviii)SEQ ID NO:1、6、14、16、18和22；

lxix)SEQ ID NO:1、7、14、16、18和22；

lxx)SEQ ID NO:1、8、14、16、18和22；

lxxi)SEQ ID NO:1、2、13、16、19和22；

lxxii)SEQ ID NO:1、3、13、16、19和22；

lxxiii)SEQ ID NO:1、4、13、16、19和22；

lxxiv)SEQ ID NO:1、5、13、16、19和22；

lxxv)SEQ ID NO:1、6、13、16、19和22；

lxxvi)SEQ ID NO:1、7、13、16、19和22；

lxxvii)SEQ ID NO:1、8、13、16、19和22；

lxxviii)SEQ ID NO:1、2、14、16、19和22；

lxxix)SEQ ID NO:1、3、14、16、19和22；

lxxx)SEQ ID NO:1、4、14、16、19和22；

lxxxi)SEQ ID NO:1、5、14、16、19和22；

lxxxii)SEQ ID NO:1、6、14、16、19和22；

lxxxiii)SEQ ID NO:1、7、14、16、19和22；

lxxxiv)SEQ ID NO:1、8、14、16、19和22；

lxxxv)SEQ ID NO:1、2、9、13、16、18和22；

lxxxvi)SEQ ID NO:1、3、9、13、16、18和22；

lxxxvii)SEQ ID NO:1、4、9、13、16、18和22；

lxxxviii)SEQ ID NO:1、5、9、13、16、18和22；

lxxxix)SEQ ID NO:1、6、9、13、16、18和22；

xc)SEQ ID NO:1、7、9、13、16、18和22；

xci)SEQ ID NO:1、8、9、13、16、18和22；

xcii)SEQ ID NO:1、2、9、14、16、18和22；

xciii)SEQ ID NO:1、3、9、14、16、18和22；

xciv)SEQ ID NO:1、4、9、14、16、18和22；

xcv)SEQ ID NO:1、5、9、14、16、18和22；

xcvi)SEQ ID NO:1、6、9、14、16、18和22；

xcvii)SEQ ID NO:1、7、9、14、16、18和22；

xcviii)SEQ ID NO:1、8、9、14、16、18和22；

xcix)SEQ ID NO:1、2、9、13、16、19和22；

c)SEQ ID NO:1、3、9、13、16、19和22；

ci)SEQ ID NO:1、4、9、13、16、19和22；

cii)SEQ ID NO:1、5、9、13、16、19和22；

ciii)SEQ ID NO:1、6、9、13、16、19和22；

civ)SEQ ID NO:1、7、9、13、16、19和22；

cv)SEQ ID NO:1、8、9、13、16、19和22；

cvi)SEQ ID NO:1、2、9、14、16、19和22；

cvii)SEQ ID NO:1、3、9、14、16、19和22；

cviii)SEQ ID NO:1、4、9、14、16、19和22；

cix)SEQ ID NO:1、5、9、14、16、19和22；

cx)SEQ ID NO:1、6、9、14、16、19和22；

cxi)SEQ ID NO:1、7、9、14、16、19和22；以及

cxii)SEQ ID NO:1、8、9、14、16、19和22。

在一些实施例中，所述载体基因组以5’至3’方向包含与以下具有大于或约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性的核苷酸序列：SEQ ID NO:1、5、14、18和22；SEQ ID NO:1、5、9、14、18和22；SEQ ID NO:1、5、14、16、18和22；或SEQ ID NO:1、5、9、14、16、18和22。在某些其他实施例中，所述AAV8衣壳可以包含衣壳蛋白VP1、VP2和/或VP3的亚组合。

需要治疗的受试者可能包括那些CYP4V2基因有一个或多个突变(例如，表1)的受试者。更具体地，本发明提供了一种治疗BCD的方法，其通过向有需要的受试者施用有效量的包含CYP4V2编码序列序列(例如，编码人CYP4V2蛋白的核苷酸序列，例如，SEQ ID NO:15)的病毒载体。在一些方面，本文提供的是改善患有BCD的受试者的视力的方法，其通过向有需要的受试者施用有效量的包含CYP4V2编码序列(例如，编码人CYP4V2蛋白的核苷酸序列，例如，SEQ ID NO:15)的病毒载体。在一些方面，本文提供的是预防患有BCD的受试者的视力下降的方法，其通过向有需要的受试者施用有效量的包含CYP4V2编码序列(例如，编码人CYP4V2蛋白的核苷酸序列，例如，SEQ ID NO:15)的病毒载体。在具体的方面，本发明提供了用于治疗患有BCD的受试者的包含CYP4V2编码序列的病毒载体。在一个实施例中，可以使用本领域技术人员已知的方法通过视网膜下或玻璃体内施用本文所述的病毒载体。在一个实施例中，所述方法可以包括对受试者进行基因分型以确定其是否具有与BCD相关的一种或多种CYP4V2突变(参见，例如，表1)，以及通过施用如本文所述的病毒载体来治疗患有与BCD相关的一种或多种CYP4V2突变的受试者的BCD。在具体的实施例中，用于治疗BCD的方法的本文提供的病毒载体包含可操作地连接至启动子例如ProC2启动子的CYP4V2编码序列序列(例如，编码人CYP4V2蛋白的核苷酸序列，例如SEQ ID NO:15)。

重组AAV的使用已被证明对视网膜疾病的治疗是可行和安全的。参见，例如，Bainbridge等人,N Engl J Med[新英格兰医学杂志]358:2231-2239,2008；Bainbridge等人,Gene Ther[基因疗法]15:1191-1192,2008；Hauswirth等人,Hum Gene Ther[人类基因治疗]19:979-990,2008；Maguire等人,N Engl J Med[新英格兰医学杂志]358:2240-2248,2008；Bennett等人,Lancet[柳叶刀]388:661-672,2016；和Russell等人,Lancet[柳叶刀]390:849-860,2017。本文所述的病毒载体尤其可以用于治疗和预防BCD的进展并减少视力丧失。

本发明还涉及通过将本发明的病毒载体施用给有需要的受试者例如其CYP4V2基因中具有一个或多个突变(例如，表1)的受试者而在RPE细胞中表达CYP4V2编码序列的方法。本发明还涉及用于在有需要的受试者的视网膜的RPE细胞中表达CYP4V2编码序列的本发明的病毒载体。本发明还考虑了向患有BCD的受试者的视网膜，特别是视网膜中的RPE细胞递送和表达CYP4V2编码序列的方法。预期通过使受试者的视网膜和/或RPE细胞与本文所述的病毒载体接触(例如，视网膜下或玻璃体内施用)，将CYP4V2编码序列递送至有需要的受试者。可替代地，通过向受试者施用如本文所述的病毒载体，将CYP4V2编码序列递送至受试者。

在一些方面，本发明进一步包括通过使受试者的视网膜与本发明的病毒载体接触，在具有BCD的受试者的视网膜中的RPE细胞中表达CYP4V2编码序列的方法。在某些方面，使受试者视网膜的RPE细胞与本发明的病毒载体接触。

眼科医师、验光师或医疗保健专业人员可以使用视功能、功能性视力、视网膜解剖结构和/或生活质量的临床相关测量值来确定眼科疾病(例如BCD)的治疗和/或预防。BCD的治疗意指改善或保持视功能、功能性视力、视网膜解剖和/或生活质量的任何措施(例如，施用本文所述的病毒载体)。此外，与BCD相关的预防是指在受试者中，抑制、预防或减缓本文定义的视功能、功能性视觉、视网膜解剖结构和/或BCD表型恶化的任何措施(例如，施用本文所述的病毒载体)，例如，减少视网膜中黄色或白色晶体状沉积物的数量和/或大小，所述受试者具有上述恶化风险。

视功能可以包括例如视力、低照度视力、视野、中央视野、周边视力、对比敏感度、暗适应、光应力恢复、辨色力、阅读速度、辅助装置依赖性(例如大字体、放大装置、望远镜)、面部识别、驾驶机动车熟练程度、进行日常生活中的一项或多项活动的能力、和/或患者报告的视功能相关满意度。因此，在某些实施例中，BCD的治疗可以说是在以下情况中发生：受试者的前述暗适应程度时间至少减少10％、20％、或30％或缺少10％、20％、或30％或更多的增加。此外，BCD的治疗可以说是在以下情况中发生：受试者在年轻时表现出早期严重的夜盲症和缓慢的黑暗适应能力，然后视力、视野和色觉逐渐丧失，导致法律上的盲症，这是由合格的医疗保健人员例如眼科医师和验光师决定。

视觉功能的示例性测量包括Snellen视力、ETDRS视力、低照度视力、Amsler方格表、Goldmann视野、标准自动视野检查、微视野检查(microperimetry)、Pelli-Robson图表、SKILL卡片、Ishihara色板、Farnsworth D15或D100色彩测试、标准视网膜电描记术、多焦视网膜电描记术、经验证的阅读速度测试、面部识别、驾驶模拟和患者报告的满意度。因此，BCD的治疗可以说是通过获得或未丧失ETDRS量表上的2或更多行(或10字母)的视力后来达到。此外，在某些方面，BCD的治疗可以说是在以下后发生：例如通过视网膜电描记法测量的视网膜功能丧失的改善或减缓；例如通过光学相干断层扫描(OCT)进行测量的视网膜结构进展的改善或减缓；例如通过在各种光照强度下的迷宫的动态导航丧失的改善或减缓；和/或阅读速度至少增加10％、20％或30％，或者阅读速度没有降低10％、20％或30％(每分钟字数)。此外，在一些方面，BCD的治疗可以说是在以下情况中发生：受试者显示Ishihara测试上正确鉴别的板或Farnsworth测试上正确排序的盘的比例至少增加20％或没有降低20％。因此，BCD的治疗可通过例如改善黑暗适应、改善视力或减缓视力丧失速度来确定。

可能被治疗或预防的视网膜解剖结构的不良方面包括，例如，视网膜中脂质的小、黄色或白色晶体状沉积物的积累、视网膜萎缩、视网膜色素上皮萎缩、视网膜血管变窄、色素结块和视网膜下液。评估视网膜解剖学的示例性手段包括眼底镜检查、眼底照相术、荧光素血管造影、靛青绿血管造影、OCT、谱域光学相干断层扫描、扫描激光检眼镜检查、共焦显微术、自适应光学、眼底自发荧光、活组织检查、尸体剖检和免疫组织化学。因此，如本文所述，本文所述的病毒载体可用于治疗受试者的BCD，例如，视网膜萎缩的发生率降低和/或视网膜中黄色或白色晶体状沉积物的数量和/或大小减少。

BCD的治疗还可以通过例如改善或维持生活质量来确定。技术人员将理解，生活质量可以通过许多不同的测试来确定，例如，美国国立眼科研究所NEI-VFQ25问卷(NationalEye Institute NEI-VFQ25 questionnaire)。

用本发明的治疗剂治疗的受试者还可以被施用具有治疗视网膜营养不良的已知功效的其他治疗剂或装置，例如维生素和矿物质制剂、弱视辅助、导盲犬或其他已知可以帮助弱视患者的装置。

当前，没有其他批准的BCD治疗剂。随着其他新疗法的出现，本发明的组合物和较新的疗法可以按临床指示顺序地或同时地依序施用。

以下是本发明的示例性实施例。

1.一种包含载体基因组的病毒载体，所述载体基因组以5’至3’方向包含：

(i)5’ITR；

(ii)启动子；

(iii)重组核苷酸序列，其包含CYP4V2编码序列；

(iv)聚腺苷酸化(聚A)信号序列；以及

(v)3’ITR。

2.如实施例1所述的病毒载体，其中所述载体基因组以5’至3’方向包含：

(i)5’ITR；

(ii)启动子；

(iii)内含子；

(iv)重组核苷酸序列，其包含CYP4V2编码序列；

(v)聚A信号序列；以及

(vi)3’ITR。

3.如实施例1所述的病毒载体，其中所述载体基因组以5’至3’方向包含：

(i)5’ITR；

(ii)启动子；

(iii)重组核苷酸序列，其包含CYP4V2编码序列；

(iv)调节元件；

(v)聚A信号序列；以及

(vi)3’ITR。

4.如实施例1所述的病毒载体，其中所述载体基因组以5’至3’方向包含：

(i)5’ITR；

(ii)启动子；

(iii)内含子；

(iv)重组核苷酸序列，其包含CYP4V2编码序列；

(v)调节元件；

(vi)聚A信号序列；以及

(vii)3’ITR。

5.如实施例1至4中任一项所述的病毒载体，其中所述载体基因组包含的长度大于或约4.1kb且小于或约4.9kb。

6.如实施例1至5中任一项所述的病毒载体，其中所述载体基因组包含位于聚A信号序列和3’ITR之间的填充序列。

7.如实施例6所述的病毒载体，其中所述填充序列的长度在约1-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-75、75-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-400、400-500、500-750、750-1,000、1,000-1,500、1,500-2,000、2,000-2,500、或2,500-3,000个核苷酸之间。

8.如实施例1至7中任一项所述的病毒载体，其中所述5’ITR包含与SEQ ID NO:1具有大于或约90％同一性的核苷酸序列。

9.如实施例1至8中任一项所述的病毒载体，其中所述启动子是遍在启动子。

10.如实施例9所述的病毒载体，其中所述启动子是巨细胞病毒(CMV)启动子、CBA启动子、或CAG启动子。

11.如实施例10所述的病毒载体，其中所述启动子包含与SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3或SEQ ID NO:4具有大于或约90％同一性的核苷酸序列。

12.如实施例1至8中任一项所述的病毒载体，其中所述启动子是视网膜色素上皮(RPE)-特异性启动子。

13.如实施例12所述的病毒载体，其中所述启动子是ProC2启动子、VMD2启动子、CYP4V2启动子、或RPE65启动子。

14.如实施例13所述的病毒载体，其中所述启动子包含与SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:7、或SEQ ID NO:8具有大于或约90％同一性的核苷酸序列，并促进CYP4V2在RPE细胞中的表达。

15.如实施例1至14中任一项所述的病毒载体，其中所述CYP4V2编码序列包含与SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:47、或SEQ ID NO:49具有大于或约90％同一性的核苷酸序列。

16.如实施例1至15中任一项所述的病毒载体，其中所述聚A信号序列包含牛生长激素或猿猴病毒40聚A核苷酸序列。

17.如实施例16所述的病毒载体，其中所述聚A信号序列包含与SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:19具有大于或约90％同一性的核苷酸序列。

18.如实施例1至17中任一项所述的病毒载体，其中所述3’ITR包含与SEQ ID NO:22具有大于或约90％同一性的核苷酸序列。

19.如实施例2和4中任一项所述的病毒载体，其中所述内含子包含人类生长激素、猿猴病毒40、或人类β戈宾内含子序列。

20.如实施例19所述的病毒载体，其中所述内含子包含与SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:10或SEQ ID NO:11具有大于或约90％同一性的核苷酸序列。

21.如实施例3和4中任一项所述的病毒载体，其中所述调节元件包含乙型肝炎病毒或土拨鼠肝炎病毒序列。

22.如实施例21所述的病毒载体，其中所述调节元件包含与SEQ ID NO:16或SEQID NO:17具有大于或约90％同一性的核苷酸序列。

23.如实施例1至22中任一项所述的病毒载体，其中所述载体基因组包含位于紧靠包含CYP4V2编码序列的重组核苷酸序列的上游的科扎克序列。

24.如实施例23所述的病毒载体，其中所述科扎克序列包含SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:51、SEQ ID NO:52、或SEQ ID NO:53的核苷酸序列。

25.如实施例1所述的病毒载体，其中所述载体基因组以5’至3’方向包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：

i)SEQ ID NO:1、2、13、18和22；

ii)SEQ ID NO:1、3、13、18和22；

iii)SEQ ID NO:1、4、13、18和22；

iv)SEQ ID NO:1、5、13、18和22；

v)SEQ ID NO:1、6、13、18和22；

vi)SEQ ID NO:1、7、13、18和22；

vii)SEQ ID NO:1、8、13、18和22；

viii)SEQ ID NO:1、2、14、18和22；

ix)SEQ ID NO:1、3、14、18和22；

x)SEQ ID NO:1、4、14、18和22；

xi)SEQ ID NO:1、5、14、18和22；

xii)SEQ ID NO:1、6、14、18和22；

xiii)SEQ ID NO:1、7、14、18和22；

xiv)SEQ ID NO:1、8、14、18和22；

xv)SEQ ID NO:1、2、13、19和22；

xvi)SEQ ID NO:1、3、13、19和22；

xvii)SEQ ID NO:1、4、13、19和22；

xviii)SEQ ID NO:1、5、13、19和22；

xix)SEQ ID NO:1、6、13、19和22；

xx)SEQ ID NO:1、7、13、19和22；

xxi)SEQ ID NO:1、8、13、19和22；

xxii)SEQ ID NO:1、2、14、19和22；

xxiii)SEQ ID NO:1、3、14、19和22；

xxiv)SEQ ID NO:1、4、14、19和22；

xxv)SEQ ID NO:1、5、14、19和22；

xxvi)SEQ ID NO:1、6、14、19和22；

xxvii)SEQ ID NO:1、7、14、19和22；以及

xxviii)SEQ ID NO:1、8、14、19和22。

26.如实施例2所述的病毒载体，其中所述载体基因组以5’至3’方向包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：

i)SEQ ID NO:1、2、9、13、18和22；

ii)SEQ ID NO:1、3、9、13、18和22；

iii)SEQ ID NO:1、4、9、13、18和22；

iv)SEQ ID NO:1、5、9、13、18和22；

v)SEQ ID NO:1、6、9、13、18和22；

vi)SEQ ID NO:1、7、9、13、18和22；

vii)SEQ ID NO:1、8、9、13、18和22；

viii)SEQ ID NO:1、2、9、14、18和22；

ix)SEQ ID NO:1、3、9、14、18和22；

x)SEQ ID NO:1、4、9、14、18和22；

xi)SEQ ID NO:1、5、9、14、18和22；

xii)SEQ ID NO:1、6、9、14、18和22；

xiii)SEQ ID NO:1、7、9、14、18和22；

xiv)SEQ ID NO:1、8、9、14、18和22；

xv)SEQ ID NO:1、2、9、13、19和22；

xvi)SEQ ID NO:1、3、9、13、19和22；

xvii)SEQ ID NO:1、4、9、13、19和22；

xviii)SEQ ID NO:1、5、9、13、19和22；

xix)SEQ ID NO:1、6、9、13、19和22；

xx)SEQ ID NO:1、7、9、13、19和22；

xxi)SEQ ID NO:1、8、9、13、19和22；

xxii)SEQ ID NO:1、2、9、14、19和22；

xxiii)SEQ ID NO:1、3、9、14、19和22；

xxiv)SEQ ID NO:1、4、9、14、19和22；

xxv)SEQ ID NO:1、5、9、14、19和22；

xxvi)SEQ ID NO:1、6、9、14、19和22；

xxvii)SEQ ID NO:1、7、9、14、19和22；以及

xxviii)SEQ ID NO:1、8、9、14、19和22。

27.如实施例3所述的病毒载体，其中所述载体基因组以5’至3’方向包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：

i)SEQ ID NO:1、2、13、16、18和22；

ii)SEQ ID NO:1、3、13、16、18和22；

iii)SEQ ID NO:1、4、13、16、18和22；

iv)SEQ ID NO:1、5、13、16、18和22；

v)SEQ ID NO:1、6、13、16、18和22；

vi)SEQ ID NO:1、7、13、16、18和22；

vii)SEQ ID NO:1、8、13、16、18和22；

viii)SEQ ID NO:1、2、14、16、18和22；

ix)SEQ ID NO:1、3、14、16、18和22；

x)SEQ ID NO:1、4、14、16、18和22；

xi)SEQ ID NO:1、5、14、16、18和22；

xii)SEQ ID NO:1、6、14、16、18和22；

xiii)SEQ ID NO:1、7、14、16、18和22；

xiv)SEQ ID NO:1、8、14、16、18和22；

xv)SEQ ID NO:1、2、13、16、19和22；

xvi)SEQ ID NO:1、3、13、16、19和22；

xvii)SEQ ID NO:1、4、13、16、19和22；

xviii)SEQ ID NO:1、5、13、16、19和22；

xix)SEQ ID NO:1、6、13、16、19和22；

xx)SEQ ID NO:1、7、13、16、19和22；

xxi)SEQ ID NO:1、8、13、16、19和22；

xxii)SEQ ID NO:1、2、14、16、19和22；

xxiii)SEQ ID NO:1、3、14、16、19和22；

xxiv)SEQ ID NO:1、4、14、16、19和22；

xxv)SEQ ID NO:1、5、14、16、19和22；

xxvi)SEQ ID NO:1、6、14、16、19和22；

xxvii)SEQ ID NO:1、7、14、16、19和22；以及

xxviii)SEQ ID NO:1、8、14、16、19和22。

28.如实施例4所述的病毒载体，其中所述载体基因组以5’至3’方向包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：

i)SEQ ID NO:1、2、9、13、16、18和22；

ii)SEQ ID NO:1、3、9、13、16、18和22；

iii)SEQ ID NO:1、4、9、13、16、18和22；

iv)SEQ ID NO:1、5、9、13、16、18和22；

v)SEQ ID NO:1、6、9、13、16、18和22；

vi)SEQ ID NO:1、7、9、13、16、18和22；

vii)SEQ ID NO:1、8、9、13、16、18和22；

viii)SEQ ID NO:1、2、9、14、16、18和22；

ix)SEQ ID NO:1、3、9、14、16、18和22；

x)SEQ ID NO:1、4、9、14、16、18和22；

xi)SEQ ID NO:1、5、9、14、16、18和22；

xii)SEQ ID NO:1、6、9、14、16、18和22；

xiii)SEQ ID NO:1、7、9、14、16、18和22；

xiv)SEQ ID NO:1、8、9、14、16、18和22；

xv)SEQ ID NO:1、2、9、13、16、19和22；

xvi)SEQ ID NO:1、3、9、13、16、19和22；

xvii)SEQ ID NO:1、4、9、13、16、19和22；

xviii)SEQ ID NO:1、5、9、13、16、19和22；

xix)SEQ ID NO:1、6、9、13、16、19和22；

xx)SEQ ID NO:1、7、9、13、16、19和22；

xxi)SEQ ID NO:1、8、9、13、16、19和22；

xxii)SEQ ID NO:1、2、9、14、16、19和22；

xxiii)SEQ ID NO:1、3、9、14、16、19和22；

xxiv)SEQ ID NO:1、4、9、14、16、19和22；

xxv)SEQ ID NO:1、5、9、14、16、19和22；

xxvi)SEQ ID NO:1、6、9、14、16、19和22；

xxvii)SEQ ID NO:1、7、9、14、16、19和22；以及

xxviii)SEQ ID NO:1、8、9、14、16、19和22。

29.如实施例1至28中任一项所述的病毒载体，其中所述载体包含腺相关病毒(AAV)血清型8、9、2或5衣壳。

30.如实施例29所述的病毒载体，其中所述AAV8衣壳包含分别与SEQ ID NO:24、25和26具有大于或约90％同一性的VP1、VP2和VP3氨基酸序列。

31.如实施例29所述的病毒载体，其中所述AAV8衣壳由与SEQ ID NO:23具有大于或约90％同一性的核苷酸序列编码。

32.如实施例29所述的病毒载体，其中所述AAV9衣壳包含分别与SEQ ID NO:28、29和30具有大于或约90％同一性的VP1、VP2和VP3氨基酸序列。

33.如实施例29所述的病毒载体，其中所述AAV9衣壳由与SEQ ID NO:27具有大于或约90％同一性的核苷酸序列编码。

34.如实施例29所述的病毒载体，其中所述AAV2衣壳包含分别与SEQ ID NO:32、33和34具有大于或约90％同一性的VP1、VP2和VP3氨基酸序列。

35.如实施例29所述的病毒载体，其中所述AAV2衣壳由与SEQ ID NO:31具有大于或约90％同一性的核苷酸序列编码。

36.如实施例29所述的病毒载体，其中所述AAV5衣壳包含分别与SEQ ID NO:36、37和38具有大于或约90％同一性的VP1、VP2和VP3氨基酸序列。

37.如实施例29所述的病毒载体，其中所述AAV5衣壳由与SEQ ID NO:35具有大于或约90％同一性的核苷酸序列编码。

38.一种组合物，其包含如前述实施例中任一项所述的病毒载体。

39.如实施例38所述的组合物，其中所述组合物还包含药学上可接受的赋形剂。

40.在视网膜细胞中表达异源CYP4V2基因的方法，所述方法包括使所述视网膜细胞与前述实施例中任一项所述的病毒载体接触。

41.如实施例40所述的方法，其中所述视网膜细胞是RPE细胞。

42.一种治疗患有Bietti晶体营养不良(BCD)的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的如实施例39所述的组合物。

43.一种在患有BCD的受试者中改善视力、改善视功能或功能性视力或抑制视功能或功能性视力下降的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的如实施例39所述的组合物。

44.如实施例39所述的组合物，用于治疗患有BCD的受试者。

45.如实施例39所述的组合物，用于改善患有BCD的受试者的视力。

46.一种包含基因盒的核酸，其中所述基因盒以5’至3’方向包含：

(i)5’ITR；

(ii)启动子；

(iii)重组核苷酸序列，其包含CYP4V2编码序列；

(iv)聚A信号序列；以及

(v)3’ITR。

47.如实施例46所述的核酸，其中所述核酸是质粒。

48.如实施例46所述的核酸，其中所述基因盒以5’至3’方向包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：

i)SEQ ID NO:1、2、13、18和22；

ii)SEQ ID NO:1、3、13、18和22；

iii)SEQ ID NO:1、4、13、18和22；

iv)SEQ ID NO:1、5、13、18和22；

v)SEQ ID NO:1、6、13、18和22；

vi)SEQ ID NO:1、7、13、18和22；

vii)SEQ ID NO:1、8、13、18和22；

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xvi)SEQ ID NO:1、3、13、19和22；

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cxii)SEQ ID NO:1、8、9、14、16、19和22。

49.一种包含载体基因组的病毒载体，所述载体基因组包含与包含CYP4V2编码序列的重组核苷酸序列可操作地连接的启动子，其中所述启动子是ProC2启动子。

实例

提供以下实例以进一步说明本发明，但不限制本发明的范围。本发明的其他变型对本领域普通技术人员而言将是显而易见的，且也为所附权利要求书所涵盖。

实例1：AAV-ITR质粒的构建

1.1.AAV-ITR质粒的克隆：

各个质粒元件的核苷酸序列在表2中描述。所述序列是合成的或可商购的。表4描述了所构建的每个质粒中存在的元件。使用标准分子生物学克隆技术生成表4中所述的质粒。具有卡那霉素抗性的质粒骨架用作骨架和起始材料。将各个序列元件克隆到限制性酶切位点或使用平末端克隆。

由于质粒骨架中包含的抗生素抗性基因盒在AAV载体的生产中不起作用，本领域技术人员可以使用替代质粒骨架和/或抗生素抗性基因盒并产生相同的病毒载体。

1.2.三重质粒转染以产生rAAV载体：

重组AAV(rAAV)病毒载体是通过三重转染方法生成的。三重转染的方法是本领域已知的(Ferrari等人,Nat Med[自然医学]3:1295-1297,1997)。简而言之，将含AAV-ITR的质粒(表4中所述)、含AAV-RepCap的质粒(携带Rep2和Cap8)和腺辅助质粒(携带辅助完成AAV复制周期的基因)共转染293细胞。将细胞培养4天。在培养期结束时，裂解细胞，并使用AVB琼脂糖亲和柱(GE健康医疗生命科学公司(GE Healthcare Life Sciences))通过柱色谱法纯化培养上清液和细胞裂解物中的载体。技术人员将理解，也可以使用标准的CsCl梯度离心方法(基于Grieger等人,Nat Protoc[自然实验手册]1:1412-1428,2006的方法)。

可替代地，可以通过上述细胞转染和培养方法产生GMP样rAAV载体。然后，基于Lock等人,Hum Gene Ther[人类基因治疗]21:1259-1271,2010中描述的方法，通过柱色谱法处理收获的细胞培养物材料；Smith等人,Mol Ther[分子疗法]17:1888-1896,2009；和Vandenberghe等人,Hum Gene Ther[人类基因治疗]21:1251-1257,2010。

表4.质粒组合物

实例2：包含hGH内含子、bGH聚A信号序列和HPRE提供eGFP的增强的表达

设计表达ChR2d-eGFP的AAV8载体，其中包含不同的元件，包括不同的内含子，不同的聚A信号序列，并带有或不带有HPRE，以确定在视网膜中最佳基因表达的最佳组合。

方法

向C57BL/6小鼠视网膜下注射1x10⁹vg的AAV8载体，所述载体表达融合至eGFP的光敏感通道蛋白(ChR2d-eGFP)并含有不同的元件，例如不同的内含子(例如，hGH内含子和SV40内含子)、聚A信号序列(例如，bGH聚A信号序列和SV40聚A信号序列)以及带有或不带有HPRE。四周后，从小鼠身上收获眼，并一些在4℃下用1ml 4％多聚甲醛(PFA)固定剂固定过夜，然后将其置于磷酸盐缓冲液(PBS)中。然后用纸巾擦干这些眼，并转移到35mm培养皿中。从眼外以及角膜和晶状体上去除多余的组织，然后将眼杯浸入1ml PBS中。然后将视网膜从眼杯中移出，将它们都切成翼瓣并固定在载玻片上。使用Zeiss Axio Imager M1荧光显微镜和AxioVision软件获得eGFP荧光图像。所有图像均以2.5倍的放大倍率和相同的曝光时间拍摄。

将其他收获的眼分成神经视网膜和后眼杯，并冷冻，以使用液滴数字PCR(ddPCR)分析ChR2d-eGFP mRNA表达。简而言之，使用Qiagen RNeasy Mini试剂盒从组织样品中分离出RNA，然后使用赛默飞世尔科技公司的高容量cDNA逆转录试剂盒使用200ng RNA生成cDNA。将每个样品1ng的cDNA添加到ddPCR Supermix中，并将识别eGFP(Mr04097229_mr；赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific))和小鼠Rab7(Mm00784318_sH；赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific))的引物和探针添加到每个反应中。ddPCR是根据制造商的规程(伯乐公司(Bio-Rad))进行的。将每个样品的ChR2d-eGFP表达标准化为Rab7对照表达。

结果和结论

构建了五种不同的AAV8载体并视网膜下注射到小鼠中。注射后四周，从小鼠收获眼，并通过铺片和ddPCR检查ChR2d-eGFP表达。后眼杯的铺片显示，在注射含有hGH内含子的载体的眼中，eGFP荧光最高(图1)。此外，与具有SV40聚A信号序列的相同载体相比，包含bGH聚A信号序列显示出略高的荧光(AAV8-TM078相比于AAV8-TM073)。

为了获得ChR2d-eGFP表达水平的更定量分析，对从分离的神经视网膜和后眼杯样品中分离的mRNA进行了ddPCR。结果显示，在眼后杯中，添加HPRE可以最明显地增强表达(AAV8-TM075)(图2A)。而且，与分别包含SV40聚A信号序列的载体相比，包含bGH聚A信号序列的载体表现出更高的表达(比较AAV8-TM078与AAV8-TM073，和比较AAV8-TM079与AAV8-TM074)。在神经视网膜中，HPRE的添加再次导致eGFP(AAV8-TM075)的表达水平增强，但是通过添加bGH聚A信号序列观察到最大的表达增加(AAV8-TM078和AAV8-TM079)(图2B)。

综上所述，这些结果表明，用于在视网膜中表达基因的最佳表达盒可能包括hGH内含子、bGH聚A信号序列和HPRE元件。因此，构建了包含一个、两个或所有三个元件的载体，用于递送CYP4V2 cDNA，用于治疗BCD。

实例3：向Cyp4v3敲除小鼠视网膜下注射AAV-CYP4V2载体防止疾病进展。

Cyp4v3是人类CYP4V2的小鼠直系同源物(82％同一性)。使用CRISPR/Cas9敲除Cyp4v3基因，并向Cyp4v3敲除小鼠注射表达CYP4V2的AAV载体，每只眼大约1x10⁹vg。在注射后的不同时间点，通过眼底成像和光学相干断层扫描检查小鼠，以确定视网膜中存在的晶体沉积物的数量和大小。此外，对小鼠进行视功能(例如视力，黑暗适应)和功能性视力(例如，流动性测试)评估。与注射对照(AAV-eGFP载体)的眼相比，注射表达CYP4V2的载体的眼显示出晶体沉积物的数量和/或大小减少和/或视功能和/或功能性视力的改善，证明了CYP4V2在RPE细胞中的成功表达和CYP4V2蛋白功能的恢复。

实例4：向非人灵长类动物视网膜下注射AAV-ProC2载体导致RPE细胞中的基因表 达

ProC2启动子序列由GENEWIZ化学合成，具有包含MluI/NheI/AscI和BamHI/EcoRI/BglII限制性位点的短侧翼。使用合适的限制性位点组合将ProC2启动子序列亚克隆到pAAV-EF1a-CatCh-GFP中替换EF1a或hRO启动子。通过衔接子PCR和Clontech In-Fusion试剂盒使用pcDNA3.1(-)-CatCh-GFP构建pAAV-EF1a-CatCh-GFP质粒。

使用分支聚乙烯亚胺(聚科学公司(Polysciences))用AAV转基因质粒，编码用于选定衣壳(BP2)的AAV Rep2和Cap蛋白的AAV辅助质粒以及带有腺病毒基因的pHGT1-Adeno1辅助质粒共转染HEK293T细胞。在HEK293T细胞80％汇合的情况下，将一个直径为15cm的细胞培养皿与质粒混合物一起共转染。将含有在5μml DMEM中的7μg AAV转基因质粒、7μg编码Rep2和Cap的质粒、20μg AAV辅助质粒和6.8μM聚乙烯亚胺的细胞转染混合物在室温下孵育15min，然后添加到含有10ml DMEM的细胞培养皿。转染后60h，收集细胞并将其重悬于含有150mM NaCl和20mM Tris-HCl，pH 8.0的缓冲液中。通过反复的冻融循环裂解细胞，并添加MgCl2使其终浓度为1mM。将质粒和基因组DNA通过在37℃下用250U ml-1的TurboNuclease处理10min去除。通过在4,000r.p.m下离心30min除去细胞碎片。纯化AAV颗粒，并在Millipore Amicon 100K柱(目录号UFC910008；默克密理博公司(Merck Millipore))中浓缩。使用蛋白酶K使AAV颗粒变性后，通过TaqMan逆转录PCR对衣壳化的病毒DNA进行定量；滴度计算为基因组拷贝数/ml。

为了在小鼠中施用AAV，在用2.5％异氟烷麻醉的小鼠上进行眼注射。用锋利的30-G针在晶状体附近的巩膜上做一个小切口，并用一个装在显微操纵器中的钝的5μl汉密尔顿(汉密尔顿公司(Hamilton Company))注射器通过该切口将2μl AAV悬浮液注入视网膜下/玻璃体内间隙。

对于在非人灵长类动物中进行AAV施用，与中国昆明的眼科医师和第三方承包商合作进行了视网膜下注射50微升的AAV颗粒悬浮液。3个月后，将分离的眼杯在PBS中的4％PFA中固定过夜，接着是在4℃下在PBS中的洗涤步骤。接受固定的眼杯后，解剖感染的视网膜区域，并在室温下用PBS中的10％正常驴血清(NDS)、1％BSA、0.5％Triton X-100处理1h。在室温下用在PBS中的3％NDS、1％BSA、0.5％曲通X-100中的单克隆大鼠抗GFP抗体(分子探针公司(Molecular Probes Inc.)；1:500)和多克隆山羊抗-ChAT(密理博公司(Millipore)：1:200)处理5天。用驴抗大鼠Alexa Fluor-488二抗(分子探针公司；1:200)、抗山羊Alexa Fluor-633和Hoechst处理2小时。洗涤切片，用ProLong Gold抗褪色试剂(分子探针公司)封固在载玻片上，并使用Zeiss LSM 700Axio Imager Z2激光扫描共聚焦显微镜(卡尔·蔡司公司(Carl Zeiss Inc.))拍照。

图3显示在食蟹猴(NHP)中视网膜下注射AAV-ProC2-CatCh-GFP诱导了RPE细胞中的表达(图3A和3B顶部的灰度图像的灰色区域)。

下表5总结了合成启动子ProC2驱动小鼠和NHP视网膜细胞中表达的能力。

表5：小鼠和NHP视网膜细胞中的细胞特异性表达

MG＝米勒神经胶质细胞；AC＝无长突神经细胞；AII AC＝AII无长突神经细胞；s-(作为前缀)＝稀少表达；RPE＝视网膜色素上皮细胞。

实例5：向食蟹猴视网膜下注射AAV载体，以确定用于靶向RPE细胞的最佳衣壳血清 型。

将从CMV启动子表达GFP的AAV2、AAV6、AAV8和AAV9载体以每眼1x10¹¹vg的剂量经视网膜下注射到食蟹猴中。注射后四周，通过眼底自发荧光成像检查活体猴子眼睛中的GFP表达，并通过免疫组织化学检查收获后猴子眼睛中的GFP表达。此外，通过原位杂交评估GFPmRNA和AAV基因组DNA的水平和定位。

测试的所有四种血清型均能促进GFP在感光细胞和RPE细胞中的表达。在注射部位附近观察到表达，其中以不同程度扩散到周围区域。对于任何测试的血清型，在视神经或脑切片中均未检测到GFP表达。

实例6：向食蟹猴视网膜下注射AAV载体，以确定用于RPE特异性表达的最佳启动 子。

将从RPE特异性启动子表达GFP的AAV载体以每眼1x10¹¹vg的剂量经视网膜下注射到食蟹猴中。所述RPE特异性启动子包括ProC2和VMD2。注射后四周，通过眼底自发荧光成像检查活体猴子眼睛中的GFP表达，并通过免疫组织化学检查收获后猴子眼睛中的GFP表达。此外，通过原位杂交评估GFP mRNA和AAV基因组DNA的水平和定位。两种不同的启动子都显示RPE特异性的GFP表达，但表达水平是可变的。

实例7：人类视网膜组织中AAV驱动的基因表达

人视网膜组织是由去核的人眼球制备的，用细剪刀将视网膜与人眼球切开。将从RPE特异性启动子表达GFP的AAV载体与人视网膜组织一起孵育。所述RPE特异性启动子包括ProC2和VMD2。病毒施用后6-8周检查AAV诱导的GFP表达。注射后六周，通过免疫荧光和成像检查人视网膜组织中的GFP表达。两种不同的启动子均显示RPE特异性GFP表达。

实例8：在NHP和人组织中在ProC2启动子下的AAV驱动的CYP4V2表达

如实例7所述，将在ProC2启动子下表达人CYP4V2的AAV载体(“AAV-ProC2-CYP4V2载体”)与人视网膜组织一起孵育。病毒施用后6-8周检查CYP4V2基因表达。注射后六周，在人视网膜组织中检测到CYP4V2表达。

AAV-ProC2-CYP4V2载体以每眼1x10¹¹vg的剂量经视网膜下注射到食蟹猴中。注射后4周，通过免疫组织化学检查收获后猴眼中CYP4V2的表达。此外，通过原位杂交评估CYP4V2 mRNA和AAV基因组DNA的水平和定位。ProC2启动子在猴眼中诱导CYP4V2基因的RPE特异性表达。

已经详细描述了本披露，将显而易见的是，在不脱离如本文和所附权利要求书中所描述的本披露的精神和范围的情况下，修改、变化和等同方面是可能的。此外，应当理解，本披露中的所有实例均作为非限制性实例提供。本文引用的任何参考文献，包括例如所有专利，公开的专利申请和非专利出版物，均通过引用全文并入。