具体实施方式

复制缺陷型rAAV用于将hLDLR基因递送到被诊断患有HoFH的患者(人类受试者)的肝细胞。rAAV.hLDLR载体应具有对肝脏的向性(例如，带有AAV8衣壳的rAAV)，并且hLDLR转基因应受肝脏特异性表达控制元件的控制。

此类rAAV.hLDLR载体可以通过静脉内(IV)输注在约20到约30分钟的时间段内施用以在肝脏中达到治疗水平的LDLR表达。在其它实施例中，可以选择更短(例如，10到20分钟)或更长(例如，超过30分钟到60分钟，中间时间，例如约45分钟或更长时间)。rAAV.hLDLR的治疗有效剂量范围为至少约2.5×10¹²到7.5×10¹²个基因组拷贝(GC)/kg患者体重。在优选实施例中，rAAV悬浮液的效能使得施用给HoFH(DKO小鼠)的双敲除LDLR-/-Apobec-/-小鼠模型的5×10¹¹GC/kg的剂量将基线胆固醇水平减少25％到75％。可以使用低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平作为转基因表达的替代来评估治疗功效。主要功效评估包含治疗后1到3个月(例如，第12周)的LDL-C水平，在其后持续作用至少约1年(约52周)。可以在治疗后测量转基因表达的长期安全性和持久性。

在某些实施例中，疗法的功效可以通过所述患者所需的单采术频率的降低来测量。在某些实施例中，在AAV8.hLDLR治疗后，患者对单采术的需求可能减少25％、50％或更多。例如，在AAV8.hLDLR疗法之前接受每周单采术的患者可能只需要每两周一次或每月一次的单采术；在其它实施例中，需要单采术的频率甚至可以更低或者可以消除所述需要。

在某些实施例中，疗法的功效可以通过减少所需的PCSK9抑制剂的剂量或通过在AAV8.hLDLR治疗后的患者中消除对此类疗法的需要来测量。在某些实施例中，疗法的功效通过减少所需的他汀类药物或胆汁螯合剂的剂量来测量。

作为治疗候选者的患者优选地是被诊断为患有携带两个LDLR基因突变的HoFH的成年人(年龄≥18岁的男性或女性)；即，在符合HoFH的临床表现的背景下，在两个等位基因处都具有分子定义的LDLR突变的患者，所述临床表现可以包含未经过治疗的LDL-C水平(例如，LDL-C水平>300mg/dl)、经过治疗的LDL-C水平(例如，LDL-C水平<300mg/dl)和/或总血浆胆固醇水平大于500mg/dl以及过早和侵袭性动脉粥样硬化。治疗候选者包含正在进行利用降脂药物，如他汀类药物、依泽替米贝、胆汁酸螯合剂、PCSK9抑制剂进行的治疗和LDL和/或血浆单采术的HoFH患者。

在治疗之前，应评估所述HoFH患者的用于递送hLDLR基因的针对AAV血清型的中和抗体(NAb)。此类NAb会干扰转导效率并降低治疗功效。基线血清NAb效价≤1:10的HoFH患者是利用rAAV.hLDLR基因疗法方案进行治疗的良好候选者。血清NAb效价>1:5的HoFH患者的治疗可能需要组合疗法，如在利用rAAV.hLDL进行的治疗之前/期间利用免疫抑制剂进行临时共治疗等。另外或可替代地，监测患者的肝酶升高，所述肝酶升高可以利用临时免疫抑制剂疗法治疗(例如，如果观察到至少大约2倍基线水平的天冬氨酸转氨酶(AST)或丙氨酸转氨酶(ALT))。

在某些实施例中，此类疗法可以涉及在同一天内共施用两种或更多种免疫抑制药物(例如，强的松、霉酚酸酯(MMF)和/或西罗莫司(即，雷帕霉素))。可以在基因疗法施用之后以相同的剂量或经过调整的剂量继续使用这些药物中的一种或多种药物。根据需要，此类疗法可以持续约1周(7天)、约60天或更长时间。在某些实施例中，选择无他克莫司的方案。使用了另外的免疫抑制剂共疗法。用于此类共疗法的免疫抑制剂包含但不限于糖皮质激素、类固醇、抗代谢药、T细胞抑制剂、大环内酯类(例如，雷帕霉素或雷帕霉素类似物)以及细胞生长抑制剂，包含烷化剂、抗代谢药、细胞毒性抗生素、抗体或对免疫亲和素具有活性的药剂。免疫抑制剂可以包含氮芥(nitrogen mustard)、亚硝基脲(nitrosourea)、铂化合物、甲氨蝶呤(methotrexate)、硫唑嘌呤(azathioprine)、巯嘌呤(mercaptopurine)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、更生霉素(dactinomycin)、蒽环霉素(anthracycline)、丝裂霉素C(mitomycin C)、博来霉素(bleomycin)、光神霉素(mithramycin)、IL-2受体(CD25)或CD3定向抗体、抗IL-2抗体、环孢素(ciclosporin)、他克莫司(tacrolimus)、西罗莫司(sirolimus)、IFN-β、IFN-γ、阿片类或TNF-α(肿瘤坏死因子-α)结合剂。在某些实施例中，在基因疗法施用之前，免疫抑制疗法可以在基因疗法施用前0、1、2、7或更多天开始，或在基因疗法施用后0、1、2、3、7或更多天开始。

用于此类共疗法的免疫抑制剂包含但不限于糖皮质激素、类固醇、抗代谢药、T细胞抑制剂、大环内酯类(例如，雷帕霉素或雷帕霉素类似物)以及细胞生长抑制剂，包含烷化剂、抗代谢药、细胞毒性抗生素、抗体或对免疫亲和素具有活性的药剂。免疫抑制剂可以包含氮芥(nitrogen mustard)、亚硝基脲(nitrosourea)、铂化合物、甲氨蝶呤(methotrexate)、硫唑嘌呤(azathioprine)、巯嘌呤(mercaptopurine)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、更生霉素(dactinomycin)、蒽环霉素(anthracycline)、丝裂霉素C(mitomycin C)、博来霉素(bleomycin)、光神霉素(mithramycin)、IL-2受体(CD25)或CD3定向抗体、抗IL-2抗体、环孢素(ciclosporin)、他克莫司(tacrolimus)、西罗莫司(sirolimus)、IFN-β、IFN-γ、阿片类或TNF-α(肿瘤坏死因子-α)结合剂。在某些实施例中，免疫抑制疗法可以在基因疗法施用前0、1、2、7或更多天开始，或在基因疗法施用后0、1、2、3、7或更多天开始。此类疗法可以涉及在同一天内共施用两种或更多种药物(例如，强的松、霉酚酸酯(MMF)和/或西罗莫司(即，雷帕霉素))。可以在基因疗法施用之后以相同的剂量或经过调整的剂量继续使用这些药物中的一种或多种药物。根据需要，此类疗法可以持续约1周(7天)、约60天或更长时间。在某些实施例中，选择无他克莫司的方案。

5.1基因疗法载体

rAAV.hLDLR载体应具有对肝脏的向性(例如，带有AAV8衣壳的rAAV)，并且hLDLR转基因应受肝脏特异性表达控制元件的控制。在适合人类受试者输注的缓冲液/载剂中调配载体。缓冲液/载剂应包含防止rAAV粘附到输液管道上但不干扰rAAV体内结合活性的组分。

5.1.1.rAAV.hLDLR载体

可以使用具有肝脏向性的许多rAAV载体中的任一种。可以被选择为rAAV衣壳来源的AAV实例包含，例如rh10、AAVrh64R1、AAVrh64R2、rh8[参见例如美国公开专利申请第2007-0036760-A1号；美国公开专利申请第2009-0197338-A1号；EP 1310571]。还参见WO2003/042397(AAV7和其它猿猴AAV)、美国专利7790449和美国专利7282199(AAV8)、WO2005/033321和US 7,906,111(AAV9)、WO 2006/110689和WO 2003/042397(rh10)、AAV3B；US2010/0047174(AAV-DJ)。

hLDLR转基因可以包含但不限于由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:4提供的序列中的一个或多个序列，所述序列在所附序列表中提供并且以引用方式并入本文。关于SEQ ID NO:1，这些序列包含位于约碱基对188到约碱基对250处的信号序列，以及变体1的成熟蛋白跨越约碱基对251到约碱基对2770。SEQ ID NO:1还可以标识外显子，所述外显子中的至少一个外显子不存在于hLDLR的已知替代性剪接变体中。另外或任选地，可以选择编码其它hLDLR同种型中的一种或多种的序列。参见例如同种型2、3、4、5和6，所述同种型的序列是可从例如uniprot.org/uniprot/P01130获得。例如，常见变体缺乏SEQ ID NO:1的外显子4((bp(255)..(377))或外显子12(bp(1546)..(1773))。任选地，转基因可以包含具有异源信号序列的成熟蛋白的编码序列。SEQ ID NO:2提供了人类LDLR和翻译的蛋白质(SEQID NO:3)的cDNA。SEQ ID NO:4提供了人类LDLR的经工程化的cDNA。可替代地或另外，可以使用基于web或可商购的计算机程序以及基于服务的公司将氨基酸序列回译为核酸编码序列，包含RNA和/或cDNA两者。参见例如通过EMBOSS，ebi.ac.uk/Tools/st/；GeneInfinity(geneinfinity.org/sms-/sms_backtranslation.html)；ExPasy(expasy.org/tools/)的反向翻译序列。

在下文实例中描述的具体实施例中，基因疗法载体是在肝脏特异性启动子(甲状腺素结合球蛋白，TBG)控制下表达hLDLR转基因的AAV8载体，称为rAAV8.TBG.hLDLR(参见图6)。外部AAV载体组件是由比率为1:1:18的三种AAV病毒蛋白VP1、VP2和VP3的60个拷贝组成的血清型8，T＝1的二十面体衣壳。衣壳含有单链DNA rAAV载体基因组。

rAAV8.TBG.hLDLR基因组含有侧接有两个AAV反向末端重复序列(ITR)的hLDLR转基因。hLDLR转基因包含增强子、启动子、内含子、hLDLR编码序列和聚腺苷酸化(polyA)信号。ITR是负责载体制备期间基因组的复制和包装的基因元件，并且是产生rAAV所需的唯一病毒顺式元件。hLDLR编码序列的表达从肝细胞特异性TBG启动子驱动。α1微球蛋白/双库尼茨抑制剂增强子元件的两个拷贝位于TBG启动子之前以刺激启动子活性。存在嵌合内含子以进一步增强表达，并且兔β球蛋白聚腺苷酸化(polyA)信号被包含以介导hLDLR mRNA转录物的终止。

本文描述的说明性质粒和载体使用肝脏特异性启动子甲状腺素结合球蛋白(TBG)。可替代地，可以使用其它肝脏特异性启动子[参见例如，肝脏特异性基因启动子数据库(The Liver Specific Gene Promoter Database),泉港实验室(Cold Spring Harbor),http://rulai.schl.edu/LSPD,α-1抗胰蛋白酶(A1AT)；人白蛋白，Miyatake等人,《病毒学杂志(J.Virol.)》,71:5124 32(1997),humAlb；以及乙型肝炎病毒核心启动子，Sandig等人,《基因治疗(Gene Ther.)》,3:1002 9(1996)]。TTR最小增强子/启动子、α-抗胰蛋白酶启动子、LSP(845nt)25(需要无内含子scAAV)。尽管不太期望，但可以在本文描述的载体中使用如病毒启动子、组成型启动子、可调控的启动子[参见例如WO 2011/126808和WO 2013/04943]或响应于生理线索启动子等的其它启动子。

除启动子之外，表达盒和/或载体还可以含有其它合适的转录起始、终止、增强子序列、如剪接和聚腺苷酸化(polyA)信号等有效RNA加工信号；稳定胞质mRNA的序列；增强转译效率的序列(即，Kozak共有序列)；增强蛋白稳定性的序列；以及在期望时，增强经过编码的产物的分泌的序列。合适的polyA序列的实例包含例如SV40、牛生长激素(bGH)和TKpolyA。合适的增强子实例包含例如，α胎蛋白增强子、TTR最小启动子/增强子、LSP(TH结合球蛋白启动子/α1微球蛋白/双库尼茨抑制剂增强子)以及其它增强子。

这些控制序列“可操作地连接”到hLDLR基因序列。可以将表达盒工程化到用于产生病毒载体的质粒上。将表达盒包装到AAV病毒颗粒中所需的最小序列是与衣壳具有相同AAV来源或具有不同AAV来源(以产生AAV假型)的AAV 5'和3'ITR。在一个实施例中，来自AAV2的ITR序列或其缺失版本(ΔITR)是为了方便和加速监管批准而使用的。然而，可以选择来自其它AAV来源的ITR。在ITR的来源来自AAV2并且AAV衣壳来自另一个AAV来源的情况下，所得载体可以被称为假型的。通常，AAV载体的表达盒包括AAV 5'ITR、hLDLR编码序列和任何调控序列以及AAV 3'ITR。然而，这些元件的其它构型可以是合适的。已经描述了被称为ΔITR的5'ITR的缩短版本，其中缺失了D序列和末端解析位点(trs)。在其它实施例中，使用了全长AAV 5'和3'ITR。

缩写“sc”是指自身互补的。“自身互补AAV”是指具有其中由重组AAV核酸序列所携带的编码区已经被设计成形成分子内双链DNA模板的具有表达盒的质粒或载体。感染后，未等待细胞介导的第二条链合成，而是两条互补的半scAAV将缔合以形成易于立即复制和转录的一条双链DNA(dsDNA)。参见例如D M McCarty等人,“自身互补重组腺相关病毒(scAAV)载体独立于DNA合成而促进高效转导(Self-complementary recombinant adeno-associated virus(scAAV)vectors promote efficient transduction independentlyof DNA synthesis)”,《基因疗法》,(2001年8月),第8卷,第16期,第1248-1254页。自身互补AAV在例如美国专利第6,596,535号、第7,125,717号和第7,456,683号中描述，所述美国专利中的每个美国专利通过全文引用的方式并入本文。

5.1.2rAAV.hLDLR调配物

rAAV.hLDLR调配物是含有有效量的悬浮在水溶液中的rAAV.hLDLR载体的悬浮液，所述水溶液含有缓冲盐水、表面活性剂和生理学上相容的盐或调节到离子强度相当于约100mM氯化钠(NaCl)到约250mM氯化钠的盐混合物，或调节到相等离子浓度的生理学上相容的盐。在一个实施例中，所述调配物可以含有例如约1.5×10¹¹GC/kg到约6×10¹³GC/kg或约1×10¹²到约1.25×10¹³GC/kg，如通过例如在M.Lock等人,《人类基因疗法(Hum Gene TherMethods)》,2014年4月；25(2):115-25.doi:10.1089/hgtb.2013.131.Epub 2014年2月14日中所述的优化qPCR(oqPCR)或数字微滴PCR(ddPCR)所测量的，所述文献通过引用并入本文。例如，本文提供的悬浮液可以含有NaCl和KCl。pH可以在6.5到8或7到7.5的范围内。合适的表面活性剂和其组合可以选自泊洛沙姆，即非离子型三嵌段共聚物，所述非离子型三嵌段共聚物由与聚氧乙烯(聚(环氧乙烷))的两个亲水链侧接的聚氧丙烯(聚(环氧丙烷))的中心疏水链、SOLUTOL HS 15(聚乙二醇-15羟基硬脂酸酯)、LABRASOL(聚氧辛酸甘油酯)、聚氧10油醚、TWEEN(聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯)、乙醇和聚乙二醇构成。在一个实施例中，调配物含有泊洛沙姆。这些共聚物通常用字母“P”(代表泊洛沙姆)后跟三个数字命名：前两位数字×100给出了聚氧丙烯核的近似分子量，并且最后一位数字×10给出了聚氧乙烯含量的百分比。在一个实施例中，选择了泊洛沙姆188。表面活性剂可以以悬浮液的至多约0.0005％到约0.001％的量存在。在一个实施例中，rAAV.hLDLR调配物是含有至少1×10¹³个基因组拷贝(GC)/mL或更多的悬浮液，如通过例如在M.Lock等人,《人类基因疗法》，2014年4月；25(2):115-25.doi:10.1089/hgtb.2013.131.Epub 2014年2月14日中所述的oqPCR或数字微滴PCR(ddPCR)所测量的，所述文献通过引用并入本文。在一些实施例中，载体悬浮在含有180mM氯化钠、10mM磷酸钠、0.001％泊洛沙姆188的pH为7.3的水溶液中。调配物适用于在人类受试者中使用并且静脉内施用。在一个实施例中，调配物经由外周静脉在20分钟以内(±5分钟)通过输注递送。然而，此时间可以根据需要或期望进行调整。

为了确保施用于患者的AAV.hLDLR的剂量中去除了空衣壳，在载体纯化过程期间例如使用第8.3.2.5节中详细讨论的氯化铯梯度超速离心将空衣壳与载体颗粒分离。在一个实施例中，使用2016年12月9日提交的国际专利申请第PCT/US16/65976号、2016年4月13日提交的美国专利申请第62/322,093号和于2015年12月11日提交并且题为“用于AAV8的可扩展纯化方法(Scalable Purification Method for AAV8)”的美国专利申请第62/266,341号中描述的工艺从空衣壳中纯化含有包装基因组的载体颗粒，所述文献通过引用并入本文。简单来说，描述了两步纯化方案，所述方案从rAAV产生细胞培养物的澄清、浓缩上清液中选择性地捕获和分离含有基因组的rAAV载体颗粒。。所述工艺利用在高盐浓度下执行的亲和力捕获方法，然后利用在高pH下执行的阴离子交换树脂方法，以产生基本上不含rAAV中间体的rAAV载体颗粒。在某些实施例中，所述方法从基因组缺陷(空)AAV8衣壳中间体中分离出含有包括药理活性基因组序列的DNA的AAV8病毒颗粒。所述方法涉及：(a)形成加载悬浮液，所述加载悬浮液包括：被纯化以从在其中产生颗粒和中间体的AAV生产细胞培养物中去除非AAV材料的重组AAV8病毒颗粒和空AAV8衣壳中间体；以及缓冲液A，所述缓冲液A包括20mMBis-Tris丙烷(BTP)并且pH为约10.2；(b)将(a)的悬浮液加载到强阴离子交换树脂上，所述树脂位于容器中，所述容器具有供悬浮液和/或溶液流动的入口和允许洗出液从所述容器流动的出口；(c)用1％的缓冲液B洗涤加载的阴离子交换树脂，所述缓冲液包括10mM NaCl和20mM BTP，其中pH为约10.2；(d)向经加载和经洗涤的阴离子交换树脂施加增加的盐浓度梯度，其中所述盐梯度范围为10mM到约190mM NaCl(包含端点)或等同范围；以及(e)收集来自洗出液的rAAV颗粒，所述rAAV颗粒是从中间体中纯化的。

在一个实施例中，使用的pH是10到10.4(约10.2)并且rAAV颗粒至少约50％到约90％纯化自AAV8中间体，或者pH为10.2并且至少约90％到约99％纯化自AAV8中间体。在一个实施例中，这是通过基因组拷贝确定的。当原液中的rAAV8颗粒占原液中的rAAV8的至少约75％到约100％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％并且“空衣壳”占原液或制剂中的rAAV8的小于约1％、小于约5％、小于约10％、小于约15％时，rAAV8颗粒(经包装的基因组)的原液或制剂“基本上不含”AAV空衣壳(和其它中间体)。

在一个实施例中，调配物的特征在于“空”与“完整”的比率为1或更小(优选地小于0.75、更优选地0.5、优选地小于0.3)的rAAV原液。

在另外的实施例中，rAAV颗粒的平均产率为至少约70％。这可以通过确定加载到柱上的混合物中的效价(基因组拷贝)以及最终洗脱中存在的量来计算。进一步地，这些可以根据如本文中描述的q-PCR分析和/或SDS-PAGE技术或本领域中已经描述过的那些来确定。

例如，为了计算空颗粒和完整颗粒的含量，将所选样品(例如，经过碘克沙醇(iodixanol)梯度纯化的制剂，其中GC#＝颗粒#)的VP3带体积相对于加载的GC颗粒进行作图。所得线性等式(y＝mx+c)用于计算测试品峰的带状体积中的颗粒的数量。然后将加载的每20μL颗粒数量(pt)乘以50，以得到颗粒(pt)/mL。将Pt/mL除以GC/mL得到颗粒与基因组拷贝的比率(pt/GC)。Pt/mL-GC/mL得到空pt/mL。空pt/mL除以pt/mL并且×100得到空颗粒的百分比。

通常，用于测定具有包装的基因组的空衣壳和AAV载体颗粒的方法是本领域已知的。参见例如Grimm等人,《基因疗法》(1999)6:1322-1330；Sommer等人,《分子疗法(Molec.Ther.)》(2003)7:122-128。为了测试变性的衣壳，所述方法包含使经过处理的AAV原液经受SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(由能够分离三种衣壳蛋白的任何凝胶组成，例如在缓冲液中含有3-8％三乙酸盐的梯度凝胶)，然后运行凝胶直到分离出样品材料，并且将凝胶印迹到尼龙或硝酸纤维素膜(优选地是尼龙)上。然后，将抗AAV衣壳抗体用作与变性的衣壳蛋白结合的初级抗体，优选地抗AAV衣壳单克隆抗体，最优选地B1抗AAV2单克隆抗体(Wobus等人,《病毒学杂志》(2000)74:9281-9293)。然后使用次级抗体，所述次级抗体与初级抗体结合并且含有一种用于检测与初级抗体的结合的装置，更优选地是含有与其共价结合的检测分子的抗IgG抗体，最优选地是与辣根过氧化物酶共价连接的绵羊抗小鼠IgG抗体。一种用于检测结合的方法用于半定量地确定初级抗体与次级抗体之间的结合，优选地是能够检测放射性同位素发射、电磁辐射或比色变化的检测方法，最优选地是化学发光检测试剂盒。例如，对于SDS-PAGE，可以从柱级分组中采集样品并在含有还原剂(例如，DTT)的SDS-PAGE上样缓冲液中加热，并且在预制的梯度聚丙烯酰胺凝胶(例如，Novex)上解析衣壳蛋白。银染色可以使用SilverXpress(英杰公司(Invitrogen),加利福尼亚(CA))根据制造商说明进行。在一个实施例中，可以通过定量实时PCR(Q-PCR)测量柱级分中的AAV载体基因组(vg)的浓度。将样品稀释并用DNase I(或另一种合适的核酸酶)消化以去除外源性DNA。在核酸酶失活后，使用引物和对引物之间的DNA序列具有特异性的TaqMan^TM荧光探针进一步稀释和扩增样品。在Applied Biosystems Prism 7700序列检测系统上测量每种样品达到定义的荧光水平所需的周期的数量(阈值周期，Ct)。含有与AAV载体中所含序列相同的序列的质粒DNA用于在Q-PCR反应中产生标准曲线。从样品获得的周期阈值(Ct)的值用于通过相对于质粒标准曲线的Ct值对其进行归一化来确定载体基因组效价。也可以使用基于数字PCR的端点测定。

一方面，本文提供了经过优化的q-PCR方法，所述方法利用了广谱丝氨酸蛋白酶，例如，蛋白酶K(如可从凯杰公司(Qiagen)商购获得)。更具体地，经过优化的qPCR基因组效价测定与标准测定类似，不同之处在于在DNase I消化之后，将样品用蛋白酶K缓冲液稀释并用蛋白酶K处理，然后进行热失活。合适地，以等于样品大小的量用蛋白酶K缓冲液稀释样品。蛋白酶K缓冲液可以浓缩2倍或更多倍。通常，蛋白酶K处理为约0.2mg/mL，但是可以在0.1g/mL到约1mg/mL之间变化。处理步骤通常在约55℃下进行持续约15分钟，但是可以在较低温度(例如，约37℃到约50℃)下进行持续较长的时间段(例如，约20分钟到约30分钟)，或者在较高的温度(例如，最高约60℃)下进行持续较短的时间段(例如，约5到10分钟)。类似地，热失活通常在约95℃下持续约15分钟，但是温度可以降低(例如，约70℃到约90℃)并且时间延长(例如，约20分钟到约30分钟)。然后将样品稀释(例如，1000倍)，并如标准测定中所描述的进行TaqMan分析。

另外地或可替代地，可以使用液滴数字PCR(ddPCR)。例如，已经描述了用于通过ddPCR确定单链和自身互补AAV载体基因组效价的方法。参见例如M.Lock等人,《人类基因疗法方法》2014年4月；25(2):115-25.doi:10.1089/hgtb.2013.131.Epub 2014年2月14日。

5.1.3制造

rAAV.hLDLR载体可以按照图11所述流程图制造。简单来说，细胞(HEK 293细胞)在合适的细胞培养系统中繁殖并且进行转染以产生载体。然后可以收获、浓缩并纯化rAAV.hLDLR载体，以制备然后在下游过程中填充和完成的大量载体。

用于制造本文所描述的基因疗法载体的方法包含本领域众所周知的方法，如产生用于产生基因疗法载体的质粒DNA、产生载体以及纯化载体。在一些实施例中，基因疗法载体是AAV载体，并且所产生的质粒是对AAV基因组和所关注的基因进行编码的AAV顺式质粒、含有AAV rep和cap基因的AAV反式质粒以及腺病毒辅助质粒。载体产生过程可以包含方法步骤，如开始细胞培养、进行细胞传代、接种细胞、用质粒DNA转染细胞、将转染后培养基交换为无血清培养基以及收获含载体的细胞和培养基。所收获的含载体的细胞和培养基在本文中被称为粗细胞收获物。

此后，粗细胞收获物可以是本主题的方法步骤，如浓缩载体收获物、渗滤载体收获物、微流化载体收获物、核酸酶消化载体收获物、过滤经过微流化的中间体、通过色谱纯化、通过超速离心纯化、通过切向流过滤进行缓冲液交换和调配和过滤以制备大量载体。

在某些实施例中，可以结合其它AAV生产细胞使用与图11的那些方法类似的方法。本领域已知用于产生rAAV载体的许多方法，包含转染、稳定细胞系产生以及包含腺病毒-AAV杂交体、疱疹病毒-AAV杂交体和杆状病毒-AAV杂交体的传染性杂交体病毒产生系统。参见例如G Ye等人,《人类基因治疗的临床开发(Hu Gene Ther Clin Dev)》,25:212-217(2014年12月)；RM Kotin,Hu Mol Genet,2011,第20卷,修订发行1，R2-R6；M.Mietzsch等人,《人类基因疗法》,25:212-222(2014年3月)；T Virag等人,《人类基因疗法》,20:807-817(2009年8月)；N.Clement等人,《人类基因疗法》,20:796-806(2009年8月)；DL Thomas等人,《人类基因疗法》,20:861-870(2009年8月)。用于产生rAAV病毒颗粒的rAAV产生培养都需要：1)在杆状病毒产生系统的情况下，合适的宿主细胞，包含例如如HeLa、A549或293细胞等人源性细胞系，或者如SF-9等昆虫源性细胞系；2)由野生型或突变型腺病毒(如温度敏感腺病毒)、疱疹病毒、杆状病毒或提供反式或顺式辅助功能的核酸构建体提供的合适的辅助病毒功能；3)功能AAV rep基因、功能cap基因和基因产物；4)侧接有AAV ITR序列的转基因(如治疗性转基因)；以及5)用于支持产生rAAV的合适的培养基和培养基组成。

已经描述了用于在AAV产生中使用的各种合适的细胞和细胞系。细胞本身可以选自任何生物有机体，包含原核(例如，细菌)细胞和真核细胞，包含昆虫细胞、酵母细胞和哺乳动物细胞。特别期望的宿主细胞选自任何哺乳动物物种，包含但不限于如A549、WEHI、3T3、10T1/2、BHK、MDCK、COS 1、COS 7、BSC 1、BSC 40、BMT 10、VERO、WI38、HeLa、HEK 293细胞(表达功能性腺病毒E1)、Saos、C2C12、L细胞、HT1080、HepG2和源自哺乳动物(包含人类、猴子、小鼠、大鼠、兔和仓鼠)的原代成纤维细胞、肝细胞和成肌细胞等的细胞。在某些实施例中，细胞是悬浮适应的细胞。对提供所述细胞的哺乳动物物种的选择不是对本发明进行限制；也不是对哺乳动物细胞类型，即成纤维细胞、肝细胞、肿瘤细胞等进行限制。

在具体实施例中，下文第8节的实例3中描述了用于制造基因疗法载体的方法。

5.2患者群体

作为治疗候选者的患者优选地是被诊断为患有携带两个LDLR基因突变的HoFH的成年人(年龄≥18岁的男性或女性)；即，在符合HoFH的临床表现的背景下，在两个等位基因处都具有分子定义的LDLR突变的患者，所述临床表现可以包含未经过治疗的LDL-C水平(例如，LDL-C水平>300mg/dl)、经过治疗的LDL-C水平(例如，LDL-C水平<300mg/dl)和/或总血浆胆固醇水平大于500mg/dl以及过早和侵袭性动脉粥样硬化。在一些实施例中，可以治疗<18岁的患者。在一些实施例中，治疗的患者是年龄≥18岁的男性。在一些实施例中，治疗的患者是年龄≥18岁的女性。治疗候选者包含正在进行利用降脂药物，如他汀类药物、依泽替米贝、胆汁酸螯合剂、PCSK9抑制剂进行的治疗和LDL和/或血浆单采术的HoFH患者。

治疗之前，应评估HoFH患者的用于递送hLDLR基因的针对AAV血清型的NAb。此类NAb会干扰转导效率并降低治疗功效。基线血清NAb效价≤1:10的HoFH患者是利用rAAV.hLDLR基因疗法方案进行治疗的良好候选者。然而，在某些情况下可以选择具有更高比率的患者。血清NAb效价>1:5的HoFH患者的治疗可能需要组合疗法，如用免疫抑制剂的临时共治疗，尽管可以为具有更低比率的患者选择此类疗法。用于此类共疗法的免疫抑制剂包含但不限于类固醇、抗代谢物、T细胞抑制剂和烷化剂。例如，此类临时治疗可以包含以逐渐减少的剂量，以约60mg开始并且以10毫克/天减少(第7天不给药)的量每天给药类固醇(例如，强的松)一次，持续7天。可以选择其它剂量和药物。

可以根据其护理医生的酌情决定，在基因疗法治疗之前或同时允许受试者继续其护理标准治疗(例如，LDL单采和/或血浆置换，以及其它降脂治疗)。在替代方案中，医生可能倾向于在实施基因疗法治疗前停止护理标准治疗，并且任选地在施用基因疗法后恢复护理标准治疗作为共治疗。基因疗法方案的期望终点是在施用基因疗法治疗之后至多12周低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)降低和LDL载脂蛋白B(apoB)的分级分解代谢率(FCR)从基线改变。其它期望的终点包含例如以下中的一个或多个的减少：总胆固醇(TC)、非高密度脂蛋白胆固醇(非HDL-C)、空腹甘油三酯(TG)的降低和HDL-C的变化(例如，增加的水平是期望的)、极低密度脂蛋白胆固醇(VLDL-C)、脂蛋白(a)(Lp(a))、载脂蛋白B(apoB)和/或载脂蛋白A-I(apoA-I)。

在一个实施例中，在研究持续时间内，在利用单独的和/或与使用附加治疗组合的AAV8.hLDLR进行治疗之后，患者达到期望的LDL-C阈值(例如，LDL-C<200mg/dl、<130mg/dl或<100mg/dl)。

在某些实施例中，患者对降脂疗法的需要(包含LDL和/或血浆单采术的频率)将降低。

在仍其它实施例中，与基线相比，可评估黄色瘤的数量、大小或程度将会减少。

然而，根据患者护理医生的判断，具有以下特性中的一个或多个特性的患者可以从治疗中被排除：

●由NYHA分类定义为功能性III级并且在基线访视后12周内有住院史或功能性IV级的心力衰竭。。

●基线访视后12周内的病史：心肌梗塞(MI)、导致住院的不稳定心绞痛、冠状动脉旁路移植手术(CABG)、经皮冠状动脉介入术(PCI)、不受控制的心律失常、颈动脉手术或支架植入术、中风、一过性缺血性发作、颈动脉血管重建术、血管内手术或手术干预。。

●以以下定义的不受控制的高血压：收缩压>180mmHg、舒张压>95mmHg。

●基于记录的组织学评估或非侵入性成像或测试的肝硬化或慢性肝病史。

●任何以下肝脏疾病的记录诊断：非酒精性脂肪肝炎(已经活检证实)、酒精性肝病、自身免疫性肝炎、肝癌、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、威尔逊氏病(Wilson's disease)、血色沉着病、α₁抗胰蛋白酶缺乏。

●筛查时异常的LFT(AST或ALT>2倍正常上限(ULN)和/或总胆红素>1.5倍ULN，除非患者因吉尔伯特综合征(Gilbert's syndrome)有未结合的高胆红素血症)。

●通过HepB SAg、Hep B核心Ab和/或病毒DNA的阳性定义的乙型肝炎，或通过HCVAb和病毒RNA的阳性定义的慢性活动性丙型肝炎。

●52周内酒精滥用史。

●已知具有潜在的肝毒性的某些违禁药物，特别是那些可引起微泡性或大泡性脂肪变性的药物。这些包含但不限于：异维甲酸(acutane)、胺碘酮、HAART药物、大量使用醋氨酚(2克/天>3×q周)、异烟肼、甲氨蝶呤、四环素、他莫昔芬、丙戊酸酯。

●活动性肺结核、全身性真菌疾病或其它慢性感染。

●免疫缺陷疾病史，包含阳性HIV测试结果。

●以估计的GRF<30毫升/分钟定义的慢性肾功能不全。

●过去5年内有癌症史，但经过充分治疗的基底细胞皮肤癌、鳞状细胞皮肤癌或原位宫颈癌除外。

●早前的器官移植。

●基线确定和/或治疗前3个月内进行任何重大外科手术。

基线血清AAV8 NAb效价>1:5，>1:10。在其它实施例中，护理医生可以确定这些身体特性(病史)中的一个或多个的存在不应妨碍本文提供的治疗。

5.3.给药和施用途径

患者接受例如在约20分钟到约30分钟内例如经过外周静脉通过输注施用的单剂量的rAAV.hLDLR。向患者施用的rAAV.hLDLR的剂量是2.5×10¹³GC/kg(如通过oqPCR或ddPCR测量的)。

在某些实施例中，预防性免疫调节与类固醇的共治疗在基因疗法前至少一天(第-1天)开始，或在基因疗法递送当天(第0天)开始，并持续到给药后约第8周。在某些实施例中，预防性共治疗在基因疗法递送前至少一天或在基因疗法递送同一天开始，并且以逐渐减少的剂量持续到给药后约第13周。任选地，预防性类固醇共疗法可以在载体给药前2或3天开始。在某些实施例中，对于第9周和第10周中的每周，所述剂量以10mg剂量减少/周逐渐减少，对于第11周、第12周和第13周中的每周，所述剂量以5mg剂量减少/周逐渐减少。在某些实施例中，当患者接受更低剂量(例如，约2.5×1012GC/kg到7.5×1012GC/kg)或更高剂量(如本文提供的剂量)时，还递送预防性类固醇方案。在某些实施例中，另一种皮质类固醇可以代替强的松。在此实例中，提供皮质类固醇当量剂量。例如，40mg强的松的合适替代品可以包含倍他米松(约6mg)、可的松(约200mg)、地塞米松(约6mg)、氢化可的松(160mg)、甲基强的松龙(约32mg)、强的松龙(约40mg)、或曲安奈德(约32mg)。可以确定其它免疫调节剂和剂量当量。

在某些实施例中，在给药之前一天(第-1天)开始给药。起始剂量是每天一次40mg强的松，在第9周时逐渐减少剂量，并持续到第13周结束。第一剂量应在第-1天在用研究载体预定给药前至少8小时给予。

强的松剂量与研究周

在某些实施例中，在使用强的松或剂量当量皮质类固醇的共疗法中，患者接受包括至少2.5×10¹²GC/kg或7.5×10¹²GC/kg或至少5×10¹¹GC/kg到约7.5×10¹²GC/kg(如通过oqPCR或ddPCR测量的)的共疗法。然而，可以选择其它剂量。

任选地，这种方案可以利用另外的免疫调节剂。在某些实施例中，此种另外的免疫调节剂在给药后引入。

在优选实施例中，使用的rAAV悬浮液具有的效力使得施用于HoFH(DKO小鼠)的双敲除LDLR-/-Apobec-/-小鼠模型的5×10¹¹GC/kg剂量使DKO小鼠的基线胆固醇水平降低25％到75％。

在一些实施例中，向患者施用的rAAV.hLDLR的剂量在2.5×10¹²GC/kg到7.5×10¹²GC/kg的范围内。优选地，使用的rAAV悬浮液具有的效力使得施用于HoFH(DKO小鼠)的双敲除LDLR-/-Apobec-/-小鼠模型的5×10¹¹GC/kg剂量使DKO小鼠的基线胆固醇水平降低25％到75％。在具体实施例中，向患者施用的rAAV.hLDLR的剂量为至少5×10¹¹GC/kg、2.5×10¹²GC/kg、3.0×10¹²GC/kg、3.5×10¹²GC/kg、4.0×10¹²GC/kg、4.5×10¹²GC/kg、5.0×10¹²GC/kg、5.5×10¹²GC/kg、6.0×10¹²GC/kg、6.5×10¹²GC/kg、7.0×10¹²GC/kg或7.5×10¹²GC/kg。

在一些实施例中，rAAV.hLDLR与一种或多种用于治疗HoFH的疗法组合施用。在一些实施例中，rAAV.hLDLR与用于治疗HoFH的标准降脂疗法组合施用，所述标准降脂疗法包含但不限于他汀类药物、依泽替米贝、厄泽迪亚(ezedia)、胆汁酸螯合剂、LDL单采术、血浆单采术、血浆置换、洛美他派、米泊美生和/或PCSK9抑制剂。在一些实施例中，AAV.hLDLR与烟酸组合施用。在一些实施例中，rAAV.hLDLR与贝特类药物组合施用。

5.4.测量临床目标

施用后基因疗法载体的安全性可以通过载体施用后至多约52周的多个时间点评估的不良事件的数量、体检记录的变化和/或临床实验室参数。虽然生理效应可以在早期(例如，在约1天到一周)观察到，但在一个实施例中，稳定状态水平的表达水平在约12周达到。

与基线相比，施用rAAV.hLDLR达到的LDL-C减少可以以在约12周或在其它期望时间点的LDL-C中的定义百分比变化进行评估。

也可以在约12周或在其它期望的时间点评估与基线值相比的其它脂质参数，特别是总胆固醇(TC)、非高密度脂蛋白胆固醇(非HDL-C)、HDL-C、空腹甘油三酯(TG)、极低密度脂蛋白胆固醇(VLDL-C)、脂蛋白(a)(Lp(a))、载脂蛋白B(apoB)和载脂蛋白A-I(apoA-I)的百分比变化，。可以通过在rAAV.hLDLR施用之前以及施用之后再过12个周执行LDL动力学研究来评估通过其减少LDL-C的新陈代谢机制。待评估的主要参数是LDL apoB的分级分解代谢率(FCR)。

如本文使用的，当患者表达足够水平的LDLR以达这些临床终点中的至少一个临床终点，本文的rAAV.hLDLR载体用活性LDLR“功能性地替代”或“功能性地补充”患者有缺陷的LDLR。在非FH患者体内实现低至约10％到小于100％的正常野生型临床终点水平的hLDLR的表达水平可以提供功能性替代。

在一个实施例中，可以早至给药后约8小时到约24小时观察到表达。可以在给药后若干天到若干周内观察到上述期望临床效果中的一种或多种临床效果。

可以在rAAV.hLDLR施用之后评估长期(高达260周)安全性和功效。

下文第6.4.1节至第6.7节描述的标准临床实验室评估和其它临床测定可用于监测不良事件、评估脂质参数变化百分比的功效终点、药效学评估、脂蛋白动力学、ApoB-100浓度以及对rAAV.hLDLR载体的免疫反应。

以下实例仅是说明性的，并且不旨在限制本发明。

实例

6.实例1：用于治疗人类受试者的方案

此实例涉及用于因低密度脂蛋白受体(LDLR)基因突变而患有经基因证实纯合性家族性高胆固醇血症(HoFH)的患者的基因疗法治疗。。在此实例中，向患有HoFH的患者施用基因疗法载体AAV8.TBG.hLDLR(一种表达hLDLR的复制缺陷型腺相关病毒载体8(AAV8))。可以使用低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平作为转基因表达的替代物来评估治疗功效。主要功效评估包含在治疗之后约12周时的LDL-C水平，以及其后至少52周内的持续效果。可以在治疗之后在肝活检样品中测量转基因表达的长期安全性和持续性。

6.1.基因疗法载体

基因疗法载体是在肝脏特异性启动子(甲状腺素结合球蛋白TBG)控制下表达转基因人类低密度脂蛋白受体(hLDLR)的AAV8载体，并且此实例中称为AAV8.TBG.hLDLR(参见图7)。AAV8.TBG.hLDLR载体由AAV载体活性成分和调配缓冲液组成。外部AAV载体组件是由比率为1:1:18的三种AAV病毒蛋白VP1、VP2和VP3的60个拷贝组成的血清型8，T＝1的二十面体衣壳。衣壳含有单链DNA重组AAV(rAAV)载体基因组。基因组含有侧接有两个AAV反向末端重复序列(IRT)的hLDLR转基因。增强子、启动子、内含子、hLDLR编码序列和聚腺苷酸化(polyA)信号包括hLDLR转基因。ITR是负责载体产生期间基因组的复制和包装的遗传元件，并且是产生rAAV所需的唯一病毒顺式元件。hLDLR编码序列的表达从肝细胞特异性TBG启动子驱动。α1微球蛋白/双库尼茨抑制剂增强子元件的两个拷贝位于TBG启动子之前以刺激启动子活性。存在嵌合内含子以进一步增强表达，并且兔β球蛋白聚腺苷酸化(polyA)信号被包含以介导hLDLR mRNA转录物的终止。SEQ ID NO:6提供了用于产生此载体的pAAV.TBG.PI.hLDLRco.RGB的序列。

试验药剂的调配物是于水溶液中的至少1×10¹³个基因组拷贝(GC)/mL并且在20分钟(±5分钟)内经由外周静脉通过输注施用，所述水溶液含有180mM氯化钠、10mM磷酸钠、0.001％泊洛沙姆188，pH为7.3。

6.2.患者群体

经过治疗的患者是携带LDLR基因的两种突变的患有纯合性家族性高胆固醇血症(HoFH)的成年人。患者可以是18岁或更年长的男性或女性。在与HoFH一致的临床表现的背景下，患者在两个等位基因处具有分子定义的LDLR突变，所述临床表现可以包含未经过治疗的LDL-C水平(例如LDL-C水平>300mg/dl)、经过治疗的LDL-C水平(例如LDL-C水平<300mg/dl)和/或血浆总胆固醇水平大于500mg/dl以及过早和侵袭性动脉粥样硬化。经过治疗的患者可以同时进行利用降脂药物，如他汀类药物、依泽替米贝、胆汁酸螯合剂、PCSK9抑制剂进行的治疗和LDL单采术和/或血浆单采术。

经过治疗的患者的基线血清AAV8中和抗体(NAb)效价可以≤1:10。如果患者的基线血清AAV8中和抗体(NAb)效价不≤1:10，则可以在转导时间段期间用免疫抑制剂对患者进行临时共治疗。在某些实施例中，具有AAV8中和抗体效价的患者可以更高(例如，≤1:5到≤1:15，或≤1:20)或更低(例如，≤1:2到≤1:5)。用于共疗法的免疫抑制剂包含但不限于类固醇、抗代谢物、T细胞抑制剂和烷化剂。

可以根据受试者的护理医生的酌情决定，在基因疗法治疗之前或与基因疗法治疗同时允许受试者继续其护理标准治疗(例如，LDL单采和/或血浆置换，以及其它降脂治疗)。在替代方案中，医生可能倾向于在施用基因疗法治疗前停止护理标准治疗，并且任选地在施用基因疗法后恢复护理标准治疗作为共疗法。基因疗法方案的期望终点是在施用基因疗法治疗之后至多约12周低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)降低和LDL载脂蛋白B(apoB)的分级分解代谢率(FCR)从基线改变。

在仍其它实施例中，期望终点包含对LDL单采术和/或血浆单采术的需要的降低是期望终点。术语“LDL单采术”用于指低密度脂蛋白(LDL)单采术，所述LDL单采术是使用类似于透析的过程从血液中去除LDL的过程。LDL单采术是从患者血液中去除LDL胆固醇的程序。在LDL单采术程序期间，血液细胞从血浆中分离。专用过滤器用于从血浆中去除LDL胆固醇，并且将经过滤的血液返回给患者。单一的LDL单采术治疗可以从血液中去除60％到70％的有害LDL胆固醇。目前有两种机器在美国获得了食品和药物管理局的批准。脂肪吸收器使用用葡聚糖覆盖的过滤器，所述葡聚糖附着到LDL并将LDL从循环中去除。其它机器被称为HELP，并且使用肝素来去除LDL。这些机器都不会引起HDL(有益的)胆固醇的量的显著变化。这些机器目前被批准用于LDL胆固醇为2000ng/mdl或更高的有冠状动脉疾病史的患者，以及LDL胆固醇为300mg/dl或更高的无冠状动脉疾病的患者。参见例如美国血浆透析协会(American Society for Apheresis),www.apheresis.com以及http://c.ymcdn.com/ sites/www.apheresis.org/resource/resmgr/-fact_sheets_file/ldl_apheresis.pdf。还参见世界血浆透析协会(World Apheresis Association)[http:// worldapheresis.org/]和国家脂质协会(The National Lipid Association)(美国)[https://www.lipid.org/]。在某些实施例中，可能已经在基因疗法治疗之前使用了对于LDL是非选择性的血浆单采术(血浆除去法)，并且可以减少对此治疗的需求，如本文针对LDL单采术所描述的。如本文使用的，单采术的“减少”是指患者被要求进行单采术的每个月和/或每年的次数的减少。与在rAAV8-hLDLR疗法之前使用的单采术的水平相比，这种减少可以是疗法之后单采术治疗减少10％、25％、50％、75％或100％(例如，消除需要)。例如，在利用rAAV8.hLDLR进行治疗前已经进行了每周一次单采术的患者在治疗之后可能只需要每两周一次、每月一次或更低频率的单采术。在另一实例中，在利用rAAV8.hLDLR进行治疗前已经进行了每个月两次的单采术的患者在治疗之后可能只需要每月一次、每两个月一次、每季度一次或更低频率的单采术。仍其它

在某些实施例中，期望终点包含用于治疗患者的PCSK9抑制剂的剂量的减少是期望终点。如本文使用的，单采术的“减少”是指患者被要求进行单采术的每个月和/或每年的次数的减少。与在rAAV8-hLDLR疗法之前使用的PCSK9抑制剂的水平相比，这种减少可以是在疗法之后所需的PCSK9抑制剂减少10％、25％、50％、75％或100％(例如，消除需要)。例如，治疗正在接受rAAV8.hLDLR疗法前每月一次输注PCSK9抑制剂(例如，接受300mg到500mg剂量)的HoFH患者可以产生将利用PCSK9抑制剂进行的治疗减少到与HeFH患者一致的治疗水平的能力。这可以使患者能够接受更少的侵入性疗法(例如，消除对高剂量输注的需要)。例如，代替每月输注420mg/次输注，患者可以选择使用注射器或自动注射器每月一次或每两周一次(HeFH剂量)或以更小的频率施用更少的剂量(例如100ng/mL到140ng/mL)。

6.3.给药和施用途径

患者接受经由外周静脉通过输注施用的单剂量的AAV8.TBG.hLDLR。施用于患者的AAV8.TBG.hLDLR的剂量为约2.5×10¹²GC/kg或7.5×10¹²GC/kg。为了确保空衣壳从施用于患者的AAV8.TBG.hLDLR的剂量中去除，如第8.3.2.5节所述，在载体纯化过程期间，通过氯化铯梯度超速离心或离子交换色谱法从载体颗粒中分离空衣壳。

6.4.测量临床目标

·施用AAV8.TBG.hLDLR实现的LDL-C降低可以以在约12周时LDL-C与基线相比的定义百分比变化来评估。

·可以在约12周时评估与基线值相比的其它脂质参数，特别是总胆固醇(TC)、非高密度脂蛋白胆固醇(非HDL-C)、HDL-C、空腹甘油三酯(TG)、极低密度脂蛋白胆固醇(VLDL-C)、脂蛋白(a)(Lp(a))、载脂蛋白B(apoB)和载脂蛋白A-I(apoA-I)的变化百分比。

·LDL-C降低的代谢机制可以通过在载体施用前和再次在施用后约12周时进行LDL动力学研究来评估。待评估的主要参数是LDL apoB的分级分解代谢率(FCR)。

·可以在施用AAV8.TBG.hLDLR之后评估长期(至多52周或至多260周)安全性和功效。

6.4.1.可以执行的标准临床实验室评估：

以下临床特性可以在治疗之前和之后测试：

·生化特性：钠、钾、氯、二氧化碳、葡萄糖、血尿素氮、乳酸脱氢酶(LDH)肌酐、肌酐磷酸激酶、钙、总蛋白、白蛋白、天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)、碱性磷酸酶、总胆红素、GGT。

·CBC：白细胞(WBC)计数、血红蛋白、红细胞比容、血小板计数、红细胞分布宽度、平均红细胞体积、平均红细胞血红蛋白和平均红细胞血红蛋白浓度。

·凝结：PT、INR、PTT(在筛查和基线时，以及根据需要)。

·尿液分析：尿液颜色、浊度、pH、葡萄糖、胆红素、酮、血液、蛋白质、WBC。

6.4.2.所关注的不良事件

以下临床测定可以用于监测毒性：

·肝损伤

○胆红素或肝酶(AST、ALT、AlkPhos)的CTCAE v4.0 3级或更高的实验室结果。

○胆红素和AlkPhos CTCAE v4.0 2级(胆红素>1.5倍ULN；AlkPhos>2.5倍ULN)。

·肝毒性(即满足“海氏法则(Hy's law)”的标准)

○AST或ALT≥3×ULN(正常上限)

○在无碱性磷酸酶升高的情况下>2×ULN血清总胆红素

○没有其它原因可以解释转氨酶水平的升高和总胆红素的升高。

另外，可以触发用于假定的T细胞介导的免疫转氨作用的皮质类固醇疗法的ALT或AST升高(>2倍基线和1倍ULN)将被标记和报告。

6.5.功效终点

可以评估施用AAV8.TBG.hLDLR后约12周时脂质参数的变化百分比的评估并将其与基线比较。这包含：

●直接测量的LDL-C的百分比变化(主要功效终点)。

●总胆固醇、VLDL-C、HDL-C、计算的非HDL-胆固醇的百分比变化、甘油三酯、apoA-I、apoB和Lp(a)的变化。

基线LDL-C值可以以AAV8.TBG.hLDLR施用前在2个单独情形下于空腹条件下获得的LDL-C水平的平均值进行计算，以控制实验室和生物变异度并确保可靠的功效评估。

6.5.1.药效学/功效评估

以下功效实验室测试可以在空腹条件下评估：

·直接测量的LDL-C

·脂质组：总胆固醇、LDL-C、非HDL-C、HDL-C、TG、Lp(a)

·载脂蛋白：apoB和apoA-I。

另外，任选的LDL apoB动力学可以在治疗前和治疗后12周确定。可以在载体施用后约12周、24周和52周时以相对于基线的百分比变化来评估脂质降低功效。基线LDL-C值是通过对施用前在2个单独情形下于空腹条件下获得的LDL-C水平进行平均来计算的。载体施用后12周LDL-C的基线变化百分比是基因转移功效的主要量度。

·到载体施用后12周LDL-apoB分级分解代谢率相对于基线的变化。另外的apoB动力学参数也将被考虑。

·在施用AAV8.hLDLR后12周、24周、52周和每年至多260周时的绝对LDL-C水平。

·在施用AAV8.hLDLR后24周、52周和每年至多260周时LDL-C和其它脂质参数相对于基线的变化百分比。

·在施用AAV8.hLDLR后12周、24周、52周时实现绝对LDL-C水平<200mg/dl的受试者的百分比。

·在施用AAV8.hLDLR后12周、24周、36周、52周未恢复既往服用或未开始任何新的降脂治疗的受试者的数量。

·对于那些在筛查前接受脂质单采术的受试者，在研究期间任何时间经历单采术治疗频率变化的受试者的数量。

·对于那些接受PCSK9抑制剂的受试者，在施用AAV8.hLDLR后实现的LDL-C与施用AAV8.hLDLR之前使用PCSK9抑制剂时实现的LDL-C的比较。

·对于基线时容易描述黄色瘤的受试者，在施用AAV8.hLDLR后12周和52周记录的临床表现在数量、大小或程度上有所改善的数量。

6.6.脂蛋白动力学

脂蛋白动力学研究可以在载体施用前和再次在施用后12周后进行，以评估LDL-C降低的代谢机制。待评估的主要参数是LDL-apoB的分级分解代谢率(FCR)。apoB的内源性标记是通过静脉输注氘化亮氨酸，然后在48小时时间段内进行血液采样来实现的。

6.6.1.ApoB-100分离

VLDL、IDL和LDL通过对D3-亮氨酸输注后抽取的定时样品进行依次超速离心来分离。。使用Tris-甘氨酸缓冲系统，通过制备型十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)从这些脂蛋白中分离Apo B-100。。通过酶联免疫吸附测定(ELISA)确定单独的ApoB物种内的ApoB浓度。使用自动比浊测定来确定总apoB浓度。

6.6.2同位素富集确定

将ApoB-100条带从聚丙烯酰胺凝胶中切除。切除的条带在100℃下于12N HCl中水解24小时。在使用气相色谱仪/质谱仪分析之前，氨基酸被转化为N-异丁基酯和N-七氟丁酰胺衍生物。同位素富集(百分比)是根据观察到的离子流比率来计算的。这种格式的数据类似于放射性示踪剂实验中的比放射性。假设每个受试者在此程序中相对于apoB-100代谢保持稳定状态。

6.7.药代动力学和对AAV8的免疫反应评估

以下测试可以用于评估AAV载体的药代动力学、对AAV载体的预免疫和对AAV载体的免疫反应：

·免疫反应监测：AAV8 NAb效价；T细胞对AAV8载体的反应；T细胞对hLDLR的反应。

·载体浓度：通过PCR以载体基因组的形式测量的血浆中的AAV8浓度。

·人类白细胞抗原分型(HLA型)：通过I类HLA-A、HLA-B、HLA-C和II类HLA DRB1/DRB345、DQB1和DPB1的高分辨率评估，从外周血单核细胞(PBMC)的脱氧核糖核酸(DNA)中评估HLA型。此信息允许T细胞对AAV8衣壳或具有特定HLA等位基因的LDLR基因的潜在免疫反应相关联，从而有助于解释T细胞反应的强度和定时的个体变异性。

6.8黄色瘤评估

身体检查包含鉴别、检查和描述任何黄原瘤。确定了黄色瘤位置和类型的记录，即皮肤的、眼睑(眼)的、结节状的和/或腱状的。在可能的情况下，在身体检查期间使用公制尺或卡尺来记录黄色瘤的大小(最大和最小范围)。如果可能，可以在将卷尺(毫米公制)放置在病变附近的情况下拍摄最广泛和易于鉴别的黄色瘤的数码照片。

7.实例2：临床前数据

进行了非临床研究以研究AAV8.TBG.hLDLR对HoHF和预先存在的体液免疫的动物模型的效果。在测量胆固醇的降低的小型和大型动物模型中进行了多次单剂量药理学研究。此外，在双敲除LDLR-/-Apobec1-/-小鼠模型(DKO)中测量动脉粥样硬化的消退，所述模型同时缺乏LDLR和Apobec1，甚至在饮食中，由于含有apob-100的LDL的升高而导致严重的高胆固醇血症，并发展为广泛的动脉粥样硬化。这些数据用于确定最小有效剂量，并充分证明人体研究的剂量选择性。为了进一步表征适合人类研究的剂量并标识潜在的安全信号，在非人类灵长类动物(NHP)和HoFH的小鼠模型中进行了毒理学研究。

7.1预先存在的体液免疫：对AAV介导的基因向肝脏转移的影响

本研究的目的是评估在恒河猴和食蟹猴中对AAV的预先存在的体液免疫对肝脏定向基因转移的影响。二十一只恒河猴和食蟹猴选自较大的动物群体，所述动物群体针对对AAV8的预先存在的免疫的水平进行了预先筛选。动物年龄分布广泛并且均为雄性。这些研究集中在中和抗体(NAb)水平低到无法检测的动物，同时包含更有限的数量，其中AAV8 Nab效价高达1:160。通过外周静脉输注向动物输注3×10¹²GC/kg的AAV8载体，所述载体表达来自肝脏特异性甲状腺素结合球蛋白(TBG)启动子的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)。7天后对动物进行尸检，并且评估组织的EGFP表达和AAV8载体基因组的肝靶向性(图1)。使用体外转导抑制测定以及在被动转移试验的上下文中评估NHP血清中AAV8的预先存在的NAb，其中在载体施用之前和施用载体时，来自NHP的血清被输注到小鼠中，以评估预先存在AAV8 NAb对体内肝脏定向基因转移的影响(Wang等人,2010,《分子疗法(Molecular Therapy)》18(1):126-134)。

如通过荧光显微镜术的EGFP检测(图1)和ELISA以及肝脏中载体DNA定量所证明的，对AAV8的预先存在的Nab的水平低至无法检测的动物在肝脏中表现出高水平的转导。就HoFH的功效而言，最有用的转导度量是被转导的肝细胞的百分比，其在没有预先存在的NAb的情况下是17％(4.4％至40％的范围)。这与以相同剂量的载体在小鼠中观察到的效率非常接近。显著影响肝细胞转导的预先存在的Nab的T阈值效价≤1:5(即效价为1:10或更大明显减少转导)。抗体介导的肝脏转导抑制与肝脏中AAV基因组的减少直接相关。对人血清进行了筛查，以寻找对AAV8的预先存在的NAb的证据，并且结果显示，约15％的成年人具有的对AAV8的NAb超过≤1:5。此外，已证明更高水平的NAb与载体生物分布的变化有关，使得NAb减少了肝脏基因转移，同时增加了载体基因组沉积到脾脏中，而没有增加脾脏转导。

7.2AAV8.TBG.mLDLR对HoFH的小鼠模型中血清胆固醇的影响

向DKO小鼠(6到12周龄雄性)IV注射AAV8.TBG.mLDLR，并随后进行预先存在的动脉粥样硬化病变的代谢纠正和逆转。还评估动物的总体临床毒性和血清转氨酶异常。LDLR的小鼠版本用于载体施用到DKO小鼠中。

接受了10¹¹GC/小鼠(5×10¹²GC/kg)的小鼠显示高胆固醇血症几乎完全恢复正常，其稳定持续180天(图2)。在啮齿动物中，以最高剂量注射载体后至多6个月，没有观察到ALT水平升高或肝脏生化异常(Kassim等人,2010,《公共科学图书馆·综合(PLoS One)》5(10):e13424)。

7.3AAV8.TBG.mLDLR对高脂饮食的小鼠模型中的动脉粥样硬化病变的影响

考虑到AAV8介导的LDLR递送诱导总胆固醇显著降低，在概念验证研究中检查了AAV8介导的mLDLR表达，以确定其是否对动脉粥样硬化病变具有影响(Kassim等人,2010,《公共科学图书馆·综合》5(10):e13424)。三组雄性DKO小鼠以高脂饮食喂养，以加速动脉粥样硬化的进展。两个月后，一组小鼠接受单次IV注射5×10¹²GC/kg的对照AAV8.TBG.nLacZ载体，一组接受单次IV注射5×10¹²GC/kg的AAV8.TBG.mLDLR载体，而对第三非干预组进行尸检以进行动脉粥样硬化病变定量。接受载体的小鼠被维持高脂饮食另外60天，在此期间小鼠被处死。

接受AAV8.TBG.mLDLR载体的动物实现了总胆固醇从基线时的1555±343mg/dl到治疗后第7天的266±78mg/dl和治疗后第60天的67±13mg/dl的快速下降。相比之下，AAV8.TBG.nLacZ治疗的小鼠的血浆胆固醇水平基本保持不变，从基线时的1566±276mg/dl，到载体后60天测量的1527±67mg/dl。在高脂饮食两个月后，所有动物的血清转氨酶略有升高，所述血清转氨酶在AAV8.TBG.nLacZ载体治疗后仍保持升高，但在AAV8.TBG.mLDLR载体治疗后下降三倍至正常水平。

预先存在的动脉粥样硬化病变的演变通过两种独立的方法进行评估。在第一种方法中，将主动脉从动脉弓打开至髂分支并且用油红O染色(图3A)；形态测定分析量化了沿整个主动脉长度用油红O染色的主动脉百分比(图3B)。油红O是溶色素(脂溶性染料)重氮染料，其用于冷冻切片上中性甘油三酯和脂质染色。用这种染料对主动脉进行染色允许可视化加载有脂质的斑块。如图3所示，两个月的高脂饮食导致广泛的动脉粥样硬化覆盖20％的主动脉，从而反映了载体时的基线疾病；在AAV8.TBG.nLacZ载体治疗后的另外两个月时间段内，这增加到33％，从而表示动脉粥样硬化进一步进展65％。相比之下，AAV8.TBG.mLDLR载体治疗使得动脉粥样硬化在两个月内消退87％，从基线时20％的主动脉被动脉粥样硬化覆盖到载体施用后60天仅2.6％的主动脉被动脉粥样硬化覆盖。

在第二种方法中，定量主动脉根部中的总病变区域(图3C-F)。此分析揭示了同样的总体趋势，其中与基线小鼠相比，注射了AAV8.TBG.nLacZ的小鼠显示了在2个月内44％的进展，而与基线小鼠相比，注射了AAV8.TBG.mLDLR的小鼠展示了64％病变消退。综上所述，通过注射AAV8.TBG表达LDLR在两个月内诱导在主动脉内的两个不同部位处胆固醇显著降低和动脉粥样硬化显著消退，如通过两种独立的定量方法评估的。

7.4HoFH小鼠模型中的最小有效剂量的评估

对HoFH人群中表型和基因型之间相关性的广泛研究表明，LDL和总胆固醇仅25-30％的差异可转化为临床结果的显著差异(Bertolini等人2013,《动脉粥样硬化》227(2):342-348；Kolansky等人,2008,《美国心脏病杂志(Am J Cardiol)》102(11):1438-1443；Moorjani等人1993,《柳叶刀》341(8856):1303-1306)。此外，与LDL-C降低低于30％相关的降脂治疗可导致HoFH患者延迟心血管事件和延长生存期(Raal等人，2011,《循环》124(20):2202-2207)。最近，FDA批准了药物米泊美生用于治疗在其中主要终点是LDL-C从基线降低为20％到25％的HoFH(Raal等人，2010,《柳叶刀》375(9719):998-1006)。

在这个背景下，下面讨论的基因治疗小鼠研究中的最小有效剂量(MED)被定义为导致血清总胆固醇至少比基线低30％，具有统计学意义且稳定降低的载体的最低剂量。MED已经在许多不同的研究中得到了评价，下面提供了每个实验的简要描述。

7.4.1.DKO小鼠的AAV8.TBG.mLDLR的POC剂量范围研究

DKO小鼠的AAV8.TBG.mLDLR和AAV8.TBG.hLDLR的概念剂量范围验证研究用于确定进一步研究的合适剂量。在这些研究中，DKO雄性小鼠静脉注射范围从1.5到500×10¹¹GC/kg不同剂量的AAV8.TBG.mLDLR，并随后降低血浆胆固醇(Kassim等人,2010,《公共科学图书馆·综合》5(10):e13424)。这些研究性试验(1.5到500×10¹¹)中使用的GC剂量是基于定量的PCR(qPCR)效价。在第21天时，在1.5×10¹¹GC/kg的AAV8.TBG.mLDLR剂量下观察到了具有统计学意义的血浆胆固醇最大为30％的减少，与更大剂量载体成比例的大量减少(Kassim等人,2010,《公共科学图书馆·综合》5(10):e13424)。代谢校正后收获的肝组织分析揭示小鼠LDLR转基因和蛋白质水平与载体剂量成比例。从而，观察到剂量-反应相关性。

7.4.2DKO小鼠和LAHB小鼠的AAV8.TBG.hLDLR剂量范围研究

在DKO小鼠中进行了类似的概念验证研究，使用的是含有人LDL受体(hllr)基因的载体，而不是小鼠LDLR受体基因。hLDLR载体的结果与mLDLR非常相似，即载体的剂量与转基因表达量和载体基因组在肝脏中的沉积量成正比(Kassim等人，2013,《人类基因疗法》24(1):19-26)。主要的区别在于其疗效—在这个模型中，人LDLR载体的效力较低。在5×10¹²GC/kg和5×10¹¹GC/kg(剂量基于qPCR效价)时，胆固醇降低了至少30％，尽管只有在较高剂量时才具有统计学意义。

观察到的疗效降低可归因于人LDLR对小鼠ApoB亲和力的降低。为了绕开这个问题，研究重复使用表达人ApoB100的LAHB小鼠模型，因此，更真实地模拟了与人类研究相关的人ApoB100与人LDLR的相互作用。两株雄性小鼠(DKO vs.LAHB)尾静脉注射三种载体剂量之一的AAV8.TBG.hLDLR(基于qPCR效价的0.5×10¹¹GC/kg、1.5×10¹¹GC/kg和5.0×10¹¹GC/kg)。每同生群的动物在第0天(载体施用前)、第7天和第21天采血，并评估血清胆固醇水平。人类LDLR更有效地LAHB鼠标相比mLDLR DKO鼠标:血清胆固醇降低30％达到了剂量的1.5×10¹¹GC/公斤,与先前的研究同样的功效达到鼠标LDLR构造DKO动物2013,《人类基因疗法》24(1):19-26)。

7.4.3HoFH小鼠模型的AAV8.TBG.mLDLR和AAV8.TBG.hLDLR的非临床药理学/毒理学研究

6到22周龄的雄性和雌性DKO小鼠(n＝280、140雄性和140雌性)接受尾静脉注射AAV8.TBG.mLDLR三种载体剂量(7.5×10¹¹GC/kg、7.5×10¹²GC/kg、6.0×10¹³GC/kg)中的一种或拟用基因治疗载体AAV8.TBG.hLDLR的一种剂量(6.0×10¹³GC/kg)。采用oqPCR滴定法，根据每公斤体重的基因组拷贝数(GC)给药，详见第8.4.1节。另外同种群动物接受PBS作为空白对照。分别于第3天、第14天、第90天、第180天处死来自各组的动物，并且收集血液以评估血清胆固醇水平(图4)。

在所有处理小鼠组的所有尸检时间点，观察到胆固醇的快速显著降低。在早期低剂量病媒时，这种减少在女性中似乎比在男性中要少，尽管这种差异随着时间的推移而减少，最终在性别之间没有明显的差异。在同一剖检时间点，与PBS对照组相比，每组的血清胆固醇都有统计学意义上的至少30％的降低。因此，本研究确定的MED≤7.5×10¹¹GC/kg。

7.4.4纯合子家族性高胆固醇血症小鼠模型的AAV8.TBG.hLDLR的效果研究

12到16周龄的雄性DKO小鼠(n＝40)通过静脉输注施用AAV8.TBG.hLDLR四种剂量(1.5×10¹¹GC/kg、5.0×10¹¹GC/kg、1.5×10¹²GC/kg、5.0×10¹²GC/kg)中的一种(剂量基于oqPCR滴定法)。第0天(载体施用之前)、第7天和第30天给动物采血并评估血清胆固醇(图5)。第7天和第30天，在使用大约等于5.0×10¹¹GC/kg治疗的小鼠组群中观察到了快速且大幅度的胆固醇降低。根据本研究确定的MED值在1.5×10¹¹GC/kg和5.0×10¹¹GC/kg之间。

7.5.高脂饮食的AAV8.TBG.rhLDLR in LDLR+/-恒河猴的影响

实施了设计以评估FH恒河猴的AAV8-LDLR基因转移的研究。脂肪喂养或饲料喂养的野生型恒河猴后续10¹³GC/kg的AAV8.TBG.rhAFP的施用(对照载体；基于qPCR滴定法的剂量)，未见天门冬氨酸转氨酶(AST)和丙氨酸转氨酶(ALT)值升高。这表明AAV8衣壳本身对引起验证或肝损伤的过程负责。

7.6.HoFH的小鼠模型的AAV8.TBG.hLDL试点组织分布研究

为了评估用于HoFH基因疗法的安全性和药效学性能，对DKO小鼠实施试点组织分布(BD)研究。这些研究检查了通过两种途径之一给全身施用5×10¹²GC/kg的AAV8.TBG.hLDLR载体的五只雌性DKO小鼠的载体分布和持续性：1)IV注射进尾静脉或2)门静脉注射。在两个不同时间点(第3天和第28天)，收获一组组织，并且从收获的组织中提取总细胞DNA。在这些试点研究中，IV和门静脉途径二者形成可比较的BD轮廓图，支持通过外周静脉向患者和动物注入基因治疗载体的基本理论。

7.7.毒理学

为了评估基因治疗对HoFH的潜在毒性，我们在DKO小鼠(HoFH小鼠模型)、野生型和LDLR+/-恒河猴中进行了药理学/毒理学研究。这些研究包括在饲料野生型和LDLR+/-恒河猴中检测LDLR转基因表达在载体相关毒性中的作用，HoFH小鼠模型中AAV8.TBG.mLDLR和AAV8.TBG.hLDLR的药理学/毒理学研究，以及检查HoFH小鼠模型中AAV8.TGB.hLDLR的非临床组织分布。以下更详细地说明这些研究。

7.8.检查饲料喂养的野生型LDLR+/-恒河猴的载体关联毒性中的LDLR转基因表达的非临床研究

四只野生型和四只LDLR+/-恒河猴静脉注射1.25×10¹³GC/kg的AAV8.TBG.hLDLR(基于oqPCR滴定法的剂量)、非人类灵长类动物(NHP)在施用后长达一年的时间内进行监测。四只动物(两个野生型和两个LDLR+/-)在载体施用后的第28天尸检以评估急性载体关联毒性和载体分布以及四只动物(两个野生型和两个LDLR+/-)在载体施用后的第364/365天尸检以评估长期载体关联病理学和载体分布。野生型和LDLR+/-猕猴的每个群组具有两只雄性和两只雌性。

动物对注射载体的耐受性良好，无长期或短期临床后遗症。组织分布研究表明高水平和稳定的肝靶向性，肝外分布较少，但仍可检测到，随着时间的推移下降。这些数据说明作为药效的靶器官，肝脏也是最有可能产生潜在毒性的器官。载体施用后的第28天和第364/365天进行的尸检中收获的组织的详细回顾揭示，在LDLR+/-猕猴中，有微小至轻微的肝脏表现和一些动脉粥样硬化的证据。肝脏病理的性质和在两种未经过治疗的野生型动物中观察到的相似病理的事实向病理学家表明，它们与测试品无关。

在载体施用之前，其中一种动物的谷丙转氨酶(ALT)持续升高，水平在58到169U/L的范围之间的载体施用之后，所述谷丙转氨酶继续升高。其余动物的转氨酶没有升高，或者天门冬氨酸转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)只有短暂的低水平升高，从未超过103U/L。最一致的异常是在病媒注射后发现的，表明它们与测试品有关。T细胞对人LDLR或AAV8衣壳的活化与AST/ALT的增加相关。图6呈现出表明相关发现的三种动物的AAV衣壳ELISPOT数据和血清AST水平。只有一种动物表现出相关性，AST增加到103U/L与T细胞对抗衣壳的外观相对应(图6，动物090-0263)；衣壳T细胞反应持续，AST立即恢复到正常范围。

分析组织源性T细胞呈现衣壳和转基因特异性T细胞的分析表明肝脏源性T细胞在较晚时间点时变得对于来自两种基因型(野生型和LDLR+/-)有反应，而在这个较晚时间点上在LDLR+/-动物中检测出人LDLR的T细胞。这表明PBMC不能反映靶组织中的T细胞隔间。在第28天和第364/365天收获的肝组织通过RT-PCR分析了转基因的表达，发现肝组织确实受到临床病理异常或T细胞外观的影响。

无论是野生型还是LDLR+/-型动物，在饲料饮食时都没有发生高胆固醇血症。剂量限制毒性(dlt)未观察到剂量为1.25×10¹³GC/kg(基于oqPCR)，这意味着最大耐受剂量(MTD)将等于或大于该剂量。观察到测试品相关的转氨酶升高，这是低的和短暂的，但仍然存在。因此，无观察不良反应水平(NOAEL)小于本例1中评估的单次高剂量。

7.9.HoFH小鼠模型中的AAV8.TBG.mLDLR和AAV8.TBG.hLDLR的非临床药理学/毒理学研究

由于使用这种菌株在DKO老鼠中实施了这个研究将允许1)评估概念验证疗效与毒性,和2)在任何与LDLR缺陷相关的病理情况下评估载体关联毒性以及相关血脂异常及其后遗症,如脂肪变性。

本研究设计以测试最高计量下的AAV8.TBG.hLDLR，其是施用于患有HoFH的人体受试者的最高剂量的8倍，如实例1所述。表达小鼠LDLR的载体版本在这个高剂量和两个低剂量下进行了测试，以评估剂量对毒性参数的影响，以及胆固醇的减少。使用表达小鼠LDLR的载体进行剂量反应实验，以更能反映使用人LDLR载体在人体内观察到的毒性和有效性。

在本研究中，6-22周龄的雄性和雌性DKO小鼠分别施用AAV8.TBG.mLDLR(7.5×10¹¹Gc/kg、7.5×10¹²Gc/kg和6.0×10¹³Gc/kg)的剂量之一或6.0×10¹³GC/kg的载体(AAV8.TBG.hLDLR)(基于oqPCR滴定法的剂量)。在载体施用后第3天、第14天、第90天和第180天处死动物；这些时间被选择来捕获载体表达谱的测试品以及急性和慢性毒性。通过检测血清胆固醇水平来监测转基因表达的有效性。对动物进行全面的临床病理、对载体的免疫反应(细胞因子、AAV8衣壳的NAb、对衣壳和转基因的T细胞反应)评估，并在尸检时收获组织以进行全面的组织病理学检查。

本研究的主要毒理学结果如下：

·治疗组均未见临床后遗症

·临床病理学

○转氨酶类异常限于肝功能测试AST和ALT的升高(范围为1-4倍ULN)，并且主要在所有剂量的鼠类LDLR载体的第90天发现。除少数雄性动物ALT小于2倍ULN，施用大剂量人LDLR载体的组群中的转氨酶无升高。与小鼠载体相关的异常是温和的，而不是剂量依赖的，因此，不被认为与载体相关。基本上没有发现与高剂量人体载体相关的结果。基于这些发现，没有证据表明治疗相关毒性，这意味着基于这些标准的无不良反应水平(NOAEL)是6.0×10¹³GC/kg。

·病理学：未见明显病理结果。肝组织病理检查仅见以下微小或轻微的表现：

○根据所有评估标准，施用PBS的动物有轻微和/或轻度异常的证据。在评估与治疗相关的病理时，关注的是任何在注射PBS动物中发现的被归类为轻度的发现。

○在施用小鼠载体和人LDLR载体的高剂量雌性小鼠中观察到轻度胆管增生和窦状细胞增生。这可能代表只在高剂量时观察到的与载体有关的效应。

○小叶中心肥大是轻微的，仅存在于雄性且不是在高剂量载体下，认为所述小叶中心肥大与载体无关。

○在第180天，1/7的雄性和3/7的雌性在高剂量人LDLR载体中发现了微小坏死。

○基于在高剂量载体下发现轻度胆管和窦状增生，以及在高剂量人LDLR载体中发现少量坏死的实例，基于这些标准的NOAEL在7.5×10¹²Gc/kg和6.0×10¹³GC/kg之间。

·其它发现：根据IFN-γELISPOT对衣壳和LDLR的反应，在施用高剂量的人LDLR载体后，动物发生了AAV8的NAb的增加以及极低T细胞反应的证据。根据载体后第3天和第14天的血清分析，几乎没有证据表明存在急性炎症反应；虽然IL6没有增加，但一些细胞因子确实显示中度和短暂的升高。

一个值得注意的发现是，用小鼠LDLR载体处理的DKO小鼠毒性并不比用人类LDLR载体处理的小鼠更严重，如果就T细胞而言，可能就是人LDLR比小鼠转基因更具有免疫原性这种情况。在小鼠中使用表达人类转基因的高剂量载体时，ELISPOT研究确实显示出LDLR特异性T细胞有一些激活，尽管所述T细胞是低数量且存在于支持毒性数据的有限数量的动物中，这表明宿主反应的这种机制不太可能导致安全问题。

总之，没有剂量限制毒性，这意味着最大耐受剂量高于测试的最高剂量是6.0×10¹³GC/kg。基于最高剂量时肝脏病理中轻度和可逆的发现，NOAEL在6.0×10¹³Gc/kg之间，在肝脏中观察到轻度可逆的病理，下降到7.5×10¹²GC/kg，没有明确的载体相关发现。

7.10.HoFH小鼠模型的AAV8.TGB.hLDLR非临床组织分布

6-22周龄雄性和雌性DKO小鼠静脉施用7.5×10¹²GC/kg的AAV8.TBG.hLDLR(通过oqPCR滴定法测量的剂量)(实例1f中治疗人类受试者的最高计量)。在施用载体后的第3天、第14天、第90天和第180天，对动物进行尸检以进行组织分布评估。除了血液，还收获了20个器官。通过对收获的总基因组DNA进行定量、敏感性PCR分析，评估载体基因组在器官中的分布。为了评估PCR试验反应的充分性，每个组织的一个样品包括对照DNA的峰电位，所述对照DNA的锋电位包括已知数量的载体序列。

肝脏中载体GC数明显高于其它器官/组织，这与AAV8衣壳的高肝性特性相一致。例如，在第90天，肝脏中的载体基因组拷贝至少是其它任何组织的100倍。在前三个时间点上，雌雄小鼠差异无统计学意义。肝内的GC值随着时间的推移而下降，直到第90天，然后趋于稳定。所有组织均有相似的下降趋势，但细胞周转率较高的组织中载体拷贝数下降更快。低但可检测水平的载体基因组拷贝存在于两性性腺和大脑。

AAV8.TBG在DKO小鼠内的组织分布与发表的AAV8结果一致。肝脏是静脉输注后基因转移的主要靶点，肝脏中的基因组拷贝不会随着时间的推移而显著下降。其它器官是靶向载体递送的，尽管这些非肝组织的基因转移水平显著降低并随着时间的推移而下降。因此，这里提出的数据表明，主要的器官系统评估是肝脏。

7.11.来自非临床安全性研究的结论

恒河猴和DKO小鼠研究证实，高剂量载体与低水平、暂时性的、无症状的肝脏病理有关，其表现为NHP中转氨酶的暂时升高，在小鼠中表现为轻度胆管和窦性肥厚。未观察到因病媒而产生的其它它毒性。

在猕猴中在剂量高达1.25×10¹³GC/kg下和在DKO小鼠中在6×10¹³GC/kg下没有观察到DLT。NOAEL的确定主要集中在肝脏毒性上，如在猕猴中以转氨酶升高和在DKO小鼠中以组织病理学所反映的。也就是说，在猕猴中NOAEL小于1.25×10¹³GC/kg并且在DKO小鼠中NOAEL小于6×10¹³GC/kg但大于7.5×10¹²GC/kg。剂量以oqPCR滴定法为基础。

7.12.支持人类治疗的非临床数据的整体评估

从药理学和毒理学研究中得出的关键发现为临床研究的剂量选择和设计提供了信息，如下：

·最低有效剂量(MED)：MED在非临床研究中定义为GC/kg剂量，可使血清胆固醇降低30％。两项IND启用的非临床研究确定1.5到5.0×10¹¹GC/kg之间的MED。相对于PBS对照，小鼠药理学/毒理学研究表明血清胆固醇具有统计学意义地至少降低30％，允许MED≤7.5×10¹¹GC/kg的估计。根据观察到的剂量-反应关系，通过oqPCR可以确定MED值在1.5到5.0×10¹¹GC/kg之间。

·最大耐受量(MTD)：MTD在非临床研究中定义为GC/kg剂量，所述剂量不会导致剂量限制毒性(DLT)。在测试的最高剂量下的毒理学研究中未观察到DLT，如通过oqPCR测定的，所述测试的最高剂量在DKO小鼠中为6.0×10¹³GC/kg并且在猕猴中为1.25×10¹³GC/kg。结果表明，实际MTD高于这些剂量。

给小鼠6.0×10¹³GC/kg剂量的AAV8.TBG.hLDLR，后续的第3天、第14天、第90天或第180天的治疗未见不良反应。在使用了AAV8.TBG.hLDLR猴子和小鼠中，猴子和小鼠的转氨酶偶有升高。在小鼠中，观察到仅在第180天时AAV8.TBG.hLDLR治疗的小鼠中的轻微肝坏死。然而，在第90天或使用了鼠类转基因产品的任何动物体内没有观察到，这可能表明它可能与对人类转基因产品的免疫反应有关。而使用AAV8.TBG.hLDLR的小鼠和猴子中没有观察到明显的不良反应，ALT和AST的微小升高符合描述AAV可能性的临床数据，以引发肝脏影响。

·未观察到不良事件级别(NOAEL)：这在DKO小鼠中测定为7.5×10¹²GC/kg。这是基于主要在肝脏(胆管和窦状增生，微小坏死)中的很小到轻微的组织病理学发现，观察到高剂量的人LDLR(hLDLR)转基因。只有一剂在猕猴中测试；然而，1.25×10¹³GC/kg下的毒性是微小的，包含AST和ALT暂时性且低水平的升高，从而表明真正的NOAEL将在低于测试剂量的剂量下实现。

基于这些数据，提出了三个单剂量队列，2.5×10¹²GC/kg、7.5×10¹²GC/kg和2.5×10¹³GC/kg(基于oqPCR方法的剂量)。这些剂量代表能够形成剂量反应的半对数，逐步增加，并且代表非临床测试支持的剂量范围。在临床方案中引入预防性糖皮质激素有望通过减轻或预防免疫介导的肝细胞损伤来提高产品施用的安全性。

8.实例3：AAV8.TBG.hLDLR的制造

AAV8.TBG.hLDLR载体由AAV载体活性成分和调配缓冲液组成。外部AAV载体组件是由比率为1:1:18的三种AAV病毒蛋白VP1、VP2和VP3的60个拷贝组成的血清型8，T＝1的二十面体衣壳。衣壳含有单链DNA重组AAV(rAAV)载体基因组(图7)。基因组含有人低密度脂蛋白受体(LDLR)转基因，所述转基因侧接有两个AAV反向末端重复序列(ITR)。增强子、启动子、内含子、人LDLR编码序列和聚腺苷酸化(polyA)信号包括人LDLR转基因。ITR是负责载体制备期间基因组的复制和包装的遗传元件，并且是产生rAAV所需的唯一病毒顺式元件。人LDLR编码序列的表达从肝细胞特异性甲状腺素结合球蛋白(TBG)启动子驱动。α1微球蛋白/双库尼茨抑制剂增强子元件的两个拷贝位于TBG启动子之前以刺激启动子活性。存在嵌合内含子以进一步增强表达，并且兔β球蛋白polyA信号包含在内以介导人LDLR mRNA转录物的终止。载体以AAV8.TBG.hLDLR载体于调配缓冲液中的悬浮液的形式供应。调配缓冲液为180mM氯化钠、10mM磷酸钠、0.001％泊洛沙姆188，pH为7.3。

载体制造和载体表征的细节在下面的章节中描述。

8.1.用于生产AAV8.TBG.hLDLR的质粒

用于产生AAV8.TBG.hLDLR的质粒如下：

8.1.1顺式质粒(载体基因组表达构建体)：

含有人LDLR表达盒的pENN.AAV.TBG.hLDLR.RBG.KanR(图8)。这种质粒编码rAAV载体基因组。用于所述表达盒的polyA信号来自兔β球蛋白基因。α1微球蛋白/双库尼茨抑制剂增强子元件的两个拷贝位于TBG启动子之前。

为了产生用于产生AAV8.TBG.hLDLR的顺式质粒，人LDLR cDNA被克隆到含有AAV2ITR的构建体pENN.AAV.TBG.PI中，以创建pENN.AAV.TBG.hLDLR.RBG。pENN.AAV.TBG.PI的质粒骨架源自pZac2.1(基于pKSS的质粒)。切除pENN.AAV.TBG.hLDLR.RBG中的氨苄青霉素抗性基因，并用卡那霉素基因替代以创建pENN.AAV.TBG.hLDLR.RBG.KanR。人LDLR cDNA的表达由带有嵌合内含子的TBG启动子驱动(普洛麦格公司(Promega Corporation),美国威斯康星州，麦迪逊)。用于所述表达盒的polyA信号来自兔β球蛋白基因。α1微球蛋白/双库尼茨抑制剂增强子元件的两个拷贝位于TBG启动子之前。

序列元件说明

1.反向末端重复序列(ITR)：AAV ITR(基因库#NC001401)是两端相同，但朝向相反的序列。当AAV和腺病毒(ad)辅助功能以反式提供时，AAV2 ITR序列起载体DNA复制的起点和载体基因组的包装信号的作用。因此，ITR序列代表了载体基因组复制和包装所需的唯一顺式作用序列。

2.人α1微球蛋白/双库尼茨抑制剂增强子(2个拷贝；0.1Kb；基因库#X67082)这种肝脏特异性增强子元件有助于增强肝脏特异性并增强从TBG启动子的表达。

3.人甲状腺素结合球蛋白(TBG)启动子(0.46Kb；基因库#L13470)。这种肝细胞特异性启动子驱动人类LDLR编码序列的表达。

4.人LDLR cDNA(2.58Kb；基因库#NM000527，完整的CDS)。人LDLR cDNA编码860个氨基酸的低密度脂蛋白受体，其中SDS-PAGE预测分子量为95kD并且表观分子量为130kD。

5.嵌合内含子(0.13Kb；基因库#U47121；普洛麦格公司，威斯康星州，麦迪逊)。嵌合内含子由来自人类β-球蛋白基因的第一内含子的5′-供体位点以及位于免疫球蛋白基因重链可变区的前导和主体之间的内含子的分支和3′-受体位点组成。在表达盒中内含子的存在被证明可以促进mRNA从细胞核到细胞质的运输，从而提高mRNA稳定水平的积累以用于翻译。这是旨在调节基因表达水平的增加的基因载体的共同特征。

6.兔β-球蛋白聚腺苷酸化信号：(0.13Kb；基因库#V00882.1)兔β-球蛋白聚腺苷酸化信号提供了用于抗体mRNA有效聚腺苷酸化的顺式序列。此元件充当转录终止的信号、新生转录物的3'端处的特异性切割事件以及添加长聚腺苷酸尾的信号。

8.1.2反式质粒(包装构建体)：pAAV2/8(Kan)，含有AAV2 rep基因和AAV8 cap基因(图9)。

AAV8反式质粒pAAV2/8(Kan)表达编码病毒粒子蛋白VP1、VP2和VP3的AAV2复制酶(rep)基因和AAV8衣壳(cap)基因。AAV8衣壳基因序列最初是从恒河猴的心脏DNA中分离的(基因库登录号AF513852)。为了创建嵌合包装构建体，将含有AAV2 rep和cap基因的质粒p5E18用XbaI和XhoI消化以去除AAV2 cap基因。然后用AAV8 cap基因的2.27Kb SpeI/XhoIPCR片段替代AAV2衣壳基因，以创建质粒p5E18VD2/8(图9a)。通常驱动rep表达的AAV p5启动子在该构建体中从rep基因的5'端迁移到cap基因的3'端。此布置是为了下调rep的表达，以提高载体产率。p5E18的质粒主链来自pBluescript KS。作为最后的步骤，将氨苄西林抗性基因用卡那霉素抗性基因替代，以创建pAAV2/8(Kan)(图9B)。整个pAAV2/8(Kan)反式质粒已通过直接测序验证。

8.1.3腺病毒辅助质粒：pAdΔF6(Kan)

质粒pAdΔF6(Kan)大小为15.7Kb并且含有对AAV复制重要的腺病毒基因组区域，即E2A、E4和VA RNA。pAdΔF6(Kan)不编码任何另外的腺病毒复制或结构基因，并且不含有复制所必需的顺式元件，如腺病毒ITR，因此，预计不会产生传染性腺病毒。腺病毒E1必需基因功能由产生rAAV载体的HEK293细胞提供。pAdΔF6(Kan)来源于Ad5的E1、E3缺失的分子克隆(pBHG10，基于pBR322的质粒)。在Ad5 DNA中引入缺失，以去除不必要的腺病毒编码区，并且使辅助质粒中腺病毒DNA的数量从32Kb减少到12Kb。最后用卡那霉素耐药基因替代氨苄西林耐药基因，以创建pAdΔF6(Kan)(图10)。DNA质粒测序由德国凯杰测序服务公司(Qiagen Sequencing Services,Germany)进行，并且揭示了pAdDeltaF6(Kan)参考序列与以下腺病毒元件的同源性为100％：p1707FH-Q:E4 ORF6 3.69-2.81Kb；E2A DNA结合蛋白11.8–10.2Kb；VA RNA区域12.4–13.4Kb。

上述的每种顺式、反式和辅助质粒中的每个都含有卡那霉素抗性盒，因此β-内酰胺抗生素不用于其生产。

8.1.4质粒制造

用于产生载体的所有质粒均由Puresyn公司(Puresyn Inc.)(美国宾夕法尼亚州，马尔文(Malvern,PA))生产。过程中使用的所有生长培养基都是与动物无关的。在所述过程中使用的所有组件，包含发酵瓶、容器、膜、树脂、柱、管以及任何与质粒接触的组件，都是专门用于单个质粒的，并被认证为不含BSE。没有共享组件，并且在适当的时候使用一次性组件。

8.2.细胞库

AAV8.TBG.hLDLR载体由来源于完全表征的主细胞库的HEK293工作细胞库产生。两个细胞库的制造和测试细节如下所示。

8.2.1HEK293主细胞库

HEK293主细胞库(MCB)是原代人胚胎肾细胞(HEK)293的衍生物。HEK293细胞系是由人5型腺病毒(Ad5)DNA剪切转化的永久系(Graham等人，1977，《普通病毒学杂志(Journalof General Virology)》36(1):59-72)。HEK293 MCB已经普遍测试过微生物和病毒污染。HEK293 MCB当前储存于液氮中。对HEK293 MCB进行了另外的测试，以证明不存在人类、猿类、牛和猪来源的特定病原体。通过同工酶分析证实了HEK293 MCB的人类来源。

还通过在皮下注射细胞悬浮液后评估裸体(nu/nu)胸腺小鼠的肿瘤形成，对HEK293 MCB进行了致瘤性测试。在这个研究中，十个阳性对照小鼠中有十个小鼠在注射部位诊断出纤维肉瘤，并且十个测试品小鼠中有十个在注射部位诊断出癌。阴性对照组的小鼠均未诊断出肿瘤。还测试HEK293 MCB L/N 3006-105679的猪圆环病毒(PCV)1型和2型的存在。PCV 1型和2型的MCB均为阴性。

8.2.2HEK293工作细胞库

HEK293工作细胞库(WCB)是使用针对欧洲药典专著的适用性认证的新西兰来源的胎牛血清FBS(Hyclone PN Sh30406.02)来制造的。使用一个小瓶(1mL)MCB为接种材料建立HEK293 WCB。进行了表征测试，并且测试结果列于

表4.1中。

表4.1HEK293 WCB的表征。

8.3.载体制造

载体制造过程的一般描述在以下给出并且也反映在图11的流程图中。

8.3.1载体产生过程(上游过程)

8.3.1.1 HEK293 WCB细胞开始培养到T烧瓶(75cm²)中

将一个小瓶的来自WCB的含有10⁷个细胞的1mL HEK293细胞在37℃下解冻，并将其接种到75cm²的组织培养烧瓶中，所述烧瓶含有补充有10％胎牛血清的DMEM高葡萄糖(DMEMHG/10％FBS)。然后将细胞置于37℃/5％CO₂温育器中，并且生长到约70％融合度，每日直接观察和显微镜检查以评估细胞生长。这些细胞被指定为1代，并被传代以产生用于载体生物合成的细胞接种串，传代时间可达约10周，如下所述。传代数在每次传代时记录并且在第20次传代后终止细胞。如果载体生物合成需要另外的细胞，则从另一瓶HEK293 WCB中启动新的HEK293细胞接种串。

8.3.1.2将细胞传代到～2个T烧瓶(225cm²)中

当HEK293细胞在T75瓶中生长达到70％的融合度时，使用重组胰蛋白酶(TrypLE)将细胞从瓶表面分离，并将细胞接种到两个含有DMEM HG/10％FBS的T225瓶中。细胞置于培养箱中，培养至70％的融合度。通过肉眼观察和使用显微镜观察细胞的生长、有无污染和一致性。

8.3.1.3将细胞传代到～10个T烧瓶(225cm²)中

当HEK293细胞在两种T225瓶中融合度达到70％时，使用重组胰蛋白酶(TrypLE)分离细胞，并以每瓶～3×10⁶个细胞的密度在十个含DMEM HG/10％FBS的225cm² T烧瓶中播种。将细胞置于37℃/5％CO₂温育器中，培养至70％的融合度。通过直接目视检查和使用显微镜监测细胞的生长、无污染和一致性。细胞通过在T225烧瓶中连续传代来维持细胞种子培养，并提供用于扩展的细胞，以支持后续载体批次的制造。

8.3.1.4将细胞传代到～10个滚瓶中

当HEK293细胞在十个T225烧瓶中聚集到70％时，用重组胰蛋白酶(TrypLE)分离细胞，计数并接种于含DMEM HG/10％FBS的850cm²滚瓶(RB)中。然后将RB放置在RB温育器中，细胞生长到～70％的融合度。通过直接目视检查和使用显微镜监测细胞生长、无污染和一致性。

8.3.1.5将细胞传代到～100个滚瓶中

当HEK293细胞在上述步骤制备的RB中生长达到～70％的浓度时，使用重组胰蛋白酶(TrypLE)分离，计数并接种在100个含有DMEM/10％FBS的RB中。然后将RB置于RB温育器中(37℃,5％CO₂)，培养至～70％合流。通过直接目视检查和使用显微镜监测细胞的生长、无污染和一致性。

8.3.1.6用质粒DNA转染细胞

当在100RB中生长的HEK293细胞是～70％汇合生长的,细胞转染的三个质粒:AAV血清型特异包装(反式)质粒、ad辅助质粒、包含两侧AAV末端反向重复(ITR)的人类LDLR基因表达盒的载体顺式质粒。转染是使用磷酸钙方法进行的(关于质粒细节，参考第4.1.1节)。RB被置于RB温育器(37℃、5％CO₂)过夜。

8.3.1.7.培养基交换为无血清培养基

在转染后100个RB的过夜温育后，通过抽吸从每个RB中去除含有转染试剂的DMEM/10％FBS的培养基，并且用DMEM-HG(不含FBS)替代。RB被返回到RB温育器，并且在37℃，5％CO₂下温育，直到收获。

8.3.1.8.载体收获物

将RB从温育器中取出，检查转染的证据(转染诱导的细胞形态变化，细胞单层分离)和任何污染的证据。通过搅拌每个RB将细胞从RB表面分离，然后通过慢慢倒出到连接生物过程容器(BPC)的一次性无菌漏斗中来收获。BPC中的组合收获材料被标记为‘产品中间体：粗细胞收获物’，并且采集样品以用于(1)过程中生物负载测试和(2)生物负载、支原体和外来因子产物释放测试。标记为粗细胞收获物(CH)的产品中间体批次储存在2℃到8℃，直到进一步处理。

8.3.2载体纯化过程(下游过程)

虽然常见的“平台”纯化过程用于所有AAV血清型(即合并相同的系列和步骤顺序)，但每种血清型需要独特的色谱步骤条件，这一要求也影响了用于制备用于色谱树脂的澄清细胞裂解液的步骤的一些细节(缓冲液组成和pH值)。

8.3.2.1AAV8载体收获物浓缩和通过TFF进行的渗滤

含粗CH的BPC与中空纤维(100k MW截止)TFF装置的消毒水库的入口相连，所述TFF装置与磷酸盐缓冲盐水平衡。粗CH通过蠕动泵应用于TFF设备，并浓缩至1-2L。载体被保留(滞留物)，而小分子量部分和缓冲物质通过TFF过滤器孔并被丢弃。然后用AAV8过滤缓冲液对收获物进行渗滤。经过渗滤后，浓缩的载体被回收到5L BPC中。所述材料被标记为‘产品中间体：TFF后收获物’，并采集样品以用于过程中生物负载测试。经过浓缩的收获物立即被进一步处理或储存在2-8C，直到进一步处理。

8.3.2.2收获物的微流化和核酸酶消化

使用微流化器使经过浓缩和渗滤的收获物经受剪切，所述剪切打破完整的HEK293细胞。微流化器每次使用后用1N NaOH消毒至少1小时，保存在20％乙醇中直到下次运行，每次使用前用WFI冲洗。BPC中含有的粗载体附着在微流化器的消毒入口上，并且无菌空BPC附着在出口端口上。利用微流化器产生的空气压力，含有载体的细胞通过微流化器相互作用室(直径为300μm的回旋通道)来裂解细胞和释放载体。重复微流化过程，确保细胞完全裂解和载体的高回收率。产品中间体重复通过微流化器后，用～500mL的AAV8苯合酶缓冲液冲洗。含有微流化载体的5L BPC从微流化器的出口分离。该材料被标记为‘产品中间体：最终微流化’，并采集样品以用于过程中生物负载测试。微流化产品中间体立即被进一步处理或储存在2℃到8℃直到进一步处理。通过添加100U/mL从AAV8颗粒中去除核酸杂质。混合BPC的内容物并在室温下温育至少1小时。酶解产物中间体进一步处理。

8.3.2.3微流化中间体的过滤

含有微流化和消化产物中间体的BPC连接到孔径梯度从3μm到0.45μm的滤筒过滤器。过滤器由AAV苯甲酰酶缓冲液调节。施用蠕动泵，微流化产品中间体通过滤筒过滤器并收集在连接到过滤器出口的BPC中。无菌AAV8苯甲酰酶缓冲液通过滤筒冲洗过滤器。然后将过滤后的产品中间连接到由AAV8苯并酶缓冲液调节的0.2μm最终孔径胶囊过滤器。利用蠕动泵，过滤后的中间体通过滤筒过滤器，收集在连接到过滤器出口的BPC中。将大量无菌AAV8苯甲酰酶缓冲液泵入滤芯以冲洗过滤器。所述材料被标记为‘产品中间体：MF0.2μm过滤后’，并采集样品以用于过程中生物负载测试。材料在2℃到8℃下存储过夜知道进一步处理。在将澄清的细胞裂解液应用到色谱柱之前，可以在色谱分析当天进行另外的过滤步骤。

8.3.2.4使用阴离子交换色谱法的纯化

通过加入稀释缓冲液AAV8调节0.2μm过滤后的产品中间体的氯化钠浓度。含载体的细胞裂解液用离子交换树脂进行离子交换层析纯化。GE Healthcare AKTA试点色谱系统配备了含有约1L树脂床体积的BPG色谱柱。色谱柱采用连续流动条件，并满足建立的非对称规格。所述系统按照既定程序进行消毒，并储存在20％乙醇中，直到下一次运行。在使用前，用无菌AAV8洗涤缓冲液平衡系统。使用无菌技术和无菌材料和组件，含有澄清细胞裂解液的BPC连接到经过消毒的样品进口端口，下面列出的BPC含有生物处理缓冲液连接到AKTA试验的经过消毒的进口端口。色谱过程中的所有连接都是无菌进行的。将澄清后的细胞裂解液应用在色谱柱上，使用AAV8清洗缓冲液清洗。在这些条件下，载体被绑定到色谱柱上，杂质被从树脂中冲洗出来。AAV8颗粒通过AAV8洗脱缓冲液从柱中洗脱，收集到无菌塑料瓶中。所述材料被标记为‘产品中间体’并且采集样品以用于过程中生物负载测试。材料立即被进一步处理。

8.3.2.5 CsCl梯度超速离心法的纯化

上述阴离子交换柱层析纯化的AAV8颗粒含有空衣壳和其它与产品相关的杂质。用氯化铯梯度超速离心将空衣壳与载体颗粒分离。使用无菌技术，将氯化铯添加到载体“产品中间体”中，并将其温和混合至密度为1.35g/mL的最终浓度。溶液通过0.2μm的过滤器过滤后，分布到超速离心管中，在15℃的Ti50转子中进行超速离心约24小时。离心后，超速离心管从转子中取出，用Septihol擦拭，并放入BSC中。每个超速离心管夹在支架上，并受到聚焦照明，以帮助带的可视化通常观察到两个主要的带，上带对应空衣壳，下带对应载体颗粒。下带从每根超速离心管中回收，并使用附在无菌注射器上的无菌针头。结合从每根超速离心管中回收的载体，并采集样品以测定过程中生物负载、内毒素和载体效价。汇集的材料分布到无菌50mL聚丙烯锥形管，标签为‘产品中间体：CsCl梯度后’，并立即储存在-80℃，直到下一个工艺步骤。

8.3.2.6通过正切流动过滤的缓冲液交换

在测试和释放用于池化后，通过CsCl条带工艺步骤纯化的多批次载体被组合起来，并通过TFF进行渗滤以生产大量载体。根据从单个批次获得的样品的效价，使用无菌渗滤缓冲液的计算体积调整汇集载体的体积。根据可用的体积，集中的、浓度调整的载体的等分是一次性使用TFF设备。设备在使用前要经过消毒，然后在渗滤缓冲液中进行平衡。一旦过滤过程完成，载体从TFF设备中回收，置于无菌瓶中。该材料被标记为“预0.2μm过滤体”。材料立即被进一步处理。

8.3.2.7调配和0.2μm过滤以制备大量载体

由单个TFF单元制备的批次被聚集在一起，并在500mL无菌瓶中轻轻旋转混合。然后通过一个0.22μm的过滤器来制备大量载体。将汇集的材料取样用于大量载体和保留的QC测试，然后将其引用到50mL无菌聚丙烯管中，标记为“大量载体”，并在-80℃下保存，直到下一步。

8.4.载体测试

执行包含血清型同一性、空颗粒含量和转基因产品同一性的特征分析。所有分析的描述呈现如下。

8.4.1基因组拷贝(GC)效价

采用优化的定量PCR(oqPCR)方法，通过与同源质粒标准品比较，确定基因组拷贝效价。oqPCR分析采用DNase I和Proteinase K的顺序酶切，然后进行qPCR分析以测定载体基因组拷贝。DNA检测是使用序列特异性引物靶向RBG polyA区域，并结合荧光标记探针与所述区域杂交。与质粒DNA标准曲线的比较允许效价测定，而不需要任何PCR后的样品操作。许多标准，验证样品和控制(背景和DNA污染)已被引入分析。通过建立和定义分析参数，包括灵敏度、检测限、定性范围和分析内和分析间的精密度，所述分析方法已被确认。建立内部AAV8参比批次并用于进行确认研究。

8.4.2效能测定

体内效能分析被设计以检测HoFH的双敲除(DKO)LDLR-/-Apobec-/-小鼠模型的总胆固醇水平的人LDLR载体介导减少。体内效能测定的基础在第4.3.5.11节中描述。为了确定AAV8.TBG.hLDLR的效能，6到20周龄的老DKO小鼠被静脉(尾静脉)注射每只小鼠5×10¹¹GC/kg的PBS中稀释过的载体。通过眶后出血对动物进行采血并在载体施用之前和之后通过Antech GLP评估血清总胆固醇水平(第14天和第30天)。根据以往以这个剂量施用载体经验，预计到第14天施用载体的动物的总胆固醇水平将下降25％到75％。根据预期的总胆固醇降低范围，临床试验选择了每只小鼠5×10¹¹GC/kg剂量，这将允许在稳定性试验过程中评估载体效能的变化。

8.4.3载体衣壳同一性：VP3的AAV衣壳质谱分析

通过质谱(MS)对VP3衣壳蛋白多肽进行分析，确定了该载体的AAV2/8血清型。所述方法包括从SDS-PAGE凝胶中切离的VP3蛋白带的多酶酶切(胰蛋白酶，糜蛋白酶和内蛋白酶Glu-C)，然后用UPLC-MS/MS在Q-萃取轨道阱质谱仪上进行表征，以对衣壳蛋白排序。开发了一种串联质谱(MS)方法，允许鉴定某些污染蛋白以及从质谱获得肽序列。

8.4.4空的比完整的颗粒比率

利用分析性超速离心机(AUC)测量的沉降速度是获取大分子结构非均匀性、确认差异和缔合或聚集状态信息的很好的方法。样品装入单元室中，在贝克曼库尔特蛋白质实验室XL-I分析型超速离心机中以12000RPM的转速沉淀。每隔两分钟记录屈光指数扫描，持续3.3小时。数据通过c(s)模型(Sedfit程序)进行分析，计算出与标准化c(s)值相对应的沉积系数。应该观察到代表单个载体的主要峰值。迁移速度慢于主要单体峰值的峰值的出现表明了空颗粒/错误装配的颗粒。利用空AAV8颗粒制剂建立了空颗粒峰的沉降系数。主要单体峰值和前述峰值的直接定量可以确定空到完整颗粒比。

8.4.5感染效价

感染单位(IU)检测用于确定载体在RC32细胞(表达HeLa细胞的rep2)中的生产摄取和复制。简单地说，96孔板中的RC32细胞通过连续稀释载体和均匀稀释Ad5，每次稀释rAAV，重复12次，共同感染。感染七十二小时后裂解细胞，qPCR检测rAAV载体过输入扩增。采用终点稀释TCID50计算(Spearman-Karber)确定复制效价，单位为IU/ml。由于“传染性”值依赖于与细胞接触的颗粒、受体结合、内化、向细胞核的运输和基因组复制，所述“传染性”值受到测定几何形状和所使用的细胞系中适当受体和结合后通路的存在的影响。对于AAV载体输入至关重要的受体和后结合途径通常保持在永生化细胞系中，因此传染性分析效价并不是“传染性”颗粒数量的绝对测量。然而，蛋白质壳体包裹的GC与“感染单位”的比(称为GC/IU比值)可以用来衡量每个批次的产品一致性。由于AAV8载体在体外的低感染性，这种体外生物测定的可变性可能很高(30％到60％CV)。

8.4.6转基因表达分析

在从接受1×10¹⁰GC(5×10¹¹GC/kg)的AAV8.TBG.hLDLR载体的LDLR-/-Apobec-/-小鼠收获的肝脏中评估转基因表达。将30天前使用载体给药的动物安乐死，收获肝脏并在RIPA缓冲液中均质。25ug到100ug的全肝匀浆在4％到12％变性SDS-PAGE凝胶上电泳，并使用抗人LDLR抗体进行检测，以确定转基因表达。没有接收到载体或不相关载体的动物被用作试验的对照。经载体处理的动物，由于翻译后修饰，预计会显示一个在90-160kDa范围内迁移的条带。相对表达水平是通过量化带的综合强度确定的。

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