具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。

本发明提供了一种pSFV-p32病毒样颗粒的制备方法，包括：

(1)构建得到pSFV-sp6-p32质粒；

所述pSFV-sp6-p32质粒是通过采用塞姆利基森林病毒为载体，并合成如 SEQ IDNO.1所示的ASFV p32基因，然后将所述ASFV p32基因插入所述载体而得。

具体的，步骤(1)包括：

(1.1)合成ASFV p32基因，所述ASFV p32基因的序列为SEQ ID NO.1；

(1.2)设计引物tongyong-F，SP6-p32-R并合成，所述引物tongyong-F的序列为SEQID NO.2，所述引物SP6-p32-R的序列为SEQ ID NO.3；

(1.3)用BamHI/SmaI酶切双酶切质粒pSFV-sp6-EGFP；

(1.4)将基因合成所述ASFV p32基因片段和步骤(1.3)酶切的载体片段同源重组，得到重组产物；

(1.5)将所述重组产物加入到感受态细胞DH5α细胞，进行重组产物转化；

(1.6)将转化后的重组产物进行重组产物鉴定；

(1.7)将鉴定后的重组产物提取质粒；

(1.8)对所述质粒进行酶切鉴定及测序。

优选的，步骤(1.3)中的pSFV-sp6-EGFP，其由下述方法制得：

设计与合成引物，所述引物包括设计引物Cs-EGFP-F和Cs-EGFP-R，以及菌液鉴定引物EGFP-鉴定-F和EGFP-鉴定-R：

以EGFP-C1为模板，以Cs-EGFP-F，Cs-EGFP-R为引物扩增Cs-EGFP片段，然后经过酶切、同源重组、重组产物转化和鉴定、提取质粒、酶切鉴定及测序，构建得到复制子质粒pSFVCs-sp6-EGFP。

又以pSFVCs-sp6-EGFP为模板，以设计与合成的引物EGFP-F，EGFP-R 扩增EGFP片段，然后经过酶切pSFVCs-sp6-EGFP、同源重组、重组产物转化和鉴定、提取质粒、酶切鉴定及测序，最终构建得到复制子质粒pSFV-sp6-EGFP。优选的，步骤(1.4)包括：

将基因合成所述ASFV p32基因片段和步骤(1.3)酶切的载体片段按照合适的体积，于冰上配置以下反应体系。所述ASFV p32基因片段与酶切载体大片段的体积比为1:2。

优选的，步骤(1.6)中，将转化后的重组产物进行重组产物鉴定包括：

将转化后的重组产物过夜培养并挑选菌落进行菌液鉴定；

所述菌液鉴定的PCR体系包括菌液、设计引物tongyong-F，设计引物 SP6-p32-R。根据浓度，所加入的菌液、设计引物tongyong-F，设计引物SP6-p32-R 之间的体积比为(1-2):(1-2):(1-2)。

(2)将pSFV-sp6-p32、SFV-helper质粒体外转录成mRNA，然后将 pSFV-sp6-p32、SFV-helper质粒体外转录的mRNA共电转入BHK细胞中，得到 pSFV-p32病毒样颗粒；

具体的，步骤(2)包括：

(2.1)线性化pSFV-sp6-p32和SFV-helper；

(2.2)将线性化后的pSFV-sp6-p32和SFV-helper进行体外转录；

(2.3)将pSFV-sp6-p32及SFV-heleper体外转录的mRNA共电转入BHK 细胞中，得到pSFV-p32病毒样颗粒。

优选的，步骤(2.1)中，所述SFV-helper质粒是通过构建如SEQ ID NO.4 所示的重组载体，并合成如SEQ ID NO.5所示的插入片段基因，然后将所述插入片段基因克隆入所述重组载体而得。

更佳的，步骤(2.1)中，所述SFV-helper质粒由下述方法制得：

构建重组载体，构建得到的重组载体的序列为SEQ ID NO.4；

合成插入片段基因，所述插入片段的序列为SEQ ID NO.5；

将重组载体与插入片段进行同源重组，重组的产物转化DH5α感受态细菌，涂布平板，倒置培养，提取质粒，得到SFV-helper质粒，其中，所述SFV-helper 质粒的序列为SEQID NO.6。

本发明采用塞姆利基森林病毒(Semliki forest virus,SFV)为载体构建了一种包装体系:一个RNA分子是包含插入了ASFV p32蛋白的RNA复制子载体。另一个RNA分子是辅助RNA，共电转入BHK细胞后，收集上清液成功制备了病毒样颗粒pSFV-p32；经过IFA实验成功鉴定了p32的蛋白表达，为后续其它重要非洲外源蛋白的表达筛选和mRNA疫苗研制提供可靠的实验基础和科学依据，有利于研制防控非洲猪瘟流行病的疫苗。

相应的，本发明还提供一种pSFV-p32病毒样颗粒，其由上述的制备方法制得。本发明pSFV-p32病毒样颗粒能够高效表达外源蛋白p32，且抑制病毒结构蛋白的表达，具有较高的生物安全性。

相应的，本发明还公开了一种pSFV-p32病毒样颗粒、以及pSFV-p32病毒样颗粒的制备方法在RNA疫苗、治疗药物、动物模型中的应用。优选的，所述 RNA疫苗为防控非洲猪瘟流行病的疫苗。

下面以一具体实施例进一步阐述本发明

(一)实验准备

(1)试剂

DTaqDNA聚合酶、10×PCR BufferMgCl2(25mM)、dNTP(10mM)、 Marker、6×DNALoading Dye、10×TAE、一步法快速感受态细胞制备试剂盒， SanPrep柱式质粒DNA少量抽提试剂盒、琼脂糖、DNA柱式胶回收试剂盒购自生工生物工程股份有限公司；4S Red Plus核酸染色剂购自BBI血；胎牛血清 (Fetal Bovine Serum)、胰酶(0.25％Trypsin-EDTA)、DMEM培养基(DMEM/High glucose)、0.25％Trypsin-EDTA等试剂均来自Gibco公司；组织基因组DNA提取试剂盒购自天根；2x qPCR Mix购自诺唯赞；18-T Vector、SYBR PremixExTaqTM(Tli RNAseH plus)(RR420A)、PrimescriptTM RT reagent kit with gDNAEraser(Perfect Real Time)(RR047A)、胶回收试剂盒(Gel Extraction Kit)、 Stbl3感受态细胞、BamHI/AscI限制性内切酶购自宝生物工程(大连)有限公司； RNAprep pureTissue Kit(DP431)购自TIANGEN；质粒提取试剂盒(Plasmid Mini Kit)购自OMEGA公司；转染试剂Lipofectamine 3000Regeant购自Invitrogen 公司；pSFVCs-lacz(#92076)购自addgene；EGFP-C1(9号楼)，pSFV-sp6-EGFP 质粒(质粒来源于申请号为2021108223525《一种pSFVCs-EGFP病毒样颗粒及其制备方法》发明专利)SFV-helper(质粒来源于申请号为2021108224072《一种SFV-helper质粒》发明专利)。

(2)仪器

生物安全柜1300SERIES A2(Thermo公司)；恒温水浴锅DK-8D(一恒/ 上海)；二氧化碳培养箱Forma 371(Thermo公司)；生化培养箱DHP-9162(一恒/上海)；高性能高速台式冷冻离心机5804R(Eppendorf/德国)；电热恒温培养箱DHP-9162(一恒/上海)；涡旋振荡器Vortex(Thermo公司)；移液器Research plus(Eppendorf/德国)；倒置显微镜DMI1(德国徕卡)；countstar细胞计数仪 IC-1000(上海睿钰生物科技有限公司)；荧光定量PCR仪7500(ABI)；MicroAmp Optical 96-Well Reaction PlateN8010560(ABI)；MicroAmpTM OpticalAdhesive Film4311971(ABI)；洁净工作台SW-CJ-2FD(苏净安泰)；荧光显微镜(Leica，德国)；CO2培养箱HF240(力康)；离心机NeoFuge 1600R(力康)；FC500 流式细胞仪(Becton-Dickinson,美国)；高速离心机centrifuge 5840R(Eppendorf 公司，德国)；超纯水仪(Millipore公司，法国)；DYY-6C型稳流稳压电泳仪 (北京六一)；H6-1微型电泳槽(上海精益有机玻璃制品仪器厂)；FR980凝胶成像系统(上海复日科技有限公司)；SMA4000微量分光光度计(merinton)； PCR反应扩增仪(BIO公司)。

(二)实验内容

(1)构建得到pSFV-sp6-p32质粒；

(1.1)根据GenBank中登陆的ASFV p32的基因序列合成ASFV p32基因，所述ASFVp32基因的序列为SEQ ID NO.1；

(1.2)根据SnapGene软件，采用同源重组技术设计引物tongyong-F， SP6-p32-R并合成，所述引物tongyong-F的序列为SEQ ID NO.2，所述引物 SP6-p32-R的序列为SEQ IDNO.3；

表1菌液鉴定引物

(1.3)用BamHI/SmaI酶切双酶切质粒pSFV-sp6-EGFP；

用BamHI/SmaI酶切双酶切质粒pSFV-sp6-EGFP，酶切体系共300uL，分成6管，每管50uL，体系如下表2：

表2酶切体系

酶切结束后进行1％核酸凝胶电泳鉴定，在726bp、11045bp左右出现明显目的条带，于紫外光线下将11045bp左右条带的凝胶切下，尽量使切下的凝胶大小恰好包含所有目的条带，不要过大，切胶时要快速，切完立刻关闭紫外线，防止目的片段受到紫外线过度照射而降解。将切好的凝胶转移到2mL的EP管中，进行胶回收，并测定DNA浓度。

需要说明的是，步骤(1.3)中，所述pSFV-sp6-EGFP由下述方法制得：

设计与合成引物，所述引物包括设计引物Cs-EGFP-F和Cs-EGFP-R，以及菌液鉴定引物EGFP-鉴定-F和EGFP-鉴定-R：

以EGFP-C1为模板，以Cs-EGFP-F，Cs-EGFP-R为引物扩增Cs-EGFP片段，然后经过酶切、同源重组、重组产物转化和鉴定、提取质粒、酶切鉴定及测序，构建得到复制子质粒pSFVCs-sp6-EGFP；

又以pSFVCs-sp6-EGFP为模板，以设计与合成的引物EGFP-F，EGFP-R 扩增EGFP片段，然后经过酶切pSFVCs-sp6-EGFP、同源重组、重组产物转化和鉴定、提取质粒、酶切鉴定及测序，最终构建得到复制子质粒pSFV-sp6-EGFP。

下面以优选的具体实施例进一步阐述pSFV-sp6-EGFP质粒的制备方法

(A)引物设计与合成：

所述引物包括设计引物Cs-EGFP-F、Cs-EGFP-R、EGFP-F、EGFP-R以及菌液鉴定引物EGFP-鉴定-F、EGFP-鉴定-R、tongyong-F：

具体的，根据SnapGene软件，采用同源重组技术设计引物Cs-EGFP-F、 Cs-EGFP-R及菌液鉴定引物EGFP-鉴定-F、EGFP-鉴定-R，在金唯智科技有限公司(苏州)合成，设计引物如下表1-1：

表1-1基因合成引物

(B)复制子质粒pSFVCs-sp6-EGFP的构建：

以EGFP-C1为模板，以Cs-EGFP-F，Cs-EGFP-R为引物扩增Cs-EGFP片段，然后经过酶切、同源重组、重组产物转化和鉴定、提取质粒、酶切鉴定及测序，构建得到复制子质粒pSFVCs-sp6-EGFP。

其中，步骤(B)包括：

(B.1)以EGFP-C1为模板，Cs-EGFP-F，Cs-EGFP-R为引物扩增Cs-EGFP 片段；

(B.2)用BamHI酶切质粒pSFVCs-LacZ，得到酶切载体大片段；

(B.3)将所述Cs-EGFP片段和酶切载体大片段同源重组，得到重组产物；

(B.4)将重组产物加入到感受态细胞DH5α细胞，进行重组产物转化；

(B.5)将转化后的重组产物进行重组产物鉴定；

(B.6)将鉴定后的重组产物提取质粒；

(B.7)对所述质粒进行酶切鉴定及测序。

具体的，作为本发明一优选的具体实施例，步骤(2)包括：

(B.1)目的片段的扩增

以EGFP-C1为模板(图8)，Cs-EGFP-F，Cs-EGFP-R为引物扩增Cs-EGFP 片段，PCR体系和条件如下表1-2和表1-3所示：

表1-2 Cs-EGFP扩增PCR体系

表1-3 Cs-EGFP扩增PCR程序

PCR扩增结束后进行1％核酸凝胶电泳鉴定，在754bp左右出现明显目的条带，于紫外光线下将含有目的条带的凝胶切下，尽量使切下的凝胶大小恰好包含所有目的条带，不要过大，切胶时要快速，切完立刻关闭紫外线，防止目的片段受到紫外线过度照射而降解。将切好的凝胶转移到2mL的EP管中，进行胶回收，并测定DNA浓度。

(B.2)BamHI酶切质粒pSFVCs-LacZ

用BamHI酶切质粒pSFVCs-LacZ(购自addgene)(图9)，酶切体系共300uL，分成6管，每管50uL，体系如下表1-4：

表1-4酶切体系

酶切结束后进行0.8％核酸凝胶电泳鉴定，在3072bp、11851bp左右出现明显目的条带，于紫外光线下将11851bp左右条带的凝胶切下，尽量使切下的凝胶大小恰好包含所有目的条带，不要过大，切胶时要快速，切完立刻关闭紫外线，防止目的片段受到紫外线过度照射而降解。将切好的凝胶转移到2mL的EP 管中，进行胶回收，并测定DNA浓度。

(B.3)目的片段和酶切载体大片段同源重组

胶回收结束后将目的片段和载体片段按照合适的体积，于冰上配置以下反应体系(表1-5)，温柔的轻轻摇匀后，在37℃水浴锅中孵育30min中，然后放置4℃或冰上冷却。

表1-5同源重组体系

(B.4)重组产物转化

在冰上解冻克隆用的化学感受态细胞DH5α细胞，取10μL重组产物加入到 100μL感受态细胞中，轻弹管壁混匀(请勿振荡混匀)，冰上静置30min。42℃水浴热激45sec后，立即置于冰上冷却2-3min。加入900μLSOC，37℃摇菌1 h(转速200-250rpm)。将相应含氯霉素抗性的LB平板固体培养基在37℃培养箱中预热。5,000rpm离心5min，弃掉900μL上清。用剩余培养基将菌体重悬，用无菌涂布棒涂在有含氯霉素抗性的平板上轻轻涂匀。37℃培养箱中倒置培养 12-16h。

(B.5)重组产物鉴定

过夜培养后，查看平板的菌落并挑取其中菌落进行菌液鉴定，至于加有含氯霉素抗性的LB培养基的2mL EP管中，在37℃的摇床中培养约5个小时，然后进行菌液鉴定,鉴定片段为413bp，鉴定PCR体系如下表1-6：

表1-6菌液鉴定PCR体系

取鉴定阳性的菌液100uL于加有含氯霉素抗性的LP培养基的50mL离心管中进行大摇，过夜培养。

(B.6)提取质粒

1.柱平衡步骤：向吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)加入500μL的平衡液BL，12,000rpm(～13,400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

2.取15ml过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12,000 rpm(～13,400×g)离心1min，尽量吸除上清。

3.向留有菌体沉淀的离心管中加入500μL溶液P1，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。

4.向离心管中加入500μL溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。注意：温和地混合，不要剧烈震荡，以免打断基因组DNA，造成提取的质粒中混有基因组DNA片断。此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5min，以免质粒受到破坏。如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。

5.向离心管中加入700μL溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12,000rpm(～13,400×g)离心10min。注意：P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。

6.将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中12,000rpm (～13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。

7.向吸附柱CP3中加入600μL漂洗液PW(请先检查是否已加入无水乙醇)， 12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。

8.重复操作步骤7。

9.将吸附柱CP3放入收集管中,12,000rpm(～13,400×g)离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。将吸附柱CP3开盖，置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

10.将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50-100 μL洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12,000rpm(～13,400×g)离心2min将质粒溶液收集到离心管中。

(B.7)酶切鉴定及测序：

用SmaI、BamHI双酶切质粒，酶切体系共20uL，如下表1-7：

表1-7酶切体系

酶切结束后进行1％核酸凝胶电泳鉴定，条带经鉴定正确后，送去生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。

(C)复制子质粒pSFV-sp6-EGFP的构建：

(C.1)目的片段的扩增

以pSFVCs-sp6-EGFP为模板(图10)，EGFP-F，EGFP-R为引物扩增片段，PCR体系和条件如下：

表1-8 EGFP片段扩增PCR体系

表1-9 EGFP片段扩增PCR程序

PCR扩增结束后进行1％核酸凝胶电泳鉴定，在745bp左右出现明显目的条带，于紫外光线下将含有目的条带的凝胶切下，尽量使切下的凝胶大小恰好包含所有目的条带，不要过大，切胶时要快速，切完立刻关闭紫外线，防止目的片段受到紫外线过度照射而降解。将切好的凝胶转移到2mL的EP管中，进行胶回收，并测定DNA浓度。

(C.2)BamHI/Bg1II酶切双酶切质粒pSFVCs-sp6-EGFP

用BamHI/Bg1II酶切双酶切质粒pSFVCs-sp6-EGFP，酶切体系共300uL，分成6管，每管50uL，体系如下表1-10：

表1-10酶切体系

酶切结束后进行1％核酸凝胶电泳鉴定，在1508bp、11063bp左右出现明显目的条带，于紫外光线下将11063bp左右条带的凝胶切下，尽量使切下的凝胶大小恰好包含所有目的条带，不要过大，切胶时要快速，切完立刻关闭紫外线，防止目的片段受到紫外线过度照射而降解。将切好的凝胶转移到2mL的EP管中，进行胶回收，并测定DNA浓度。

(C.3)目的片段和酶切载体大片段同源重组

胶回收结束后将目的片段和载体片段按照合适的体积，于冰上配置以下反应体系(表1-11)，温柔的轻轻摇匀后，在37℃水浴锅中孵育30min中，然后放置4℃或冰上冷却。

表1-11同源重组体系

(C.4)重组产物转化

在冰上解冻克隆用的化学感受态细胞DH5α细胞，取10μL重组产物加入到 100μL感受态细胞中，轻弹管壁混匀(请勿振荡混匀)，冰上静置30min。 42℃水浴热激45sec后，立即置于冰上冷却2-3min。加入900μL SOC，37℃摇菌1h(转速200-250rpm)。将相应含氯霉素抗性的LB平板固体培养基在 37℃培养箱中预热。5,000rpm离心5min，弃掉900μL上清。用剩余培养基将菌体重悬，用无菌涂布棒涂在有含氯霉素抗性的平板上轻轻涂匀。37℃培养箱中倒置培养12-16h。

(C.5)重组产物鉴定

过夜培养后，查看平板的菌落并挑取其中菌落进行菌液鉴定，至于加有含氯霉素抗性的LP培养基的2mL EP管中，在37℃的摇床中培养约5个小时，然后进行菌液鉴定,鉴定片段为1467bp，鉴定PCR体系如下表1-12：

表1-12菌液鉴定PCR体系

取鉴定阳性的菌液100uL于加有含氯霉素抗性的LP培养基的50mL离心管中进行大摇，过夜培养。

(C.6)提取质粒

1.柱平衡步骤：向吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)加入500μL的平衡液BL，12,000rpm(～13,400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

2.取15ml过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12,000rpm (～13,400×g)离心1min，尽量吸除上清。

3.向留有菌体沉淀的离心管中加入500μL溶液P1，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。

4.向离心管中加入500μL溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。注意：温和地混合，不要剧烈震荡，以免打断基因组DNA，造成提取的质粒中混有基因组DNA片断。此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5min，以免质粒受到破坏。如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。

5.向离心管中加入700μL溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12,000rpm(～13,400×g)离心10min。注意：P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。

6.将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中12,000rpm (～13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。

7.向吸附柱CP3中加入600μL漂洗液PW(请先检查是否已加入无水乙醇)， 12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。

8.重复操作步骤7。

9.将吸附柱CP3放入收集管中,12,000rpm(～13,400×g)离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。将吸附柱CP3开盖，置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

10.将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50-100μL洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12,000rpm(～13,400×g)离心2min 将质粒溶液收集到离心管中。

(C.7)酶切鉴定及测序：

如下表1-13，用SmaI、BamHI双酶切，酶切体系共20uL

表1-13酶切体系

酶切结束后进行1％核酸凝胶电泳鉴定。条带经鉴定正确后，送去生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。

以此制得pSFV-sp6-EGFP质粒。

(1.4)将基因合成所述ASFV p32基因片段和步骤(1.3)酶切的载体片段同源重组，得到重组产物；

将基因合成的p32片段和载体片段按照合适的体积，于冰上配置以下反应体系，体系如下表3：

表3同源重组体系

温柔的轻轻摇匀后，在37℃水浴锅中孵育30min中，然后放置4℃或冰上冷却，得到图1所示的重组质粒pSFV-sp6-p32。

(1.5)将所述重组产物加入到感受态细胞DH5α细胞，进行重组产物转化；

在冰上解冻克隆用的化学感受态细胞DH5α细胞，取10μl重组产物加入到 100μl感受态细胞中，轻弹管壁混匀(请勿振荡混匀)，冰上静置30min。42℃水浴热激45sec后，立即置于冰上冷却2-3min。加入900μl SOC，37℃摇菌1h (转速200-250rpm)。将相应含氯霉素抗性的LB平板固体培养基在37℃培养箱中预热。5,000rpm离心5min，弃掉900μl上清。用剩余培养基将菌体重悬，用无菌涂布棒涂在有含氯霉素抗性的平板上轻轻涂匀。37℃培养箱中倒置培养 12-16h。

(1.6)将转化后的重组产物进行重组产物鉴定；

过夜培养后，查看平板的菌落并挑取其中菌落进行菌液鉴定，至于加有含氯霉素抗性的LB培养基的2mL EP管中，在37℃的摇床中培养约5个小时，然后进行菌液鉴定,鉴定片段为1344bp，鉴定PCR体系如下表4：

表4菌液鉴定PCR体系

取鉴定阳性的菌液100uL于加有含氯霉素抗性的LB培养基的50mL离心管中进行大摇，过夜培养。

(1.7)将鉴定后的重组产物提取质粒，包括以下步骤：

1.柱平衡步骤：向吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)加入500μl的平衡液BL，12,000rpm(～13,400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

2.取15ml过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12,000 rpm(～13,400×g)离心1min，尽量吸除上清。

3.向留有菌体沉淀的离心管中加入500μl溶液P1，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。

4.向离心管中加入500μl溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。注意：温和地混合，不要剧烈震荡，以免打断基因组DNA，造成提取的质粒中混有基因组DNA片断。此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5min，以免质粒受到破坏。如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。

5.向离心管中加入700μl溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12,000rpm(～13,400×g)离心10min。注意： P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。

6.将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中12,000rpm (～13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。

7.向吸附柱CP3中加入600μl漂洗液PW(请先检查是否已加入无水乙醇)， 12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱 CP3放入收集管中。

8.重复操作步骤7。

9.将吸附柱CP3放入收集管中,12,000rpm(～13,400×g)离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。将吸附柱CP3开盖，置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

10.将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加 50-100μl洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12,000rpm(～13,400×g)离心2min将质粒溶液收集到离心管中。

(1.8)对所述质粒进行酶切鉴定及测序。

用SmaI、BamHI双酶切，酶切体系共20uL，如下表5

表5酶切体系

酶切结束后进行1％核酸凝胶电泳鉴定，条带经鉴定正确后，送去生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。

(2)复制子质粒pSFV-sp6-p32和辅助质粒SFV-heleper体外转录；

(2.1)用SpeI分别酶切pSFV-sp6-p32及SFV-heleper，以线性化 pSFV-sp6-p32和SFV-helper；

步骤(2.1)中，所述SFV-helper质粒由下述方法制得：

(2.1.1)构建重组载体，构建得到的重组载体的序列为SEQ ID NO.4；

(2.1.2)构合成插入片段基因，所述插入片段的序列为SEQ ID NO.5；

(2.1.3)构将重组载体与插入片段进行同源重组，重组的产物转化DH5α感受态细菌，涂布平板，倒置培养，提取质粒，得到SFV-helper质粒，其中，所述SFV-helper质粒的序列为SEQ ID NO.6。

下面以优选的具体实施例进一步阐述SFV-helper质粒的制备方法

(2.1.1)构建重组载体：

(A)引物设计与合成

根据SnapGene软件，采用同源重组技术设计引物第一段-F、第一段-R、及第二段-F、第二段-R，在金唯智科技有限公司(苏州)合成，设计引物如下表 2-1：

表2-1扩增载体片段的引物

(B)载体片段的扩增

以pSFVCs-lacZ(#92076)购自addgene为模板，分别以第一段-F,第一段-R 为引物扩增片段1；以第二段-F,第二段-R为引物扩增片段2，PCR体系和条件分别如下表2-2、表2-3、表2-4、表2-5：

表2-2片段1扩增PCR体系

表2-3片段1扩增PCR程序

表2-4片段2扩增PCR体系

表2-5片段2扩增PCR程序

PCR扩增结束后进行1％核酸凝胶电泳鉴定，分别在3042bp、1665bp左右出现明显目的条带，于紫外光线下将含有目的条带的凝胶切下，尽量使切下的凝胶大小恰好包含所有目的条带，不要过大，切胶时要快速，切完立刻关闭紫外线，防止目的片段受到紫外线过度照射而降解。将切好的凝胶转移到2mL的 EP管中，进行胶回收，并测定DNA浓度。

(C)载体片段1、2同源重组

胶回收结束后将载体片段1、片段2按照合适的体积，于冰上配置以下反应体系，体系如下表2-6：

表2-6同源重组体系

轻轻摇匀后，在37℃水浴锅中孵育30min中，然后放置4℃或冰上冷却。

(D)重组产物转化

在冰上解冻克隆用的化学感受态细胞DH5α细胞，取10μl重组产物加入到 100μl感受态细胞中，轻弹管壁混匀(请勿振荡混匀)，冰上静置30min。42℃水浴热激45sec后，立即置于冰上冷却2-3min。加入900μl SOC，37℃摇菌1h (转速200-250rpm)。将相应含氯霉素抗性的LB平板固体培养基在37℃培养箱中预热。5,000rpm离心5min，弃掉900μl上清。用剩余培养基将菌体重悬，用无菌涂布棒涂在有含氯霉素抗性的平板上轻轻涂匀。37℃培养箱中倒置培养 12-16h。

(E)重组产物鉴定

过夜培养后，查看平板的菌落并挑取其中菌落进行菌液鉴定，至于加有含氯霉素抗性的LB培养基的2mL EP管中，在37℃的摇床中培养约5个小时，然后进行菌液鉴定,鉴定片段为4691bp，鉴定PCR体系如下表2-7：

表2-7菌液鉴定PCR体系

取鉴定阳性的菌液100uL于加有含氯霉素抗性的LP培养基的50mL离心管中进行大摇，过夜培养。

(F)提取质粒

柱平衡步骤：向吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)加入500μl的平衡液BL，12,000rpm(～13,400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

取15ml过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12,000rpm (～13,400×g)离心1min，尽量吸除上清。

向留有菌体沉淀的离心管中加入500μl溶液P1，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。

向离心管中加入500μl溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。注意：温和地混合，不要剧烈震荡，以免打断基因组DNA，造成提取的质粒中混有基因组DNA片断。此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5min，以免质粒受到破坏。如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。

向离心管中加入700μl溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12,000rpm(～13,400×g)离心10min。注意：P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。

将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中12,000rpm (～13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。

向吸附柱CP3中加入600μl漂洗液PW(请先检查是否已加入无水乙醇)， 12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。

重复操作步骤7。

将吸附柱CP3放入收集管中,12,000rpm(～13,400×g)离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。将吸附柱CP3开盖，置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50-100 μl洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12,000rpm(～13,400×g)离心2min将质粒溶液收集到离心管中。

(G)重组载体测序

提取的质粒进行酶切，经鉴定正确后，送去金唯智生物科技有限公司进行测序。

(2.1.2)合成插入片段基因，

需要插入的SFV-heper基因的序列如SEQ ID NO.5所示，将其进行基因合成。

(2.1.3)将重组载体与插入片段进行同源重组，

(A)同源重组、转化及提取质粒

将重组载体与插入片段进行同源重组。重组的产物转化DH5α感受态细菌，涂布氨苄抗性的LB平板，37℃倒置培养16小时。将菌落PCR阳性的菌落进行小摇，保菌，参照OMEGA质粒小量提取试剂盒说明书提取质粒

(B)质粒酶切鉴定及测序

将提取的质粒酶切鉴定，1％琼脂糖凝胶电泳检测结果；将验证正确的结果送到金唯智生物科技有限公司进行测序。

以此制得SFV-helper质粒。

(2.2)线性化后的pSFV-sp6-p32及SFV-heleper进行体外转录，根据 mMESSAGEmMACHINE^TMSP6转录试剂盒(AM1340，购自赛默飞)所述方法进行体外转录，体系如下表6、7：

表6 pSFV-sp6-p32体外转录体系

表7 SFV-helper体外转录体系

上述体系配好后37℃转录40min，然后加入1uL GTP 37℃继续转录2h,随后再加入1uL TURBO DNase37℃、15min。转录结束后分别吸取1uL转录产物，加入4uL的Nuclease-free Water及6×loading buffer进行稀释，注意无菌操作及防止RNA降解，然后在1％SDS-page中进行电泳实验，验证条带正确与否。

(2.3)pSFV-sp6-p32及SFV-heleper体外转录的mRNA共电转入BHK细胞中，包括：

1.细胞提前传至T75方瓶中，当细胞汇合度达到80％时，进行实验；

2.在冰上预冷1.5ml EP管和PBS。在-20℃冰箱中预冷0.2mm比色杯(电极杯)；

3. 37℃预热6毫升培养基(含1％FBS DMEM)；

4.胰蛋白酶消化T25方瓶中细胞并用5毫升完全培养基重新悬浮；

5. 500g、4℃离心5分钟；

6.弃去上清液，并用10ml冰冷PBS清洗细胞颗粒；

7. 500g、4℃离心5分钟，再次重复PBS清洗；

8.弃去上清液并完全去除残留的PBS,并用遇冷的260uL PBS重悬细胞，混匀后分别吸取260uL的PBS细胞重悬液别置于预冷的1.5ml EP管；

9.PBS细胞重悬液分别加入10uL的pSFVCs-sp6-p32及SFV-heleper转录产物放置冰上；

10.将上述混合物转移到预冷的电极杯(4mm)中，设置电转仪条件同为100 V，20ms，电击一次，电击后置于冰上1min；

11.然后分别向电极杯中加入约400ul的含1％FBS DMEM吹打混匀，随即转至T25方瓶中，并加入6mL含1％FBS DMEM,放置37℃5％CO2培养箱中进行培养；

12.电穿孔后观察细胞生长情况，待36h后收取上清液保存于-80℃。

(3)、间接免疫荧光实验鉴定p32蛋白表达

1.上述收取上清后的细胞，用预冷至4℃的甲醇固定过夜，PBST洗涤三次；正常BHK细胞用作空白对照；

2.加入5％1mL的BSA，37℃孵育1h,PBST洗涤三次；

3.每孔加入1500倍稀释的非洲猪瘟血清，37℃孵育1h,PBST洗涤三次；

4.每孔加入200倍稀释的IFTC标记的山羊抗猪IgG,37℃孵育1h,PBST洗涤三次,注意避光；

5，培养板置于荧光显微镜下观察，及与正常细胞进行对比。

(4)pSFV-p32病毒颗粒TCID₅₀的测定

用DMEM培养基将pSFV-p32病毒作连续10倍稀释，即10-1、10-2…10-8 每个稀释度取100μL加入96孔细胞培养板中，随后加入经0.25％胰酶消化的 BHK-21细胞100μL(细胞含量以105/mL左右为宜)，每个稀释度作8个重复，并设空白细胞培养对照。置37℃5％CO2培养箱中。逐日观察细胞病变，并记录细胞病变孔数，直到对照细胞老化脱落为止。按照Reed-Muench法计算病毒的TCID50。

(三)实验结果

(1)BamHI/SmaI酶切双酶切质粒pSFV-sp6-EGFP

BamHI/SmaI酶切双酶切质粒pSFV-sp6-EGFP后，如下图片段分别为 11051bp、725bp与理论值相符合，如下图2所示。图2中，M由上至下分别是:15000,10000,7500,5000,3000,1500,1000,500，1为SmaI、BamH双酶切片段。

(2)重组质粒菌液鉴定

分别挑取8个菌落，进行鉴定，如下图3所示的重组质粒菌液鉴定结果，菌落2,5,6,7,8大小均为1344bp左右，与理论值大小相符合。图3中，M由上至下分别是:2000、1000、750、500、250、100。

(3)酶切鉴定及测序

用SmaI、BamHI对菌液鉴定成功的质粒双酶切,如图4所示的片段大小分别为593bp、11051bp，与理论值大小相符合；送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，测序结果完全相同。

图4中M由上至下分别是:15000,10000,7500,5000,3000，1500,1000,500；1 为SmaI、BamH双酶切片段。

(4)复制子质粒pSFV-sp6-p32和辅助质粒SFV-heleper体外转录

用SpeI分别酶切pSFV-sp6-p32及SFV-heleper后，根据mMESSAGE mMACHINE^TMSP6转录试剂盒(AM1340，购自赛默飞)所述方法进行体外转录，如下图5、6：

图5中，M1由上至下分别是:15000,10000,7500,5000,3000,1500,1000,500； M2由上至下分别是:8000,5000,3000,1500，1000，500；泳道2为pSFV-sp6-p32 体外转录结果；

图6中，M由上至下分别是:8000,5000,3000,1500，1000，500；泳道4为 SFV-helper体外转录结果。

由图5和图6可知，pSFV-sp6-p32及SFV-helper体外转录经电泳后的目的条带与理论值相符合。

(5)间接免疫荧光实验鉴定p32蛋白表达

上述体外转录的pSFVCs-sp6-p32、SFV-helper起电转入BHK细胞中,然后接入T25方瓶中进行培养，36h后收集上清液后的细胞进行IFA鉴定ASFV p32 蛋白的表达，结果发现有较强荧光表达，而阴性对照组却无荧光表达(图7)。

(6)pSFV-p32病毒颗粒TCID₅₀的测定

按照Reed-Muench法计算病毒的滴度为10^-3TCID₅₀/_0.1mL，滴度满足于后续的动物实验要求。

综上，本发明经过IFA实验成功鉴定了p32的蛋白表达，为后续其它重要非洲外源蛋白的表达筛选和mRNA疫苗研制提供可靠的实验基础和科学依据。

以上所述的仅为本发明一种较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。

序列表

<110> 华农（肇庆）生物产业技术研究院有限公司

<120> pSFV-p32病毒样颗粒及其制备方法和应用

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 627

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

atagcaccat gaatggatcc atggatttta ttttaaatat atccatgaaa atggaggtca 60

tcttcaaaac ggatttaaga tcatcttcac aagttgtgtt tcatgcgggt agcctgtata 120

attggttttc tgttgagatt atcaatagcg gtagaattgt tacgaccgct ataaaaacat 180

tgcttagtac tgttaagtat gatattgtga aatctgctcg tatatatgca gggcaagggt 240

atactgaaca tcaggctcaa gaagaatgga atatgattct gcatgtgctg tttgaagagg 300

agacggaatc ctcagcatct tcggagaaca ttcatgaaaa aaatgataat gaaaccaatg 360

aatgcacatc ctcctttgaa acgttgtttg agcaagagcc ctcatcggag gtacctaaag 420

actccaagct gtatatgctt gcacaaaaga ctgtgcaaca tattgaacaa tatggaaagg 480

cacctgattt taacaaggtt attagagcac ataattttat tcaaaccatt tatggaaccc 540

ctctaaagga agaagaaaaa gaggtggtaa gactcatggt tattaaactt ttaaaaaaaa 600

aataacccgg gtaattaatt gaattac 627

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

ggtttaatga tcctcgaaga tc 22

<210> 3

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

gtaattcaat taattacccg ggttattttt tttttaaaag tttaataacc atgag 55

<210> 4

<211> 3538

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

cactataccg acaggagcgg gcaaaccggg agacagtggc cggcccatct ttgacaacaa 60

gggtagggta gtcgctatcg tcctgggcgg ggccaacgag ggctcacgca cagcactgtc 120

ggtggtcacc tggaacaaag atatggtgac tagagtgacc cccgaggggt ccgaagagtg 180

gtccgccccg ctgattactg ccatgtgtgt ccttgccaat gctaccttcc cgtgcttcca 240

gcccccgtgt gtaccttgct gctatgaaaa caacgcagag gccacactac ggatgctcga 300

ggataacgtg gataggccag ggtactacga cctccttcag gcagccttga cgtgccgaaa 360

cggaacaaga caccggcgca gcgtgtcgca acacttcaac gtgtataagg ctacacgccc 420

ttacatcgcg tactgcgccg actgcggagc agggcactcg tgtcatagcc ccgtagcaat 480

tgaagcggtc aggtccgaag ctaccgacgg gatgctgaag attcagttct cggcacaaat 540

tggcatagat aagagtgaca atcatgacta cacgaagata aggtacgcag acgggcacgc 600

cattgagaat gccgtccggt catctttgaa ggtagccacc tccggagact gtttcgtcca 660

tggcacaatg ggacatttca tactggcaaa gtgcccaccg ggtgaattcc tgcaggtctc 720

gatccaggac accagaaacg cggtccgtgc ctgcagaata caatatcatc atgaccctca 780

accggtgggt agagaaaaat ttacaattag accacactat ggaaaagaga tcccttgcac 840

cacttatcaa cagaccacag cgaagaccgt ggaggaaatc gacatgcata tgccgccaga 900

tacgccggac aggacgttgc tatcacagca atctggcaat gtaaagatca cagtcggagg 960

aaagaaggtg aaatacaact gcacctgtgg aaccggaaac gttggcacta ctaattcgga 1020

catgacgatc aacacgtgtc taatagagca gtgccacgtc tcagtgacgg accataagaa 1080

atggcagttc aactcacctt tcgtcccgag agccgacgaa ccggctagaa aaggcaaagt 1140

ccatatccca ttcccgttgg acaacatcac atgcagagtt ccaatggcgc gcgaaccaac 1200

cgtcatccac ggcaaaagag aagtgacact gcaccttcac ccagatcatc ccacgctctt 1260

ttcctaccgc acactgggtg aggacccgca gtatcacgag gaatgggtga cagcggcggt 1320

ggaacggacc atacccgtac cagtggacgg gatggagtac cactggggaa acaacgaccc 1380

agtgaggctt tggtctcaac tcaccactga agggaaaccg cacggctggc cgcatcagat 1440

cgtacagtac tactatgggc tttacccggc cgctacagta tccgcggtcg tcgggatgag 1500

cttactggcg ttgatatcga tcttcgcgtc gtgctacatg ctggttgcgg cccgcagtaa 1560

gtgcttgacc ccttatgctt taacaccagg agctgcagtt ccgtggacgc tggggatact 1620

ctgctgcgcc ccgcgggcgc acgcagctag tgtggcagag actatggcct acttgtggga 1680

ccaaaaccaa gcgttgttct ggttggagtt tgcggcccct gttgcctgca tcctcatcat 1740

cacgtattgc ctcagaaacg tgctgtgttg ctgtaagagc ctttcttttt tagtgctact 1800

gagcctcggg gcaaccgcca gagcttacga acattcgaca gtaatgccga acgtggtggg 1860

gttcccgtat aaggctcaca ttgaaaggcc aggatatagc cccctcactt tgcagatgca 1920

ggttgttgaa accagcctcg aaccaaccct taatttggaa tacataacct gtgagtacaa 1980

gacggtcgtc ccgtcgccgt acgtgaagtg ctgcggcgcc tcagagtgct ccactaaaga 2040

gaagcctgac taccaatgca aggtttacac aggcgtgtac ccgttcatgt ggggaggggc 2100

atattgcttc tgcgactcag aaaacacgca actcagcgag gcgtacgtcg atcgatcgga 2160

cgtatgcagg catgatcacg catctgctta caaagcccat acagcatcgc tgaaggccaa 2220

agtgagggtt atgtacggca acgtaaacca gactgtggat gtttacgtga acggagacca 2280

tgccgtcacg atagggggta ctcagttcat attcgggccg ctgtcatcgg cctggacccc 2340

gttcgacaac aagatagtcg tgtacaaaga cgaagtgttc aatcaggact tcccgccgta 2400

cggatctggg caaccagggc gcttcggcga catccaaagc agaacagtgg agagtaacga 2460

cctgtacgcg aacacggcac tgaagctggc acgcccttca cccggcatgg tccatgtacc 2520

gtacacacag acaccttcag ggttcaaata ttggctaaag gaaaaaggga cagccctaaa 2580

tacgaaggct ccttttggct gccaaatcaa aacgaaccct gtcagggcca tgaactgcgc 2640

cgtgggaaac atccctgtct ccatgaattt gcctgacagc gcctttaccc gcattgtcga 2700

ggcgccgacc atcattgacc tgacttgcac agtggctacc tgtacgcact cctcggattt 2760

cggcggcgtc ttgacactga cgtacaagac cgacaagaac ggggactgct ctgtacactc 2820

gcactctaac gtagctactc tacaggaggc cacagcaaaa gtgaagacag caggtaaggt 2880

gaccttacac ttctccacgg caagcgcatc accttctttt gtggtgtcgc tatgcagtgc 2940

tagggccacc tgttcagcgt cgtgtgagcc cccgaaagac cacatagtcc catatgcggc 3000

tagccacagt aacgtagtgt ttccagacat gtcgggcacc gcactatcat gggtgcagaa 3060

aatctcgggt ggtctggggg ccttcgcaat cggcgctatc ctggtgctgg ttgtggtcac 3120

ttgcattggg ctccgcagat aagttagggt aggcaatggc attgatatag caagaaaatt 3180

gaaaacagaa aaagttaggg taagcaatgg catataacca taactgtata acttgtaaca 3240

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aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaactagtct 3480

gcattaatga atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc gctcttcc 3538

<210> 5

<211> 3538

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

cactataccg acaggagcgg gcaaaccggg agacagtggc cggcccatct ttgacaacaa 60

gggtagggta gtcgctatcg tcctgggcgg ggccaacgag ggctcacgca cagcactgtc 120

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gtccgccccg ctgattactg ccatgtgtgt ccttgccaat gctaccttcc cgtgcttcca 240

gcccccgtgt gtaccttgct gctatgaaaa caacgcagag gccacactac ggatgctcga 300

ggataacgtg gataggccag ggtactacga cctccttcag gcagccttga cgtgccgaaa 360

cggaacaaga caccggcgca gcgtgtcgca acacttcaac gtgtataagg ctacacgccc 420

ttacatcgcg tactgcgccg actgcggagc agggcactcg tgtcatagcc ccgtagcaat 480

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cattgagaat gccgtccggt catctttgaa ggtagccacc tccggagact gtttcgtcca 660

tggcacaatg ggacatttca tactggcaaa gtgcccaccg ggtgaattcc tgcaggtctc 720

gatccaggac accagaaacg cggtccgtgc ctgcagaata caatatcatc atgaccctca 780

accggtgggt agagaaaaat ttacaattag accacactat ggaaaagaga tcccttgcac 840

cacttatcaa cagaccacag cgaagaccgt ggaggaaatc gacatgcata tgccgccaga 900

tacgccggac aggacgttgc tatcacagca atctggcaat gtaaagatca cagtcggagg 960

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atggcagttc aactcacctt tcgtcccgag agccgacgaa ccggctagaa aaggcaaagt 1140

ccatatccca ttcccgttgg acaacatcac atgcagagtt ccaatggcgc gcgaaccaac 1200

cgtcatccac ggcaaaagag aagtgacact gcaccttcac ccagatcatc ccacgctctt 1260

ttcctaccgc acactgggtg aggacccgca gtatcacgag gaatgggtga cagcggcggt 1320

ggaacggacc atacccgtac cagtggacgg gatggagtac cactggggaa acaacgaccc 1380

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cgtacagtac tactatgggc tttacccggc cgctacagta tccgcggtcg tcgggatgag 1500

cttactggcg ttgatatcga tcttcgcgtc gtgctacatg ctggttgcgg cccgcagtaa 1560

gtgcttgacc ccttatgctt taacaccagg agctgcagtt ccgtggacgc tggggatact 1620

ctgctgcgcc ccgcgggcgc acgcagctag tgtggcagag actatggcct acttgtggga 1680

ccaaaaccaa gcgttgttct ggttggagtt tgcggcccct gttgcctgca tcctcatcat 1740

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