一种基于双硫仑的两亲性嵌段共聚物前药及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种基于双硫仑的两亲性嵌段共聚物前药及其制备方法和应用 (Disulfiram-based amphiphilic block copolymer prodrug and preparation method and application thereof ) 是由 王林格 方宇煌 于倩倩 徐蒙蒙 于 2021-07-09 设计创作，主要内容包括：本发明属于纳米医药及新材料领域,公开了一种双硫仑前药单体和基于该单体合成的两亲性嵌段共聚物前药及其制备方法和应用。该制备方法首先合成双硫仑前药单体,然后通过可逆加成断裂转移(RAFT)法将亲水性的聚乙二醇丙烯酸甲酯单体(PEGA)和疏水性的双硫仑前药单体(DTCM)共聚,得到所述两亲性嵌段共聚物前药(PPEGA-PDTCM),进而构建其自组装聚合物囊泡。本发明制备的聚合物囊泡可提高双硫仑的溶解性和稳定性,避免双硫仑在体内过早释放,以克服双硫仑临床治疗的局限性,并且这种聚合物囊泡能同时负载另一种药物,实现两种药物联合治疗。该聚合物囊泡具有较好的还原响应释药性,并具有抑制肿瘤细胞生长的活性。(The invention belongs to the field of nano medicines and new materials, and discloses a disulfiram prodrug monomer, an amphiphilic block copolymer prodrug synthesized based on the monomer, and a preparation method and application of the amphiphilic block copolymer prodrug. The preparation method comprises the steps of firstly synthesizing a disulfiram prodrug monomer, then copolymerizing a hydrophilic polyethylene glycol methyl acrylate monomer (PEGA) and a hydrophobic disulfiram prodrug monomer (DTCM) by a Reversible Addition Fragmentation Transfer (RAFT) method to obtain the amphiphilic block copolymer prodrug (PPEGA-PDTCM), and further constructing the self-assembly polymer vesicle of the amphiphilic block copolymer prodrug. The polymersome prepared by the invention can improve the solubility and stability of disulfiram, avoid the premature release of disulfiram in vivo, overcome the limitation of clinical treatment of disulfiram, and can simultaneously load another drug to realize the combined treatment of the two drugs. The polymersome has good reduction response drug release property and activity of inhibiting the growth of tumor cells.)
技术领域
本发明属于纳米医药及新材料领域，涉及一种双硫仑前药单体、基于该双硫仑前药单体合成的两亲性嵌段共聚物前药、基于该两亲性嵌段共聚物前药制备的聚合物囊泡以及该聚合物囊泡在药物载体方面的应用。
背景技术
双硫仑(disulfiram)是获得FDA批准的一种治疗酒精中毒的药物。上世纪70年代以来，大量临床研究发现双硫仑对多种癌症显示出良好的抗肿瘤作用(Cvek B.Drugdiscovery today,2012,17(9-10):409-412)。双硫仑的抗肿瘤作用具有铜离子依赖性。双硫仑在体内代谢并转化为双硫仑衍生物二乙基二硫代氨基甲酸(DTC)，后者可与铜离子螯合并形成Cu(DTC)2螯合物(LIU P,et al.British Journal of Cancer,2012,107(9):1488-97)。目前普遍认为Cu(DTC)2在基于双硫仑的肿瘤治疗中起着重要作用。最近的研究表明，Cu(DTC)2能够靶向p97-NPL4-UFDI信号通路(SKROTT Z,et al.Nature,2017,552(7684):194-9)。Cu(DTC)2与NPL4蛋白中结合锌离子的巯基位点相结合，导致NPL4的聚集。NPL4的聚集导致p97 segregase失活，从而导致错误折叠的蛋白在内质网中积累，最终引起细胞凋亡。
虽然双硫仑的口服剂型早已用于戒酒，但由于双硫仑在胃环境中稳定性差，且在体内容易降解成低药效分子，该剂型在癌症治疗中不起作用。因此，亟需开发更加有效的给药系统，以满足双硫仑作为抗癌药物的临床应用需求。利用纳米药物载体负载双硫仑，可以最小化双硫仑在体内循环中的降解，显著改善其循环半衰期，还可以利用肿瘤部位高渗透长滞留效应(EPR effect)被动靶向肿瘤，促进双硫仑在肿瘤组织中的富集，提高抑瘤效果，降低双硫仑对正常组织的毒副作用。
现有技术中，公开号为CN109700782A的中国专利公开了一种双硫仑纳米粒，公开号为CN108513543A的中国专利公开一种包封双硫仑的聚合物纳米粒，授权号为CN105125495B的中国专利公开了一种聚酯类材料担载双硫仑的纳米粒，上述技术均采用纳米粒物理包载双硫仑的递送模式，提高了双硫仑的溶解性和稳定性，但物理包载无法避免药物的过早释放。体内循环过程中的药物过早释放会导致肿瘤部位的药物暴露量减少，使抗肿瘤效果减弱，同时也增加了对健康器官的伤害。针对药物过早释放的问题，将药物分子与载体通过共价键结合，能够有效抑制药物的过早释放。例如，将药物和两亲性嵌段共聚物通过共价键相结合，得到两亲性嵌段共聚物前药，并通过溶液自组装形成纳米尺寸的前药载体(比如胶束或囊泡)，与通过物理包裹药物的药物载体相比，更有效地提高药物的溶解性和稳定性，使药物在血液循环过程中的过早释放最小化。此外，前药载体可通过药物和载体之间共价键的设计，控制药物的释放行为。例如，载体与药物之间通过响应性共价键连接(比如还原响应性的二硫键)，利用肿瘤细胞内谷胱甘肽(一种生物还原剂)浓度高于血液和正常细胞的特点，可以实现在肿瘤细胞内触发药物释放，而在血液和正常细胞内维持药物的稳定，从而有效抑制药物的过早释放以及对正常组织的损害。
发明内容
针对双硫仑水溶性差、易降解以及过早释放的问题，本发明的目的在于提供一种双硫仑前药单体和基于该单体合成的两亲性嵌段共聚物前药，通过该两亲性嵌段共聚物前药自组装形成聚合物囊泡；这种聚合物囊泡能够提高双硫仑的溶解性和稳定性，避免双硫仑在人体内过早释放，并能作为药物载体实现双硫仑与其他药物共递送联合抗肿瘤。
本发明的另一个目的是提供上述的双硫仑前药单体和基于该单体合成的两亲性嵌段共聚物前药，以及基于该两亲性嵌段共聚物前药的聚合物囊泡的合成和制备方法。
本发明再一目的是提供上述的上述聚合物囊泡在制备药物载体中的应用。。
本发明通过以下方式实现：
一种双硫仑前药单体，具有式(I)的结构：
一种基于双硫仑前药单体的两亲性嵌段共聚物前药，具有式(II)的结构：
式(I)中，x＝1～20；y＝5～20；z＝8～17。
一种双硫仑前药单体的合成方法，包括以下具体步骤：
(a)在二氯甲烷中，将二乙胺、巯基乙醇、二硫化碳、三乙胺、四溴化碳混合后进行反应，得到产物HDTC；
(b)在二氯甲烷中，将HDTC、甲基丙烯酰氯、三乙胺混合后进行酯化反应，得到具有式(I)结构的双硫仑前药单体DTCM。
所述步骤(a)中，二乙胺、巯基乙醇、二硫化碳、三乙胺、四溴化碳的摩尔比为1:1:1:(1～2):(1～2)；所述反应的温度为20～32℃；反应的时间为1～4h，优选为2h。
所述步骤(b)中，HDTC、甲基丙烯酰氯、三乙胺的摩尔比为1:(1～2):(1～2)；反应的温度为20～32℃；反应的时间为8～15h，优选为12h。
一种基于双硫仑前药单体的两亲性嵌段共聚物前药的合成方法，包括以下具体步骤：
(a)在N,N-二甲基甲酰胺中，以4,4-偶氮双(4-氰基戊酸)作为引发剂，以4-氰基-4-[(十二烷基硫烷基硫羰基)硫烷基]戊酸作为转移剂，对具有式(I)结构的双硫仑前药单体DTCM进行聚合反应，得到聚合物前药PDTCM；
(b)在N,N-二甲基甲酰胺中，以聚合物前药PDTCM作为大分子链转移剂，以4,4-偶氮双(4-氰基戊酸)作为引发剂，对PEGA进行聚合，得到具有式(II)结构的两亲性嵌段共聚物前药PPEGA-PDTCM。
所述步骤(a)中，4,4-偶氮双(4-氰基戊酸)、4-氰基-4-[(十二烷基硫烷基硫羰基)硫烷基]戊酸、DTCM的摩尔比为(0.1～0.5):1:(10～100)；反应的温度为60～80℃；反应时间为12～36h，优选为24h。
所述步骤(b)中，4,4-偶氮双(4-氰基戊酸)、PDTCM、PEGA的摩尔比为(0.1～0.5):1:(10～100)；反应的温度为60～80℃，反应时间为12～36h，优选为24h。
一种制备基于两亲性嵌段共聚物前药的聚合物囊泡的方法，包括以下具体步骤：
(a)：将所述的两亲性嵌段共聚物前药PPEGA-PDTCM溶于有机溶剂，注入水，同时搅拌溶液；
(b)：将得到的混合溶液透析，然后进行冷冻干燥，得到所述的基于两亲性嵌段共聚物前药的聚合物囊泡。
所述步骤(a)中，有机溶剂为四氢呋喃、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、1,4-二氧六环中的至少一种；有机溶剂与水的体积比为1:(2～10)；水注入速率为0.5～5mL/h；搅拌速率为600～1000rpm。
所述步骤(b)中，透析袋的截留分子量为1000～3500Da；透析的时间为12～48h。
上述聚合物囊泡在制备药物载体中的应用。
一种基于聚合物囊泡的药物载体制备方法，包括以下具体步骤：
当负载亲水性药物时，方法为：
(a)：将所述的两亲性嵌段共聚物前药PPEGA-PDTCM溶于有机溶剂得到聚合物溶液，将亲水性药物溶于水中得到药物溶液，将药物溶液注入到聚合物溶液中，同时搅拌溶液；
(b)：将得到的混合溶液透析，然后进行冷冻干燥，得到所述的基于聚合物囊泡的负载亲水性药物的药物载体；
所述步骤(a)中，有机溶剂为四氢呋喃、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、1,4-二氧六环中的至少一种；亲水性药物为盐酸阿霉素、盐酸表阿霉素、盐酸吉西他滨中的至少一种；亲水性药物与两亲性嵌段共聚物前药的质量比为1：(1～20)；有机溶剂与水的体积比为1:(2～10)；药物溶液注入速率为0.5～5mL/h；搅拌速率为600～1000rpm。
所述步骤(b)中，透析袋的截留分子量为1000～3500Da；透析时间为12～48h。
当负载疏水性药物时，方法为：
(a)：将所述的疏水性药物和两亲性嵌段共聚物前药PPEGA-PDTCM一起溶于有机溶剂，注入水，同时搅拌溶液；
(b)：将得到的混合溶液透析；然后进行冷冻干燥，得到所述的基于聚合物囊泡的负载疏水性药物的药物载体。
所述步骤(a)中，疏水性药物为阿霉素、吉西他滨、紫杉醇中的至少一种；疏水性药物与两亲性嵌段共聚物前药的质量比为1：(1～20)；有机溶剂为四氢呋喃、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、1,4-二氧六环中的至少一种；所述有机溶剂与水的体积比为1:(2～10)；水注入速率为0.5～5mL/h；搅拌速率为600～1000rpm。
所述步骤(b)中，透析袋的截留分子量为1000～3500Da；透析时间为12～48h。
所述基于聚合物囊泡的药物载体在制备治疗肿瘤药物中的应用。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种双硫仑前药单体DTCM，与另一种单体PEGA共聚得到两亲性嵌段共聚物前药PPEGA-PDTCM，然后通过溶液自组装制备了基于PPEGA-PDTCM的聚合物囊泡。这种聚合物囊泡突破了纳米粒物理包载双硫仑的递送模式，不仅有效改善了双硫仑的溶解性和稳定性，而且能避免双硫仑在体内循环过程中的过早释放，同时能在肿瘤部位还原性环境下响应触发双硫仑单体的释放。此外，该聚合物囊泡能够包载其他亲水或疏水的药物，从而实现了双硫仑与其他药物的共递送联合抗肿瘤，进一步提高肿瘤治疗效果。
附图说明
图1为本发明所述双硫仑前药单体的1H NMR谱图。
图2为本发明所述两亲性嵌段共聚物前药的1H NMR谱图。
图3为本发明所述聚合物囊泡的示意图。
图4为本发明所述聚合物囊泡的形貌(TEM)和粒径分布(DLS)图。
图5为本发明所述负载阿霉素的聚合物囊泡(左)和负载盐酸阿霉素的聚合物囊泡(右)的形貌(TEM)。
图6为本发明所述两亲性嵌段共聚物前药在10mM谷胱甘肽条件下释放双硫仑单体的1H NMR谱图。
图7为本发明所述负载盐酸阿霉素的聚合物囊泡在不同还原条件下的还原触发的盐酸阿霉素累积释放曲线图。
图8为本发明所述负载盐酸阿霉素的聚合物囊泡对肿瘤细胞生长的抑制效果(上：没有添加氯化铜；下：添加0.25μg/mL氯化铜)。
具体实施方式
为了清楚了解本发明的技术方案，下面结合附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述，但不应理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。本发明所述室温为20～32℃。
实施例1双硫仑前药单体DTCM的合成
称取2.19g二乙胺(30.0mmol)和2.34g巯基乙醇(30.0mmol)于单口烧瓶中，加入30.0mL无水二氯甲烷，冰浴。依次加入2.28g二硫化碳(30.0mmol)、3.03g三乙胺(30.0mmol)和9.94g四溴化碳(30.0mmol)，室温下搅拌反应2h。反应结束后，用水洗涤3次，使用无水硫酸钠干燥过夜。旋蒸浓缩，然后以正己烷/乙酸乙酯作为洗脱剂，通过色谱柱层析进行纯化，得到黄色油状产物，命名为HDTC。
称取1.0g HDTC(4.4mmol)和0.44g三乙胺(4.4mmol)于单口烧瓶中，加入20.0mL无水二氯甲烷，冰浴。加入0.46g甲基丙烯酰氯(4.4mmol)，室温下搅拌反应12h。反应结束后，用饱和氯化钠溶液和去离子水洗涤3次，使用无水硫酸钠干燥过夜。旋蒸浓缩，然后以正己烷/乙酸乙酯作为洗脱剂，通过色谱柱层析进行纯化，得到淡黄色油状产物(DTCM)。
实施例2双硫仑前药单体DTCM的合成
称取2.19g二乙胺(30.0mmol)和2.34g巯基乙醇(30.0mmol)于单口烧瓶中，加入30.0mL无水二氯甲烷，冰浴。依次加入2.28g二硫化碳(30.0mmol)、3.03g三乙胺(30.0mmol)和14.92g四溴化碳(45.0mmol)，室温下搅拌反应2h。反应结束后，用水洗涤3次，使用无水硫酸钠干燥过夜。旋蒸浓缩，然后以正己烷/乙酸乙酯作为洗脱剂，通过色谱柱层析进行纯化，得到黄色油状产物，命名为HDTC。
称取1.0g HDTC(4.4mmol)和0.67g三乙胺(6.6mmol)于单口烧瓶中，加入20.0mL无水二氯甲烷，冰浴。加入0.69g甲基丙烯酰氯(6.6mmol)，室温下搅拌反应12h。反应结束后，用饱和氯化钠溶液和去离子水洗涤3次，使用无水硫酸钠干燥过夜。旋蒸浓缩，然后以正己烷/乙酸乙酯作为洗脱剂，通过色谱柱层析进行纯化，得到淡黄色油状产物(DTCM)，1H NMR谱图如图1所示。
实施例3双硫仑前药单体DTCM的合成
称取2.19g二乙胺(30.0mmol)和2.34g巯基乙醇(30.0mmol)于单口烧瓶中，加入30.0mL无水二氯甲烷，冰浴。依次加入2.28g二硫化碳(30.0mmol)、3.03g三乙胺(30.0mmol)和19.89g四溴化碳(60.0mmol)，室温下搅拌反应2h。反应结束后，用水洗涤3次，使用无水硫酸钠干燥过夜。旋蒸浓缩，然后以正己烷/乙酸乙酯作为洗脱剂，通过色谱柱层析进行纯化，得到黄色油状产物，命名为HDTC。
称取1.0g HDTC(4.4mmol)和0.89g三乙胺(8.8mmol)于单口烧瓶中，加入20.0mL无水二氯甲烷，冰浴。加入0.92g甲基丙烯酰氯(8.8mmol)，室温下搅拌反应12h。反应结束后，用饱和氯化钠溶液和去离子水洗涤3次，使用无水硫酸钠干燥过夜。旋蒸浓缩，然后以正己烷/乙酸乙酯作为洗脱剂，通过色谱柱层析进行纯化，得到淡黄色油状产物(DTCM)。
实施例4两亲性嵌段共聚物前药的合成
称取0.29g实施例2合成的DTCM(1.0mmol)、4.0mg 4,4-偶氮双(4-氰基戊酸)(0.01mmol)和40.3mg 4-氰基-4-[(十二烷基硫烷基硫羰基)硫烷基]戊酸(0.1mmol)于Schlenk管中，加入4.0mL N,N-二甲基甲酰胺。反应体系经过液氮冷冻-抽真空-解冻循环3次的除氧程序，最后真空密封。反应在65℃油浴条件下进行24h。反应后产物在冰乙醚中沉淀(溶解-沉淀，重复3次)，真空干燥过夜，得到黄色固体产物，命名为PDTCM。
称取0.2g PDTCM(0.1mmol)、4.0mg 4,4-偶氮双(4-氰基戊酸)(0.01mmol)和0.48gPEGA(1.0mmol)于Schlenk管中，加入4.0mL N,N-二甲基甲酰胺。反应体系经过液氮冷冻-抽真空-解冻循环3次的除氧程序，最后真空密封。反应在65℃油浴条件下进行24h。反应后产物在冰乙醚中沉淀(溶解-沉淀，重复3次)，真空干燥过夜，得到黄色固体产物(PPEGA-PDTCM)。
实施例5两亲性嵌段共聚物前药的合成
称取0.73g实施例2合成的DTCM(2.5mmol)、10.0mg 4,4-偶氮双(4-氰基戊酸)(0.025mmol)和40.3mg 4-氰基-4-[(十二烷基硫烷基硫羰基)硫烷基]戊酸(0.1mmol)于Schlenk管中，加入4.0mL N,N-二甲基甲酰胺。反应体系经过液氮冷冻-抽真空-解冻循环3次的除氧程序，最后真空密封。反应在65℃油浴条件下进行24h。反应后产物在冰乙醚中沉淀(溶解-沉淀，重复3次)，真空干燥过夜，得到黄色固体产物，命名为PDTCM。
称取0.3g PDTCM(0.1mmol)、4.0mg 4,4-偶氮双(4-氰基戊酸)(0.01mmol)和1.2gPEGA(2.5mmol)于Schlenk管中，加入4.0mL N,N-二甲基甲酰胺。反应体系经过液氮冷冻-抽真空-解冻循环3次的除氧程序，最后真空密封。反应在65℃油浴条件下进行24h。反应后产物在冰乙醚中沉淀(溶解-沉淀，重复3次)，真空干燥过夜，得到黄色固体产物(PPEGA-PDTCM)，1H NMR谱图如图2所示。
实施例6两亲性嵌段共聚物前药的合成
称取2.92g实施例2合成的DTCM(10.0mmol)、10.0mg 4,4-偶氮双(4-氰基戊酸)(0.025mmol)和40.3mg 4-氰基-4-[(十二烷基硫烷基硫羰基)硫烷基]戊酸(0.1mmol)于Schlenk管中，加入4.0mL N,N-二甲基甲酰胺。反应体系经过液氮冷冻-抽真空-解冻循环3次的除氧程序，最后真空密封。反应在65℃油浴条件下进行24h。反应后产物在冰乙醚中沉淀(溶解-沉淀，重复3次)，真空干燥过夜，得到黄色固体产物，命名为PDTCM。
称取0.5g PDTCM(0.1mmol)、4.0mg 4,4-偶氮双(4-氰基戊酸)(0.01mmol)和2.4gPEGA(5.0mmol)于Schlenk管中，加入4.0mL N,N-二甲基甲酰胺。反应体系经过液氮冷冻-抽真空-解冻循环3次的除氧程序，最后真空密封。反应在65℃油浴条件下进行24h。反应后产物在冰乙醚中沉淀(溶解-沉淀，重复3次)，真空干燥过夜，得到黄色固体产物(PPEGA-PDTCM)。
实施例7聚合物囊泡的制备
精密称取5.0mg实施例5中制得的两亲性嵌段共聚物前药，溶于200μL四氢呋喃。将800μL超纯水以1mL/h的速率注入上述溶液中，同时剧烈搅拌溶液，搅拌速率设置为800rpm。待超纯水注入完毕后，将溶液转移到截留分子量为1000Da的透析袋中，对超纯水透析24h，得到聚合物囊泡，所述聚合物囊泡的结构如图3所示，PPEGA形成膜的亲水外层和内层，PDTCM形成膜的疏水中间层，双硫仑单体通过二硫键与高分子链相连。透射电镜(TEM)观察其为中空球形形貌，动态光散射(DLS)测得其平均粒径约为180nm。
实验结果如图4所示，DLS测得聚合物囊泡的粒径及其分布与TEM结果吻合，且大部分分布在180nm左右，符合纳米药物载体具有肿瘤部位被动靶向所需的特质，即粒径范围在5–500nm的聚合物囊泡，能够通过被动靶向聚集在肿瘤组织。
实施例8聚合物囊泡的制备
精密称取5.0mg实施例5中制得的两亲性嵌段共聚物前药，溶于200μL四氢呋喃。将800μL超纯水以2mL/h的速率注入上述溶液中，同时剧烈搅拌溶液，搅拌速率设置为800rpm。待超纯水注入完毕后，将溶液转移到截留分子量为1000Da的透析袋中，对超纯水透析24h，得到聚合物囊泡。
实施例9聚合物囊泡的制备
精密称取10.0mg实施例5中制得的两亲性嵌段共聚物前药，溶于200μLN,N-二甲基甲酰胺。将1800μL超纯水以2mL/h的速率注入上述溶液中，同时剧烈搅拌溶液，搅拌速率设置为800rpm。待超纯水注入完毕后，将溶液转移到截留分子量为1000Da的透析袋中，对超纯水透析24h，得到聚合物囊泡。
实施例10聚合物囊泡负载疏水性阿霉素
精密称取2.0mg阿霉素、10.0mg实施例5中制得的两亲性嵌段共聚物前药，一起溶于500μL四氢呋喃。将1.5mL超纯水以2mL/h的速率注入上述溶液中，同时剧烈搅拌溶液，搅拌速率设置为800rpm。待超纯水注入完毕后，将溶液转移到截留分子量为3500Da的透析袋中，对超纯水透析24h，得到负载阿霉素的聚合物囊泡，TEM照片如图5所示。
实施例11聚合物囊泡负载亲水性盐酸阿霉素
精密称取2.0mg盐酸阿霉素、10.0mg实施例5中制得的两亲性嵌段共聚物前药，一起溶于500μL四氢呋喃。将1.5mL超纯水以2mL/h的速率注入上述溶液中，同时剧烈搅拌溶液，搅拌速率设置为800rpm。待超纯水注入完毕后，将溶液转移到截留分子量为3500Da的透析袋中，对超纯水透析24h，得到负载盐酸阿霉素的聚合物囊泡，TEM照片如图5所示。
实施例12载药聚合物囊泡的还原响应释药行为
利用1H NMR研究聚合物囊泡在还原性谷胱甘肽溶液中的双硫仑单体释药性能。取实施例7中制得的聚合物囊泡溶于含10mM谷胱甘肽的溶液中，然后通过1H NMR检测两亲性聚合物前药化学结构的变化。
实验结果如图6所示，两亲性聚合物前药与谷胱甘肽反应后，归属于双硫仑单体的甲基和亚甲基信号峰消失，证明了该两亲性聚合物前药能够在还原性环境下释放双硫仑单体。
利用荧光光谱法测定负载盐酸阿霉素的聚合物囊泡在不同谷胱甘肽浓度的pH7.4条件下磷酸缓冲液中的盐酸阿霉素释药性能。取实施例11中制得的载药聚合物囊泡，分别置于谷胱甘肽浓度为0，2和10mM的pH 7.4的磷酸缓冲液中透析48h(MWCO 1000)，使用荧光分光光度计分别测定透析后各组的盐酸阿霉素含量，与测得的盐酸阿霉素标准曲线对照，计算出各组释药量。
实验结果如图7所示，载药聚合物胶束的释药量与谷胱甘肽浓度呈现出一定的依赖关系，谷胱甘肽浓度为2mM时，24h内盐酸阿霉素的累积释药量约为40％；随着谷胱甘肽浓度提高到10mM，盐酸阿霉素在24h内的累积释药量高达80％；而在没有谷胱甘肽的情况下，盐酸阿霉素在48h内的累积释放量只有约20％。，该实验再次证明这种聚合物囊泡中的二硫键的还原敏感性能。考虑到肿瘤细胞内谷胱甘肽浓度相比正常细胞有提高，可以认为这种聚合物囊泡能够实现靶向肿瘤细胞的药物递送。
实施例13负载盐酸阿霉素的聚合物囊泡对肿瘤细胞生长的抑制效果研究
将小鼠乳腺癌细胞4T1细胞以1×104细胞/孔的密度接种在96孔培养板中。培养过夜后更换新的培养基，然后给予不同浓度的实施例7制备的聚合物囊泡(PS)、实施例11制备的负载盐酸阿霉素的聚合物囊泡(PS-DOX)、盐酸阿霉素(DOX)和双硫仑(DSF)，对应双硫仑浓度为0～12μg/mL、盐酸阿霉素浓度为0～1.6μg/mL，氯化铜浓度为0.25μg/mL。继续培养24h后，加入CCK-8试剂，孵育1h，然后使用酶标仪检测各孔的吸光度值，检测波长设置为450nm，根据下述公式计算细胞存活率：
细胞存活率(％)＝(加药组OD值-空白对照组OD值)/(阴性对照组OD值-空白对照组OD值)×100％
实验结果如图8所示，在没有添加氯化铜的情况下，PS-DOX表现出一定的细胞毒性。在添加氯化铜之后，PS-DOX的细胞毒性显著提高，其肿瘤抑制效果优于游离小分子药物。同时，PS-DOX的细胞毒性明显高于PS，表明双硫仑和盐酸阿霉素具有良好的联合抗肿瘤效果。该实验结果表明，本发明设计的载药聚合物囊泡体系能够实现还原响应释药，具有抑制肿瘤细胞生长的活性。
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