一种基于电致化学发光检测胶质芽孢杆菌的方法
阅读说明：本技术 一种基于电致化学发光检测胶质芽孢杆菌的方法 (Method for detecting bacillus mucilaginosus based on electrochemiluminescence ) 是由 杜立志 邱彦国 田相利 张艾青 于 2021-08-20 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种基于电致化学发光检测胶质芽孢杆菌的方法,该方法依次利用GR-PTCA与胶质芽孢杆菌表面的氨基结合,引入胶质芽孢杆菌,然后利用胶质芽孢杆菌胞外的荚膜上的酸性多糖,引入NH-(2)-GO/Au纳米复合材料,最后将修饰的电极放入检测液中,进行扫描检测。本发明基于AuNCs-H-(2)O-(2)系统,提出了一种简单、高效、灵敏的ECL实验策略用于检测胶质芽孢杆菌,利用H-(2)O-(2)对AuNCs猝灭作用,及NH-(2)-GO引起ECL信号扩增,增加检测的灵敏度。本发明可以同时应用于其他细菌的检测,该方法为国内首创；本发明利用H-(2)O-(2)能够破坏AuNCs的内部结构,引起ECL信号猝灭,进而引起信号降低,用于检测胶质芽孢杆菌,该方法低毒性、环境友好性、可调控性较高。(The invention discloses a method for detecting bacillus mucilaginosus based on electrochemiluminescence, which comprises the steps of sequentially utilizing GR-PTCA to be combined with amino on the surface of the bacillus mucilaginosus, introducing the bacillus mucilaginosus, and then utilizing acidic polysaccharide on extracellular capsule of the bacillus mucilaginosus to introduce NH 2 And finally, putting the modified electrode into detection liquid for scanning detection. The invention is based on AuNCs-H 2 O 2 The system provides a simple, efficient and sensitive ECL experimental strategy for detecting the bacillus mucilaginosus, and utilizes H 2 O 2 Quenching of AuNCs, and NH 2 GO causes ECL signal amplification, increasing the sensitivity of detection. The invention can be simultaneously applied to the detection of other bacteria, and the method is initiated at home; the invention utilizes H 2 O 2 Can destroy the internal structure of AuNCs, cause ECL signal quenching and further cause signal reductionThe method is used for detecting the bacillus mucilaginosus, and has low toxicity, environmental friendliness and high controllability.)
技术领域
本发明涉及微生物检测技术领域，特别涉及一种基于电致化学发光（ECL）检测胶质芽孢杆菌的方法。
背景技术
胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus) 是一类能分解土壤和硅酸盐矿物的化能异养型好氧菌，因其功能上的多样性在很多领域得到了广泛的应用。在农业上，该菌能将土壤中植物难以利用的钾、磷元素变为有效钾、磷以供植物利用，同时该菌还具有一定的固氮能力，并且能够分泌如赤霉素、生长激素和酶类等物质以促进植物的生长发育，是一种常用的微生物肥料添加菌种。在畜牧业上，该菌在生长过程中生成的蛋白质、有机酸等物质可用于饲料业中生产饲料补充物。
在工业上，胶质芽孢杆菌在胞外形成的肥大荚膜和产生的小分子有机酸能够分解硅酸盐矿物，使其释放出硅、铁等杂质，近年来常用于在生物浸矿和冶金等领域。由于该菌胞外的荚膜主要成分为酸性多糖，具有良好的絮凝活性，在污水处理方面也展示了良好的应用。
芽孢杆菌制剂在环保微生物菌剂的市场份额中占比较大，目前，中国的环保微生物菌剂进口量大，准确鉴定菌剂的含量是衡量菌剂质量安全的标准，传统的形态学观察、生理生化特征分析等技术精确度低，因此不能满足大量入境环保微生物菌剂的检测需要。
发明内容
本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种基于电致化学发光检测胶质芽孢杆菌的方法。
本发明是通过如下技术方案实现的：一种基于电致化学发光检测胶质芽孢杆菌的方法，包括以下步骤：
步骤一：用胶质芽孢杆菌筛选培养基将菌液进行稀释至105-106cfu ml -1，进行高通量筛选，然后经过复筛，获得胶质芽孢杆菌菌株，进行分装；
步骤二：制备GR-PTCA（石墨烯-苝-3,4,9,10-四羧酸纳米复合材料），取10 μL2mg•mL-1 GR-PTCA分散液滴加在GCE电极表面，在N2环境下自然干燥；
步骤三：取10 μL NHS/EDC活化液滴加到步骤二GR-PTCA修饰的电极表面，常温下培养1.5h，之后用洗涤液冲洗掉电极表面未吸附的NHS/EDC活化液，接着将取10μL步骤一筛选得到的胶质芽孢杆菌，滴加在NHS/EDC活化的电极表面，37℃，培养2h，之后用洗涤液冲洗掉电极表面未吸附的胶质芽孢杆菌；
步骤四：在该电极表面滴加10 μL乙醇胺，常温培养30 min，以封闭未反应的空白位点；
步骤五：取10μL 5mg•mL-1 NH2-GO/Au滴加到步骤四修饰的电极表面，37℃，培养1.5~2.5h，之后用洗涤液冲洗掉电极表面未吸附的NH2-GO/Au；
步骤六：将步骤五修饰的电极放入检测液中，进行扫描检测。
优选的，所述步骤四中，乙醇胺浓度为8~10mM。
优选的，所述步骤六中，扫描条件为：电压扫描范围为-2~0V，扫描速率：100 mV/s，光电倍增管：600 V。
优选的，所述步骤六中，检测液为0.1 M K2S2O8，0.1 M KCl，20 mM H2O2，20 mM对苯二酚。
优选的，所述NH2-GO/Au的制备方法包括以下步骤：剧烈搅拌条件下，在氨基化的氧化石墨烯与HAuCl4充分混合的分散液中，加入硼氢化钠，使HAuCl4还原，得到NH2-GO/Au复合材料。
与现有技术相比，本发明的有益之处为：
1、本发明基于AuNCs-H2O2系统，提出了一种简单、高效、灵敏的ECL实验策略用于检测胶质芽孢杆菌，利用H2O2对AuNCs猝灭作用，及胶质芽孢杆菌胞外的荚膜上的成分酸性多糖，将NH2-GO/Au纳米复合材料引入该系统，利用NH2-GO引起ECL信号扩增。本发明可以同时应用于其他细菌的检测，该方法为国内首创；
2、本发明利用H2O2能够破坏AuNCs的内部结构，引起ECL信号猝灭，进而引起信号降低，用于检测胶质芽孢杆菌，该方法低毒性、环境友好性、可调控性较高。
附图说明
下面结合附图对本发明作进一步的说明。
图1为本发明实施案例2中的ECL图谱；
图2为本发明实施案例3中的ECL图谱；
图3为本发明实施案例4中的ECL图谱；
图4为本发明实施案例5中的ECL图谱。
具体实施方式
具体实施方式仅为本发明部分实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化 或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
实施例1
石墨烯-苝-3,4,9,10-四羧酸(GR-PTCA)纳米复合材料的制备
首先称取0.005g氨基化的氧化石墨烯，该氨基化氧化石墨烯为购买所得，将其分散于5 mL二次蒸馏水中，超声后得到1 mg/mL均匀溶液。然后称取1 g苝-3,4,9,10-四羧酸二酐，将其溶于10 mL 2 %KOH溶液中，80℃水浴反应1 h。反应完成后，用盐酸调节pH使其维持在弱酸性。随后离心收集红色沉淀，真空干燥，得到PTCA。再将0.1 %壳聚糖溶液和1 mg/mL 石墨烯等体积混合，得到壳聚糖-石墨烯溶液。取10 mL壳聚糖-石墨烯的溶液，加入4975μL二次水超声分散，再加入25μL，20 mg/mL PTCA溶液，混合后进行超声，然后12000 r 离心10 min，即可制得GR-PTCA 纳米复合材料。
NH2-GO/Au纳米复合材料制备
称取2mg氨基化的氧化石墨烯（NH2-GO），溶解在2mL二次蒸馏水中，配置1mg/mL的GO溶液，然后称取2g HAuCl4，溶解在200mL容量瓶中，配置1％的HAuCl4溶液，在含有20mL蒸馏水的圆底烧瓶中，加入0.2mL 1mg/mL NH2-GO溶液，搅拌10分钟后，迅速加入0.1mL 1％的HAuCl4溶液，继续剧烈搅拌10分钟，加入0.035mg NaBH4。最后再搅拌30分钟即得到在GO上修饰纳米金的复合材料。
胶质芽孢杆菌筛选
用筛选培养基悬浮四组不同的菌液，分别调整菌体浓度至105-106cfu ml-1，充分摇匀后，分装于96孔培养板中，每孔200μl；32℃培养7天，进行复筛；复筛后获得胶质芽孢杆菌，实施案例中均采用耐盐性胶质芽孢杆菌。
实施案例2
取10 μL 2mg·mL-1 GR-PTCA分散液滴加在GCE电极表面，在N2环境下自然干燥；接着取10 μL NHS/EDC活化液滴加到步骤二GR-PTCA修饰的电极表面，常温下培养1.5h，对羧基进行活化，之后用洗涤液冲洗掉电极表面未吸附的NHS/EDC活化液，再将取10μL第一组菌液筛选得到的胶质芽孢杆菌，滴加在NHS/EDC活化的电极表面，37℃，培养2h，之后用洗涤液冲洗掉电极表面未吸附的胶质芽孢杆菌；接着在该电极表面滴加10 μL 8~10mM乙醇胺，常温培养30 min，以封闭未反应的空白位点；取10μL 5mg·mL-1 NH2-GO/Au滴加到上述修饰的电极表面，37℃，培养1.5-2.5h，由于胶质芽孢杆菌胞外的荚膜主要成分为酸性多糖，可以和NH2-GO/Au纳米复合材料表面的氨基进行结合，能够将NH2-GO/Au纳米复合材料负载到电极表面，之后用洗涤液冲洗掉电极表面未吸附的NH2-GO/Au；最后将上述修饰的电极放入检测液中，进行扫描检测，检测液为0.1 M K2S2O8，0.1 M KCl，20 mM H2O2，20 mM对苯二酚，扫描条件为：电压扫描范围为-2-0V，扫描速率：100 mV/s，光电倍增管：600 V。
第一组菌液检测的ECL图谱见图1
实施案例3
取10 μL 2mg·mL-1 GR-PTCA分散液滴加在GCE电极表面，在N2环境下自然干燥；接着取10 μL NHS/EDC活化液滴加到步骤二GR-PTCA修饰的电极表面，常温下培养1.5h，对羧基进行活化，之后用洗涤液冲洗掉电极表面未吸附的NHS/EDC活化液，再将取10μL第二组菌液筛选得到的胶质芽孢杆菌，滴加在NHS/EDC活化的电极表面，37℃，培养2h，之后用洗涤液冲洗掉电极表面未吸附的胶质芽孢杆菌；接着在该电极表面滴加10 μL 8mM乙醇胺，常温培养30 min，以封闭未反应的空白位点；取10μL 5mg·mL-1 NH2-GO/Au滴加到上述修饰的电极表面，37℃，培养1.5~2.5h，由于胶质芽孢杆菌胞外的荚膜主要成分为酸性多糖，可以和NH2-GO/Au纳米复合材料表面的氨基进行结合，能够将NH2-GO/Au纳米复合材料负载到电极表面，之后用洗涤液冲洗掉电极表面未吸附的NH2-GO/Au；最后将上述修饰的电极放入检测液中，进行扫描检测，检测液为0.1 M K2S2O8，0.1 M KCl，20 mM H2O2，20 mM对苯二酚，扫描条件为：电压扫描范围为-2-0V，扫描速率：100 mV/s，光电倍增管：600 V。
第二组菌液检测的ECL图谱见图2
实施案例4
取10 μL 2mg·mL-1 GR-PTCA分散液滴加在GCE电极表面，在N2环境下自然干燥；接着取10 μL NHS/EDC活化液滴加到步骤二GR-PTCA修饰的电极表面，常温下培养1.5h，对羧基进行活化，之后用洗涤液冲洗掉电极表面未吸附的NHS/EDC活化液，再将取10μL第三组菌液筛选得到的胶质芽孢杆菌，滴加在NHS/EDC活化的电极表面，37℃，培养2h，之后用洗涤液冲洗掉电极表面未吸附的胶质芽孢杆菌；接着在该电极表面滴加10 μL 10mM乙醇胺，常温培养30 min，以封闭未反应的空白位点；取10μL 5mg·mL-1 NH2-GO/Au滴加到上述修饰的电极表面，37℃，培养1.5~2.5h，由于胶质芽孢杆菌胞外的荚膜主要成分为酸性多糖，可以和NH2-GO/Au纳米复合材料表面的氨基进行结合，能够将NH2-GO/Au纳米复合材料负载到电极表面，之后用洗涤液冲洗掉电极表面未吸附的NH2-GO/Au；最后将上述修饰的电极放入检测液中，进行扫描检测，检测液为0.1 M K2S2O8，0.1 M KCl，20 mM H2O2，20 mM对苯二酚，扫描条件为：电压扫描范围为-2-0V，扫描速率：100 mV/s，光电倍增管：600 V。
第三组菌液检测的ECL图谱见图3
实施案例5
取10 μL 2mg·mL-1 GR-PTCA分散液滴加在GCE电极表面，在N2环境下自然干燥；接着取10 μL NHS/EDC活化液滴加到步骤二GR-PTCA修饰的电极表面，常温下培养1.5h，对羧基进行活化，之后用洗涤液冲洗掉电极表面未吸附的NHS/EDC活化液，再将取10μL第四组菌液筛选得到的胶质芽孢杆菌，滴加在NHS/EDC活化的电极表面，37℃，培养2h，之后用洗涤液冲洗掉电极表面未吸附的胶质芽孢杆菌；接着在该电极表面滴加10 μL 8mM乙醇胺，常温培养30 min，以封闭未反应的空白位点；取10μL 5mg·mL-1 NH2-GO/Au滴加到上述修饰的电极表面，37℃，培养1.5-2.5h，由于胶质芽孢杆菌胞外的荚膜主要成分为酸性多糖，可以和NH2-GO/Au纳米复合材料表面的氨基进行结合，能够将NH2-GO/Au纳米复合材料负载到电极表面，之后用洗涤液冲洗掉电极表面未吸附的NH2-GO/Au；最后将上述修饰的电极放入检测液中，进行扫描检测，检测液为0.1 M K2S2O8，0.1 M KCl，20 mM H2O2，20 mM对苯二酚，扫描条件为：电压扫描范围为-2-0V，扫描速率：100 mV/s，光电倍增管：600 V。
第四组菌液检测的ECL图谱见图4
实施案例6
首先配置不同浓度梯度的耐盐性胶质芽孢杆菌菌液标准液。
取10 μL 2mg·mL-1 GR-PTCA分散液滴加在GCE电极表面，在N2环境下自然干燥；接着取10 μL NHS/EDC活化液滴加到步骤二GR-PTCA修饰的电极表面，常温下培养1.5h，对羧基进行活化，之后用洗涤液冲洗掉电极表面未吸附的NHS/EDC活化液，再将取10μL不同浓度梯度的耐盐性胶质芽孢杆菌菌液标准液，分别滴加在NHS/EDC活化的电极表面，37℃，培养2h，之后用洗涤液冲洗掉电极表面未吸附的胶质芽孢杆菌；接着在该电极表面滴加10 μL8mM乙醇胺，常温培养30 min，以封闭未反应的空白位点；取10μL 5mg·mL-1 NH2-GO/Au滴加到上述修饰的电极表面，37℃，培养1.5~2.5h，由于胶质芽孢杆菌胞外的荚膜主要成分为酸性多糖，可以和NH2-GO/Au纳米复合材料表面的氨基进行结合，能够将NH2-GO/Au纳米复合材料负载到电极表面，之后用洗涤液冲洗掉电极表面未吸附的NH2-GO/Au；最后将上述修饰的电极放入检测液中，进行扫描检测，检测液为0.1 M K2S2O8，0.1 M KCl，20 mM H2O2，20 mM对苯二酚，扫描条件为：电压扫描范围为-2~0V，扫描速率：100 mV/s，光电倍增管：600 V。
根据上述测得的不同浓度梯度的耐盐性胶质芽孢杆菌菌液的ECL光强值，构建标准曲线，然后将实施例2-5中测得的ECL光强值代入标准曲线，计算耐盐性胶质芽孢杆菌菌液的浓度。
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