一种提升苹果组培苗生根速率和根系生长效果的方法
阅读说明：本技术 一种提升苹果组培苗生根速率和根系生长效果的方法 (Method for improving rooting rate and root growth effect of tissue culture seedlings of apples ) 是由 黄文静 杨光柱 马钧 丁仁展 郑丽萍 于 2021-09-17 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种提升苹果组培苗生根速率和生长效果的方法,包括如下步骤：1)腋芽的诱导：采用春季发出的腋芽接种于腋芽诱导培养基进行培养,温度24±1℃,12h/d光照,培养40-45天；2)幼苗的分化增殖培养：将诱导出的腋芽转接到增殖培养基上,12h/d光照,每隔35-40天,切下生长高度超过1cm的幼苗进行扩繁,扩繁次数不超过8代；3)幼苗的生根培养：将生长高度超过2cm的组培苗切下接种于生根培养基质上,放置于24±1℃,12h/d光照；与常规培养基培养比较,缩短了根系萌发时间13天左右、培养时间20天左右。(The invention discloses a method for improving rooting rate and growth effect of tissue culture seedlings of apples, which comprises the following steps: 1) and (3) inducing axillary buds: inoculating axillary buds emitted in spring to an axillary bud induction culture medium for culture at 24 +/-1 ℃ for 12h/d for 40-45 days; 2) and (3) differentiation and proliferation culture of seedlings: transferring the induced axillary buds to a proliferation culture medium, irradiating for 12h/d, cutting off seedlings with the growth height of more than 1cm every 35-40 days for propagation, wherein the propagation times are not more than 8 generations; 3) rooting culture of seedlings: cutting off the tissue culture seedling with the growth height of more than 2cm, inoculating the cut tissue culture seedling on a rooting culture medium, and placing the cut tissue culture seedling at 24 +/-1 ℃ for 12h/d for illumination; compared with the conventional culture medium, the method shortens the root germination time by about 13 days and the culture time by about 20 days.)
技术领域
本发明涉及组织培养技术领域，尤其涉及一种提升苹果组培苗生根速率和根系生长效果的方法。
背景技术
苹果是落叶乔木，作为异花授粉植物，大部分品种自花不能结实，繁殖方法一般采用扦插、嫁接、组织培养方式。植物组织培养是近几十年来发展起来的一项无性繁殖技术，利用植物体离体器官、组织或细胞以及原生质体，在无菌和适宜的人工培养基、温度、光照灯条件下，诱导出不定芽、不定根、愈伤组织，经过扩繁增殖、生根，最后形成完整植株的技术，可在一定时间内使植物达到倍数扩增，节省大量的研究时间和繁殖珍贵植物。
草本植物的组织培养全过程相对容易，木本植物的组织培养全过程花费时间较长，诱导、增殖阶段较稳定，生根阶段培养是关键，对木本植物来说较为困难。目前有研究对试管内生根和试管外生根，采用基质培养、水培养、气雾培养和滤纸侨法等试管外生根技术被广泛应用于花卉、珍贵苗木的组织培养。
苹果常规组织培养全过程一般都在培养基内，春季腋芽处理后接种于诱导培养基，所有培养基pH 5.8，蔗糖30g/L，琼脂5.5g/L，121℃灭菌20min，诱导培养基为MS+BA1.0mg/ml+IAA0.2mg/ml，24±1℃，12h/d光照，培养40天左右。将诱导出的腋芽转接到增殖培养基上，增值培养基为MS+6-BA2.5mg/L+NAA0.1mg/L，24±1℃，12h/d光照，每隔35-40天，切下生长高度超过1cm的幼苗进行扩繁，扩繁次数不超过8代。将生长超过2cm的幼苗切下接种于生根培养基上，1/2MS+NAA0.5mg/L+IAA1.0mg/L，放置于24±1℃，12h/d光照，培养第20天左右开始出现愈伤组织，第25-30天愈伤组织上开始出现根芽生长，培养50-55天，生根率65-75％左右，培养65天后可进行炼苗移栽。总时长370天左右可批量诱导培养出苹果组培苗。
然而，木本植物组织培养生根培养阶段，在培养基内，80％的组培苗根系着生于幼苗底部生长出的愈伤组织上，在炼苗清洗时极易脱落，造成无根苗，移栽无法健康生长，降低了组培苗移栽成活率，且生根培养、炼苗移栽阶段耗时65天左右时间较长，使木本组织培养投入成本居高不下。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种苹果组培苗生根过程中，使用不同的灭菌培养基质，以提升苹果组培苗生根速率、缩短培养时间，对幼苗根系生长效果较好的方法，以解决现有技术中导致的上述多项缺陷。
为实现上述目的，本发明提供以下的技术方案：一种提升苹果组培苗生根速率和生长效果的方法，包括如下步骤：
1)腋芽的诱导：采用春季发出的腋芽接种于腋芽诱导培养基进行培养，温度24±1℃，12h/d光照，培养40-45天；
2)幼苗的分化增殖培养：将诱导出的腋芽转接到增殖培养基上，12h/d光照，每隔35-40天，切下生长高度超过1cm的幼苗进行扩繁，扩繁次数不超过8代；
3)幼苗的生根培养：将生长高度超过2cm的组培苗切下接种于生根培养基质上，放置于24±1℃，12h/d光照。
优选的，腋芽诱导培养基：MS+BA1.0-1.5mg/ml+IAA0.2-0.5mg/ml，pH 5.8，蔗糖30g/L，琼脂5.5g/L，121℃灭菌20min。
优选的，增殖培养基：MS+6-BA2.5-3.0mg/L+NAA0.1-0.3mg/L，pH 5.8，蔗糖30g/L，琼脂5.5g/L，121℃灭菌20min。
优选的，生根培养基质：
1)20g椰糠+20ml生根培养液；
2)8g椰糠+2g珍珠岩+20ml生根培养液；
3)培养基1/2MS+NAA0.5-1.0mg/L+IAA1.0-1.5mg/L，pH 5.7-5.8，蔗糖30g/L，琼脂5.5g/L，作为对照。
优选的，所有基质、培养基均121℃灭菌20min。
优选的，生根培养液：1/2MS+NAA0.5-1.0mg/L+IAA1.0-1.5mg/L，蔗糖30g/L。
采用以上技术方案的有益效果是：本发明提供的方法，可提升苹果组培苗生根速率，生根阶段培养第7天幼苗底部开始根系萌动，第14天60％幼苗底部根系生长，培养第30天生根率达95％，且根系长势良好，数量6根以上，幼苗高度4cm以上，可进行炼苗移栽。与常规培养基培养比较，缩短了根系萌发时间13天左右、培养时间20天左右。
附图说明
图1 20g椰糠+20ml培养液培养30天；
图2 8g椰糠+2g珍珠岩+20ml培养液培养30天；
图3 培养基培养30天。
具体实施方式
下面详细说明本发明的优选实施方式。
本发明提供的方法是在苹果组培苗生根阶段，采用20g椰糠+20ml培养液、8g椰糠+2g珍珠岩+20ml培养液、培养基(对照)，作为培养基质，快速培养苹果组培苗根系萌发和生长的方法，以苹果砧木丽江山荆子组织培养为例，具体过程如下：
腋芽的诱导：采用春季发出的腋芽，清洗干净后，于超净工作台中，酒精清洗30秒，灭菌水清洗2次，0.1％升汞摇动灭菌10-12分钟，无菌水清洗3-4次，切成带1-2个腋芽的茎段，每瓶中接种3-4个，接种于腋芽诱导培养基MS+BA1.0-1.5mg/ml+IAA0.2-0.5mg/ml，pH5.8，琼脂5.5g/L，蔗糖30g/L，121℃灭菌20min，放置于组培架进行培养，温度24±1℃，12h/d光照，培养40-45天，可见腋芽萌发生长，腋芽长度超过1cm即可切下接种于分化增殖培养基中继续培养；
幼苗的分化增殖培养：将诱导出的腋芽接种到增殖培养基中继续培养，MS+6-BA2.5-3.0mg/L+NAA0.1-0.3mg/L，pH 5.8，琼脂5.5g/L，蔗糖30g/L，121℃灭菌20min。放置于组培架继续培养，温度24±1℃，12h/d光照，每隔35-40天，切下生长高度超过1cm的幼苗进行扩繁，扩繁次数不超过8代。
幼苗的生根培养：将生长超过2cm的组培苗切下接种于生根培养基质①、②、③对照上，放置于24±1℃，12h/d光照。①20g椰糠+20ml生根培养液；②8g椰糠+2g珍珠岩+20ml生根培养液；(生根培养液1/2MS+NAA0.5-1.0mg/L+IAA1.0-1.5mg/L，pH 5.7-5.8，蔗糖30g/L)③培养基1/2MS+NAA0.5-1.0mg/L+IAA1.0-1.5mg/L，pH 5.8，蔗糖30g/L，琼脂5.5g/L，作为对照。所有基质、培养基均121℃灭菌20min。以生根培养基诱导苹果丽江山荆子根系生长为对照，每组处理100个2cm左右的幼苗，观察从第7天开始、第14天、第30天、第45天、第55天生根情况，记录各处理组幼苗根系生长情况。从表1可知第7天开始，①处理组组培苗底部出现根系萌动；②处理组组培苗底部出现根系萌动；③对照处理组无变化。第14天，①处理组60％幼苗根系生长；②处理组58％幼苗根系生长；③对照处理组幼苗底部出现愈伤组织。第30天，①处理组95％幼苗根系生长，苗木高度4cm以上，根系生长良好；②处理组95％幼苗根系生长，苗木高度4cm以上，根系生长良好，且须根较多；③对照处理组30％幼苗底部愈伤组织上发出根系。第45天，①处理组根系95％幼苗可进行炼苗；②处理组95％幼苗可进行炼苗；③对照处理组60％幼苗底部愈伤组织上发出根系。第55天，①处理组移栽成活率达100％；②处理组移栽成活率达100％；③对照处理组70％幼苗底部愈伤组织上发出根系，65天后可进行炼苗移栽，炼苗时间7天，移栽时由于根系会跟随愈伤组织脱落，造成无根苗，移栽损耗20％-35％左右，栽后成活率65％。
表1生根基质与培养基培养山荆子组培生根阶段登记表
图1为20g椰糠+20ml培养液培养30天；图28g椰糠+2g珍珠岩+20ml培养液培养30天图3培养基培养30天，通过图1、图2、图3可以看出，采用本发明提供的方法可以缩短组培苗根系的诱导和生长时间。
综上，本发明采用灭菌培养基质①20g椰糠+20ml培养液、②8g椰糠+2g珍珠岩+20ml培养液作为苹果苗木组培生根阶段的培养基质，可培养出大量健壮、不易脱落、根系长势良好的组培苗。常规苹果组织培养总培养时间为370天左右，生根阶段培养时间为50-55天。不同灭菌基质的采用缩短了诱导生根时间10-14天左右、生根培养及炼苗移栽时间30-35天左右。
以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
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