具体实施方式

本发明提供了五羟色胺受体抑制剂和顺铂在制备治疗肝癌的药物中的应用。

本发明提供了五羟色胺受体抑制剂在制备减弱肝癌对顺铂的耐药性的药物的应用。

本发明提供了五羟色胺受体抑制剂在制备降低顺铂治疗肝癌的毒副作用的药物中的应用。

本发明提供了五羟色胺受体抑制剂和顺铂在制备抑制肝癌细胞增殖的药物中的应用。

在本发明中，所述五羟色胺受体抑制剂优选的包括美赛西平(Methiothepinmaleate)、N-[3-(2-二甲氨基)乙氧基-4-甲氧基苯基]-2'-甲基-4'-(5-甲基-1,2,4-恶二唑-3-基)-(1,1'-联苯)-4-甲酰胺(SB 216641 hydrochloride)、5-((4-(6-氯噻吩[2,3-d]嘧啶-4-基氨基)哌啶-1-基)甲基)-2-氟苯甲腈单富马酸酯(PRX-08066Maleic acid)和阿立哌唑(Aripiprazole)中的一种或几种。在本发明中，所述Methiothepin maleate、SB216641 hydrochloride、PRX-08066Maleic acid和Aripiprazole来源于常规市售。

在本发明中，所述肝癌优选的包括RECQL4高表达肝癌。

在本发明中，所述药物的剂型优选的包括注射剂；所述注射剂优选为腹腔注射剂或静脉注射剂。

在本发明中，所述药物中五羟色胺受体抑制剂和顺铂的质量比优选为(1.5～2.5)∶5。在本发明中，所述药物中五羟色胺受体抑制剂的浓度优选为1.5～2.5mg/ml；所述药物中顺铂的浓度优选为4.5～5.5mg/ml。在本发明中，所述药物采用的溶剂优选为无菌生理盐水或无菌PBS。

本发明还提供了一种治疗肝癌的药物，包括五羟色胺受体抑制剂和顺铂。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明的实施例中材料的来源如下所示：

LO2(人正常肝细胞)：购于南京凯基生物科技发展有限公司。SNU398(人肝癌细胞)：购于广州赛库生物技术有限公司。SB 216641 hydrochloride(Selective h5-HT1Bantagonist,简称SB)、Methiothepin maleate(5-HT Receptors,Non-selective,简称MET)购买于TOCRTS公司；PRX-08066 Maleic acid(5-HT2B receptors 1antagonist,简称PRX)、Aripiprazole(a high-affinity 5-HT receptor partial agonist,简称APZ)购于购买于Selleck公司。Cisplatin(简称Cis)购买于Solarbio公司。

实施例1 Cis与PRX单独用药及联合用药对细胞的抑制作用

1、细胞种板

选用对数生长期的LO2细胞、SNU398细胞，0.25％的胰蛋白酶消化、离心、收集细胞，细胞计数，稀释细胞至5×10³个/ml，每组设置3个平行孔，按每孔100μl将细胞悬液均匀的种在96孔板中，置37℃，5％CO₂温箱中培养24h后，显微镜下观察细胞的贴壁情况。

2、联合用药

实验分组：

(1)Blank组：不加细胞，只加培养基；

(2)DMSO阴性组：不加药物；

(3)单独用药组：设置10个浓度水平(见表1)，相邻浓度间为2倍关系。

(4)联合用药组：根据Chou-Talalay联合指数法实验设计一般原则，药物设10个浓度水平，PRX与Cis进行不同浓度下的联合使用，即水平1：PRX的浓度1+Cis的浓度1；水平2：PRX的浓度2+Cis的浓度2；依次到水平10：PRX的浓度10+Cis的浓度10。(见表1)。

表1 Cis与PRX单独及联合用药对细胞增殖的影响

显微镜下观察96孔板中细胞贴壁良好、形态饱满，准备进行加药。超净台紫外照射30min，循环通风15min，从冰箱中取出配置好的药物母液，喷洒75％酒精，放置于超净工作台中。根据所设置的药物浓度，进行药物计算和配置。首先配置单独药物组(PRX、Cis)，各配制10个浓度，Cis和PRX进行联合用药。从培养箱中取出96孔板，使用注射器吸出孔内原培养基，在单独用药孔中将每种药物的不同浓度分别加入到96孔板中，每孔100μl。Cis与PRX联合用药时，两药合用体积比例为1:1方案，每孔加药总量仍是100μl，即单药浓度扩大一倍各加50μl，倍比稀释后为表1中所述相应的浓度。

从细胞培养箱中取出96孔板，使用注射器吸出每孔原培养基，加入新鲜的含药培养基，每孔100μl，将96孔板放置于细胞培养箱中继续培养。加药过程中注意无菌操作，防止细胞污染。药物干预24h和48h后分别观察细胞形态，并拍照保存。药物干预48h后，弃去含药培养基，配制一定量10％的CCK-8工作液，每孔加入100μl，在细胞培养箱孵育2～4h后，利用多功能酶标仪测定在450nm波长下每孔的OD值，保存数据，进行数据处理。将数据带入以下公式：

细胞存活率％(Cell Viability)＝(OD_用药组-OD_空白组)/(OD_阴性组-OD_空白组)×100％；

OD_用药组是加入待测化合物共培养后所测得的细胞孔的最终溶液吸光值；

OD_阴性组是加入完全培养基共培养后所测得的细胞孔的最终溶液吸光值；

OD_空白组是不含细胞没有待测化合物的培养基空白孔的最终溶液吸光值；

以药物浓度为横坐标，细胞的存活率为纵坐标，使用GraphPad Prism 6.0进行数据处理，求取每株细胞对应每种药物的IC₅₀值，即一定浓度的化合物诱导肿瘤细胞死亡50％，该浓度被称为半数抑制浓度，用来衡量药物对肿瘤细胞增殖的干预能力，IC₅₀值越低，药物干预能力越强，说明细胞对药物越敏感。

3、Chou-Talalay方程及联合药效的判定

根据Chou-Talalay方程，fa/fu＝[D/Dm]m，(D为药物浓度；Dm为中效浓度,即fa＝0.5时的药物浓度)，取线性方程两边的对数：Y＝mX+a(其中Y＝log[fa/fu],X＝logD,m是方程的斜率,a是方程截距)。分别计算两种药物单独使用或组合使用时相应的Dm(logDm＝-a/m)，然后根据联合指数法中的量效公式＝D1/Dx1+D2/Dx2+αD1D2/Dx1Dx2，计算两种药物联用时的效应关系。(D1和D2是达到药效X时两种药物的浓度，单独使用两种药物时分别使用Dx1和Dx2。两种药物的相互作用：CI<1为两药合用时的协同效应，CI＝1为两药合用时的加和效应，CI>1为两药合用时的拮抗效应。)

以LO2细胞为对照，设置PRX组、Cis组、PRX+Cis组对SNU398进行了药物干预，结果参见图1和图2。图1结果显示：Cis组、PRX组、PRX+Cis组对SNU398细胞的增殖都具有抑制作用，细胞增殖抑制率随着用药浓度的升高而升高，具有剂量-效应关系；与Cis组相比，PRX+Cis组对SNU-398细胞的抑制率明显升高，有显著统计学差异(P<0.01)；Cis组、PRX+Cis组达到相同的抑制率时，PRX+Cis组降低了Cis的用量并且增强了SNU398对Cis的敏感性。图2结果显示，PRX+Cis组联合用药时，CI值<1，在不同浓度下均呈现了协同作用，随着联合用药浓度的升高，PRX+Cis组联合用药的协同作用增强。

实施例2 Cis与APZ单独用药及联合用药对细胞的抑制作用

药物分组情况参见表2，其余流程参见实施例1。

表2 Cis与APZ单独及联合用药对细胞增殖的影响

以LO2细胞为对照，设置APZ组、Cis组、APZ+Cis组对SNU398进行了药物干预。见图3所示，Cis组、APZ组、APZ+Cis组对SNU398细胞的增殖都具有抑制作用，细胞增殖抑制率随着用药浓度的升高而升高，具有剂量-效应关系；在中低浓度时，与Cis组相比，APZ+Cis组对SNU-398细胞的抑制率高于Cis组，有统计学差异(P<0.05)，说明对APZ+Cis联合用药提高了SNU398对Cis的敏感性；随着用药浓度的升高，Cis组、APZ+Cis组对SNU398的抑制率无明显差别；见图4，APZ+Cis组在低浓度联合用药时，CI值<1，呈现了协同作用；随着APZ+Cis组联合用药浓度的升高，CI值>1呈现了拮抗作用。

实施例3 Cis与MET单独用药及联合用药对细胞的抑制作用

药物分组情况参见表3，其余流程参见实施例1。

表3 Cis与MET单独及联合用药对细胞增殖的影响

以LO2细胞为对照，设置MET组、Cis组、MET+Cis组对SNU398、进行了药物干预。见图5所示，Cis组、MET组、MET+Cis组对SNU398细胞的增殖都具有抑制作用，细胞增殖抑制率随着用药浓度的升高而升高，具有剂量-效应关系；在一定浓度范围内，MET+Cis组对SNU398的抑制率明显高于Cis组的抑制率，有显著统计学差异(P<0.01)；见图6所示，MET+Cis组低浓度联合用药时，CI值>1呈现拮抗作用，MET+Cis组高浓度联合用药时，CI值<1，呈现了协同作用。

实施例4 Cis与SB单独用药及联合用药对细胞的抑制作用

药物分组情况参见表4，其余流程参见实施例1。

表4 Cis与SB单独及联合用药对细胞增殖的影响

以LO2细胞为对照，设置SB组、Cis组、SB+Cis组对SNU398进行了药物干预。见图7所示，Cis组、SB组、SB+Cis组对SNU398细胞的增殖都具有抑制作用，细胞增殖抑制率随着用药浓度的升高而升高，具有剂量-效应关系；在一定浓度范围内，与Cis组相比，SB+Cis组对SNU398的抑制率明显升高，有显著统计学差异(P<0.01)；见图8所示，SB+Cis组中低浓度联合用药时，CI值>1呈现拮抗作用，SB+Cis组高浓度联合用药时，CI值<1，呈现了协同作用。

实施例5 APZ与Cis联合用药对裸鼠异体移植瘤模型的药效学检测

(1)操作步骤：

将BALB/C-Nu裸鼠在SPF环境中培养1周之后，将40只裸鼠逐一称量体重并做好标记。在冰上将无菌PBS和Matrigel按照体积比1:1配制，混合均匀，将SNU398细胞定容成细胞悬液，注射到裸鼠的右前肢腋窝皮下，对Blank组裸鼠注射200μl混合液(PBS:Matrigel＝1:1，体积比)，实验组裸鼠均注射7×10⁶/200μl肝癌细胞SNU398。裸鼠皮下注射SNU398细胞后，每日观察肿瘤的生长情况，待裸鼠长出的肿瘤体积约为100～150mm³时，根据肿瘤的大小、裸鼠的体重，剔除肿瘤过大或过小的裸鼠，随机分组进行腹腔注射给药。实验分组共分为5组：(1)Cis用药组：用药量为25mg/kg，每五天给药一次；(2)APZ用药组：用药量为10mg/kg，每两天给药一次；(3)Cis和APZ联合用药组：按照Cis(25mg/kg)+APZ(10mg/kg)的剂量，每五天给药一次；(4)DMSO对照组：注射DMSO溶剂，每两天一次；(5)Blank组。

药物的辅料：用无菌PBS(pH7.2)配制药物；Cisplatin的配置：50mg的Cis加入50μlDMSO，补充9950μl的PBS，制备成50mg/10ml的溶液，分装到10只1.5ml的EP管中，-20℃冻存，备用。每只荷瘤小鼠的用量为：100μl/20g。APZ的配置：20mg的APZ配制10ml溶液，其他操作同Cis。每只荷瘤小鼠的用量为：100μl/20g。

注射药物后观察小鼠精神状态是否正常，以给药天数为单位记录死亡时间并绘制生存周期曲线、评估生存周期；隔一天观察测量裸鼠体重、利用游标卡尺测量肿瘤长径、短径，记录并分析。实验结束后脱颈椎处死动物并进行解剖，剥出肿瘤，称量裸鼠体重及瘤重，并对心、肝、脾、肺、肾进行取材后称量，分别计算各组的脏器系数，并将结果进行统计学处理。分析数据均用平均值±标准差用(Mean±S.E.M)来表示，多组之间的数据比较分析采用单因素方差分析(One Way ANOVA)，两组间的比较采用student-t检验，统计分析以及绘图均采用GraphPad Prism 6.0统计软件进行。

(2)结果：联合用药对肿瘤的抑制作用

实验结束后脱颈椎处死裸鼠，解剖裸鼠剥离出肿瘤，对肿瘤称取重量。肿瘤的抑制率由以下公式计算所得：抑制率(％)＝(对照组的肿瘤重量-实验组的肿瘤重量)/对照组的肿瘤质量×100％。见图9、表5所示，与DMSO对照组相比，APZ组、Cis组、APZ+Cis组对小鼠体内肿瘤的生长具有抑制作用，其中APZ+Cis组对肿瘤的抑制率最高。APZ组、Cis组、APZ+Cis组对肿瘤的抑制率分别为25.02％、82.33％、91.23％。

表5 APZ、Cis、APZ与Cis对肿瘤生长的抑制

与DMSO对照组相比，*：P<0.05；**：P<0.01。

(3)结果：裸鼠的生存曲线分析

对不同用药组的裸鼠生存周期进行了评估并且绘制了生存周期曲线，见图10所示，可以看出，与DMSO对照组的裸鼠相比，Cis组、APZ组、APZ+Cis组的裸鼠均延长了生存周期，其中APZ+Cis组裸鼠的生存周期最长。

(4)结果：裸鼠脏器系数的分析

在上述实验中处理肿瘤模型小鼠时，取出心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏。然后将每个脏器进行称重记录重量。根据公式计算脏器系数：脏器系数＝脏器重量/体重量×100％。

各组BALB/N-Cu裸鼠进行解剖取脏器称重后，又进行了主要脏器系数的统计与分析，结果见表6，与DMSO对照组的BALB/N-Cu裸鼠相比较，Cis组、APZ+Cis组肺脏的脏器系数分别出现不同程度的升高，有显著统计学差异(P<0.01)；Cis组肾的脏器系数升高，有显著的统计学差异(P<0.01)；Cis组心的脏器系数升高，有显著的统计学差异(P<0.01)；与Cis组BALB/N-Cu鼠相比较，APZ组、APZ+Cis组肺的脏器系数高于Cis组，有显著的统计学差异(P<0.01)；APZ组脾的脏器系数高于Cis组，有统计学差异(P<0.01)；APZ组、APZ+Cis组心的脏器系数低于Cis组，有显著的统计学差异(P<0.05)；Cis组、APZ组、APZ+Cis组、与DMSO对照组的肝脏、脾脏的脏器系数比较，无统计学差异。

表6 BALB/C-Nu小鼠脏器系数分析

各组与DMSO对照组相比，*：P<0.05；**：P<0.01。

通过脏器系数分析，Cis组的肾脏、心脏、肺脏的脏器系数均高于DMSO组裸鼠，可以看到Cis组的毒副作用较大并且能够引起并发症。APZ+Cis联合用药组对肿瘤的抑制率最高，通过脏器系数分析，与Cis组相比，我们发现APZ+Cis组的肾脏、心脏、肺脏的脏器系数均小于Cis组，说明APZ在一定程度上能够减弱Cis的毒副作用并且增强肿瘤对Cis的敏感性。

Cisplatin的副作用表现为食欲不振、恶心、呕吐、腹泻等。通常在注射后1～2小时出现，持续4～6h或更长时间，2～3天后消失。这种反应与剂量有关。顺铂突出的肾脏毒性，主要表现为肾脏一过性损伤，包括对肾小管上皮细胞的损害。其特点是血尿和肾功能损害，血清肌酐升高，清除率降低。

由上述实施例可以看出，5-HT受体抑制剂能够增强Cisplatin的抗肝癌效果及降低Cisplatin的毒副作用，为临床上治疗肝癌提供了新的治疗思路和理论实验依据。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。