一种靶向egfr的spect显像剂及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种靶向egfr的spect显像剂及其制备方法和应用 (EGFR-targeting SPECT imaging agent and preparation method and application thereof ) 是由 程登峰 石岱 刘国兵 谭辉 石洪成 于 2021-09-01 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种靶向EGFR的SPECT显像剂及其制备方法和应用。本发明对cetuximab的结构进行改造,保留功能区F(ab’)-(2),并通过放射性核素～(99m)Tc标记后得到靶向EGFR的SPECT显像剂,探针分子量由150kDa减少到100kDa,加速了探针在体内的代谢速度,有利于临床转化,16h显像效果最好,而完整单抗约为48h；本发明通过Western blots和IF筛选出高表达EGFR细胞系MGC803。通过生物分布和SPECT/CT成像,结果表明～(99m)Tc-MAG-(3)-Cet-F(ab')-(2)可以清楚地显示EGFR阳性肿瘤,并且代谢率得到明显提高。(The invention discloses a SPECT imaging agent targeting EGFR and a preparation method and application thereof. The invention modifies the structure of cetuximab and reserves a functional region F (ab') 2 And by means of radionuclides 99m The molecular weight of the probe is reduced from 150kDa to 100kDa after Tc labeling, the metabolic rate of the probe in vivo is accelerated, the clinical transformation is facilitated, the imaging effect is the best in 16h, and the complete monoclonal antibody is about 48 h; the invention screens out the high-expression EGFR cell line MGC803 by Western blots and IF. The results show that through biodistribution and SPECT/CT imaging 99m Tc‑MAG 3 ‑Cet‑F(ab') 2 Can clearly show EGFR positive tumor and metabolizeThe rate is obviously improved.)
技术领域
本发明涉及一种靶向EGFR的SPECT显像剂及其制备方法和应用，属于放射性药物化学技术领域。
背景技术
消化系统常见肿瘤主要包括胃癌和结肠癌。在所有恶性肿瘤中，胃癌和结肠癌的发病率分别位列第五和第三。胃癌和结肠癌均排在肿瘤相关死亡的前五名。大多数患者在确诊时已处于中晚期，通常不适合进行根治性手术。以EGFR(表皮生长因子受体)为靶点的单克隆抗体(mAbs)在临床上具有较高的治疗效果。
EGFR的表达不仅是评价治疗效果的生物标志物之一，还是指导临床单抗用药的依据。尽管病理结果是金标准，但是对于不适合手术的病人，病理并不适用。ImmunoSPECT是一种非侵入性分子成像方法，它利用放射性标记的抗体来可视化特定的标记物。西妥昔单抗(Cetuximab)是FDA批准的单克隆抗体，广泛用于EGFR过表达的消化道肿瘤。而如何无创性地评估肿瘤的EGFR表达成为了亟待解决的问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：如何利用西妥昔单抗(Cetuximab)设计出一种能够无创性地评估肿瘤的EGFR表达的分子探针。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种靶向EGFR的SPECT显像剂的前体化合物，该前体化合物为MAG3-Cet-F(ab')2，所述的MAG3-Cet-F(ab')2的化学结构式如式I所示：
其中，Cet-F(ab')2为西妥昔单抗的功能片段F(ab')2。
本发明还提供了一种靶向EGFR的SPECT显像剂，该SPECT显像剂为99mTc-MAG3-Cet-F(ab')2，所述的99mTc-MAG3-Cet-F(ab')2的化学结构式如式II所示：
其中，Cet-F(ab')2为西妥昔单抗的功能片段F(ab')2。
本发明还提供了上述的靶向EGFR的SPECT显像剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：将西妥昔单抗与双功能螯合剂NHS-MAG3进行修饰反应，纯化后得到MAG3-Cet；
步骤2：将MAG3-Cet经酶切后去除西妥昔单抗的Fc片段，得到MAG3-Cet-F(ab')2，其保留了西妥昔单抗的功能片段F(ab')2；
步骤3：MAG3-Cet-F(ab')2与99mTcO4 -进行放射性核素标记反应，纯化后得到99mTc-MAG3-Cet-F(ab')2。
优选地，所述步骤1中的修饰反应具体为：将摩尔比为1:5的西妥昔单抗与NHS-MAG3在碳酸氢盐缓冲液中常温反应2小时，所述碳酸氢盐缓冲液的浓度为0.1mol/L，pH值为9.0。
优选地，所述步骤2中的酶切采用的是IdeS蛋白酶，所述IdeS蛋白酶的使用量为：每1mg西妥昔单抗加入50U IdeS酶。
优选地，所述步骤3中的放射性核素标记反应具体为：每100μgMAG3-Cet-F(ab')2中，加入45μL 0.25M的醋酸铵和15μL酒石酸盐标准缓冲液的组合溶液中，然后加入不超过5mCi的99mTcO4 -，混匀后立即加入3μL新鲜制备的1mg/mL SnCl2·2H2O溶液，混匀后在室温下涡旋温育1小时。
本发明还提供了上述的靶向EGFR的SPECT显像剂的应用，包括在制备评估肿瘤的EGFR表达水平的试剂和/或试剂盒中的应用。
本发明的SPECT显像剂的设计原理：
西妥昔单抗(Cetuximab)完整抗体的分子量约为150kDa，这使得抗体在血液中的代谢速度很慢，体内半衰期甚至达到7天以上，一般必须使用长半衰期正电子核素(89Zr，T1/2约3.3天)显像，这无疑增大了患者的总体辐射剂量。而单抗的F(ab')2(约100kDa)片段可以通过酶切产生，它保留了与完整抗体相同的抗原结合位点和免疫结合活性，因此，本发明对cetuximab的结构进行改造，保留功能区F(ab')2，并通过放射性核素99mTc标记后得到靶向EGFR的SPECT显像剂，探针分子量由150kDa减少到100kDa，可以加速探针在体内的代谢速度。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1.本发明利用cetuximab结合EGFR的特点，对cetuximab的结构进行改造，保留功能区F(ab')2，减少了探针分子量，由150kDa减少到100kDa，加速了探针在体内的代谢速度，有利于临床转化，16h显像效果最好，而完整单抗约为48h；与其他F(ab')2片段不同的是，IdeS酶的作用位点是特异的，反应时间短(30-60min)；而传统胃蛋白酶切割的F(ab')2片段是通过类似于“削铅笔”的方式切除Fc段，作用位点多，特异性差，且作用时间长(通常10小时以上)；
2.本发明在实验方法上，改进了先制备F(ab')2片段，后连接螯合剂的方式。本发明先连接螯合剂，后切割，减少了连接螯合剂过程中F(ab')2片段发生二聚体的几率，最大程度保留了F(ab')2片段的生物活性。
3.本发明成功合成了99mTc-MAG3-Cet-F(ab')2，并通过Western blots和IF筛选出高表达EGFR细胞系MGC803；通过生物分布和SPECT/CT成像，结果表明99mTc-MAG3-Cet-F(ab')2可以清楚地显示EGFR阳性肿瘤，达到无创评估肿瘤EGFR表达的目的。
附图说明
图1为本发明的SPECT显像剂99mTc-MAG3-Cet-F(ab')2的合成路线图；
图2为通过Western blots和IF筛选出高表达EGFR的细胞系MGC803；其中，2A为Western blots实验结果，2B为IF实验结果；
图3为SDS-PAGE测试Cet-F(ab')2的分子量；
图4为Cet-F(ab')2和Cetuximab的生物亲和性鉴定；
图5为Cet-F(ab')2的稳定性测试结果；
图6为99mTc-MAG3-Cet-F(ab')2的细胞饱和结合曲线；其中，左图为99mTc-MAG3-Cet-F(ab')2与MGC803细胞的饱和结合曲线，右图为99mTc-MAG3-Cet-F(ab')2与HT29细胞的饱和结合曲线；
图7为99mTc-MAG3-Cet-F(ab')2在小鼠体内的显像实验结果，其中，定位线焦点为肿瘤区域；
图8为99mTc-MAG3-Cet-F(ab')2在小鼠体内的生物分布。
具体实施方式
为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。
实施例1
靶向EGFR的SPECT显像剂99mTc-MAG3-Cet-F(ab')2制备：
99mTc-MAG3-Cet-F(ab')2的合成路线如图1所示。Cetuximab与NHS-MAG3在0.1mol/L碳酸氢盐缓冲液(pH 9.0)中常温反应2小时，西妥昔单抗：MAG3摩尔比＝1:5；反应产物经Zeba Spin脱盐柱7K MWCO用于纯化除去剩余MAG3；MAG3-Cet与IdeS蛋白酶(用量按照每1mg西妥昔单抗加入50U IdeS酶的比例进行计算)在消化缓冲液(50mM磷酸钠，150mM NaCl，pH6.6)中于37℃孵育30分钟；然后将消化的产物与蛋白A珠温育1小时并离心。附着在珠子上的Fc部分在沉淀物中被去除，而纯化的MAG3-Cet-F(ab')2留在上清液中；通过SDS-PAGE评价产物：SDS-PAGE在4-15％凝胶上在150V下进行1小时后，考马斯亮蓝染色显示产物分子量；99mTc放射性标记：将100μgMAG3-Cet-F(ab')2偶联物加入45μL醋酸铵(0.25M)和15μL酒石酸盐标准缓冲液的组合溶液中，然后加入不超过25μL(约5mCi)99mTcO4 -。混匀后立即加入3μL新鲜制备的1mg/mL SnCl2·2H2O溶液。将混匀溶液在室温下涡旋温育1小时。使用PD-10脱盐柱获得纯化的99mTc-MAG3-Cet-F(ab')2。
实施例2
1、通过Western blots和IF筛选出高表达EGFR细胞系：
Western blots实验：Ripa裂解MGC803细胞株和HT29细胞株蛋白，经加热变性后，每孔上样20微克，进行SDS-PAGE变性凝胶电泳。100V电泳1.5h后，进行转膜、一抗4摄氏度孵育过夜、洗膜、二抗孵育1h后，进行条带曝光，结果如图2A所示，显示EGFR在MGC803细胞株中高表达。
IF实验：MGC803肿瘤和HT29肿瘤组织石蜡切片脱蜡脱水后，0.01M枸橼酸钠缓冲液95℃抗原修复15分钟；降温后5％BSA封闭1小时；甩掉封闭液后，一抗4℃孵育过夜；PBS清洗3次，每次5分钟；0.01mg/ml荧光二抗孵育30分钟，DAPI染色5分钟；PBS清洗3次，每次5分钟，封片后荧光显微镜下观察，结果如图2B所示，MGC803为EGFR高表达细胞系。
2、凝胶电泳实验测Cet-F(ab')2的分子量：采用非还原性Loading Buffer混匀Cet-F(ab')2样品，加热变性后进行SDS-PAGE变性非还原电泳。150V 1.5h电泳结束后，完整取出凝胶，考马斯亮蓝染色，结果如图3所示，Cet-F(ab')2的分子量为100KDa。
3、鉴定生物亲和力：将Cetuximab与NHS-罗丹明在碳酸氢盐缓冲液(pH 9.0)中常温反应2小时，西妥昔单抗：NHS-罗丹明摩尔比＝1:5；反应产物经Zeba Spin脱盐柱7K MWCO用于纯化除去剩余NHS-罗丹明；罗丹明-Cet与IdeS蛋白酶在消化缓冲液(50mM磷酸钠，150mM NaCl，pH 6.6)中于37℃孵育30分钟；然后将消化的产物与蛋白A珠温育1小时并离心。附着在珠子上的Fc部分在沉淀物中被去除，而纯化的罗丹明-Cet-F(ab')2留在上清液中；将罗丹明-Cet-F(ab')2与罗丹明-Cet加入MGC803细胞株的培养液中，使终浓度均为10nmol/L，过夜后荧光显微镜观察，结果显示Cet-F(ab’)2和Cetuximab具有相近的生物亲和力，如图4所示。
4、体外稳定性实验：将20微克Cet-F(ab’)2分别置于PBS和1％BSA中，分别在1h、6h、12h和24h进行SDS-PAGE变性非还原电泳。随后考马斯亮蓝染色，结果如图5所示，由图5可知，Cet-F(ab’)2在PBS及1％BSA中经过24h几乎未分解，具有良好的稳定性。
实施例3
99mTc-MAG3-Cet-F(ab')2的细胞结合试验：
将MGC803细胞和HT29细胞(2×105/孔)接种于24孔板，各孔加入99mTc-MAG3-Cet-F(ab')2使终浓度由0.1nm递增至4nm。敷育2h后，PBS洗三遍，用1M NaOH消化5分钟，测各孔每分钟放射性计数(CPM)，得到细胞饱和结合曲线，如图6所示，由图6可知，99mTc-MAG3-Cet-F(ab')2与EGFR高表达细胞系MGC803细胞具有极佳的亲和力。
实施例4
99mTc-MAG3-Cet-F(ab')2在荷瘤小鼠体内的显像实验及生物学分布实验：
1、显像实验：用PBS重悬MGC803细胞，制备MGC803细胞悬液，浓度为1×107个/ml；将100μl细胞悬液接种在裸鼠右肩，常规饲养14天。肿瘤直径1cm左右时，将99mTc-MAG3-Cet-F(ab')2通过尾静脉注射，16h后进行小动物SPECT/CT显像，结果如图7所示。
2、生物学分布实验：取16只肿瘤模型鼠，随机分成4组，将99mTc-MAG3-Cet-F(ab')2通过尾静脉注射。在注射探针后1h、6h、16h和24h麻醉后处死，取组织和器官进行放射性计数，并称重，得到每克组织的放射性计数，结果如图8所示，由图8可知，显像剂注入小鼠体内后主要分布于血液、肝脏和肾脏中，其余各器官组织分布较少，16h后显像剂浓聚于MGC803细胞。
上述实施例仅为本发明的优选实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
- 上一篇：一种医用注射器针头装配设备
- 下一篇：抗IL-23R抗体及其用途