一种可快速固化的双网络水凝胶及其制备方法与应用
阅读说明:本技术 一种可快速固化的双网络水凝胶及其制备方法与应用 (Rapidly-curable double-network hydrogel and preparation method and application thereof ) 是由 裴仁军 张雅洁 于 2020-05-22 设计创作,主要内容包括:本发明公开了一种可快速固化的双网络水凝胶及其制备方法与应用。所述制备方法包括:将苯并噻唑修饰到四臂聚乙二醇上,获得苯并噻唑修饰的四臂聚乙二醇;将半胱氨酸修饰到四臂聚乙二醇上,获得半胱氨酸修饰的四臂聚乙二醇;以及,使包含丝素蛋白、苯并噻唑修饰的四臂聚乙二醇和半胱氨酸修饰的四臂聚乙二醇的均匀混合体系进行生物正交反应,形成第一重水凝胶网络,之后通过诱导丝素蛋白形成β折叠获得可快速固化的双网络水凝胶。本发明制备的双网络水凝胶固化时间短、内部孔隙分布均匀、机械性能显著增强、生物相容性好,能够为干细胞的存活和增殖提供良好的三维支撑生存环境,可广泛应用于细胞培养或组织工程等领域。(The invention discloses a rapidly-curable double-network hydrogel and a preparation method and application thereof. The preparation method comprises the following steps: modifying benzothiazole onto four-arm polyethylene glycol to obtain benzothiazole modified four-arm polyethylene glycol; modifying cysteine to the four-arm polyethylene glycol to obtain cysteine-modified four-arm polyethylene glycol; and carrying out bio-orthogonal reaction on a uniform mixing system containing silk fibroin, benzothiazole modified four-arm polyethylene glycol and cysteine modified four-arm polyethylene glycol to form a first heavy hydrogel network, and then inducing the silk fibroin to form beta folding to obtain the rapidly solidified double-network hydrogel. The double-network hydrogel prepared by the invention has the advantages of short curing time, uniform internal pore distribution, remarkably enhanced mechanical property and good biocompatibility, can provide a good three-dimensional supporting living environment for survival and proliferation of stem cells, and can be widely applied to the fields of cell culture or tissue engineering and the like.)
技术领域
本发明涉及一种双网络水凝胶,具体涉及一种三维的干细胞的培养,并促使所述干细胞进行增殖和分化的、可快速固化的双网络水凝胶及其制备方法与应用,属于组织工程材料制备技术领域。
背景技术
因疾病、遗传和衰老等造成的组织、器官缺损和功能障碍是人类健康所面临的主要危害之一,也是人类疾病和死亡最主要的缘由。为了从根本上解决组织、器官缺损和功能障碍这一问题,人们提出了组织工程这一概念,它是指运用工程学和生命科学的原理和方法,研究正常和病理条件下组织结构与功能的关系,开发生物替代品,修复、维持和改善组织功能。随着近几十年的发展,组织工程技术超越了传统的“拆东墙补西墙”疗法,使组织损伤的修复步入“重建、再生、替代”组织器官的新时代,成为了继药物治疗和手术治疗之后的第三种有效治疗途径。
组织工程主要方法是将功能相关的活细胞接种于细胞外基质替代物上,这种替代物能为细胞提供一个空间结构,细胞能够在上面生长,通过体外培养一定时间后形成细胞与替代物的复合物,然后将得到的复合物移植到体内受损组织处,修复受损组织。近年来,组织工程的研究内容主要集中在开发研究生物材料、生长因子、种子细胞培养及细胞与支架材料的复合及塑形等方面。
目前组织工程中细胞接种的常用方法包括:细胞接种于支架材料上和细胞与材料共混成水凝胶支架,其中细胞与材料共混能更好的控制细胞的分布,而且在细胞粘附、增殖、迁移与立体结构方面有诸多优势;此外通过控制共混水凝胶支架的形状可以提高组织修复的精确度和准确度。但为了确保细胞的活性通常需要寻找具有较高生物相容性的材料。
干细胞具有高增殖率、多分化潜能以及低免疫原性等特性,是最理想的组织工程用种子细胞。组织工程常用的包埋细胞的水凝胶材料包括明胶、胶原、透明质酸、壳聚糖、海藻酸盐、聚乳酸、聚乙二醇、聚己内酯等。高分子化合物具有较多的活性官能团,可以对其进行化学修饰,从而用不同的方法形成水凝胶,另外,通过调节水凝胶支架的性质,例如在水凝胶支架中掺杂细胞外基质,可能会增加细胞的黏附和趋化宿主细胞的迁移,同时也可能会增加种子细胞的分化能力。但多数人工合成高分子材料生物相容性低,降解不彻底,而天然的高分子材料降解速率较快,机械性能较差;因此,寻找生物相容性好以及可降解的材料作为三维培养细胞的支架尤为重要。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种可快速固化的双网络水凝胶及其制备方法,以克服现有技术中的不足。
本发明的另一个目的在于提供所述可快速固化的双网络水凝胶的应用。
为实现上述发明目的,本发明采用了如下技术方案:
本发明实施例提供了一种可快速固化的双网络水凝胶的制备方法,其包括:
(1)提供丝素蛋白;
(2)将苯并噻唑修饰到四臂聚乙二醇上,获得苯并噻唑修饰的四臂聚乙二醇;
(3)将半胱氨酸修饰到四臂聚乙二醇上,获得半胱氨酸修饰的四臂聚乙二醇;
(4)使包含丝素蛋白、苯并噻唑修饰的四臂聚乙二醇和半胱氨酸修饰的四臂聚乙二醇的均匀混合体系进行生物正交反应,形成第一重水凝胶网络,之后通过诱导丝素蛋白形成β折叠获得可快速固化的双网络水凝胶。
本发明实施例还提供了由前述方法制备的可快速固化的双网络水凝胶,所述双网络水凝胶的储能模量为2~20KPa,最大拉伸强度为0.01~0.1MPa,压缩应变为65%时压缩强度为0.05~0.5MPa,并具有多孔结构,其中所含孔洞的孔径为100~200μm。
本发明实施例还提供了前述的可快速固化的双网络水凝胶于细胞培养或组织工程领域中的用途。
本发明实施例还提供了一种三维细胞培养载体,其包含前述的可快速固化的双网络水凝胶。
本发明实施例还提供了一种细胞培养方法,其包括:
以前述的可快速固化的双网络水凝胶作为三维细胞培养载体进行干细胞的培养,并促使所述干细胞进行增殖和分化。
较之现有技术,本发明的有益效果在于:
1)本发明提供的基于丝素蛋白和功能化聚乙二醇体系构建可快速固化的双网络水凝胶的方法,将其应用于细胞的增殖与成软骨分化研究,实现了与细胞共混凝胶化。首先,将生物正交反应官能团苯并噻唑和半胱氨酸分别修饰到四臂聚乙二醇上,获得苯并噻唑修饰的四臂聚乙二醇和半胱氨酸修饰的四臂聚乙二醇,构建第一重快速交联网络;与此同时,从蚕茧中提取丝素蛋白,利用超声诱导β折叠形成构建第二重缓慢交联网络;将二者混合后在生物正交反应和超声诱导下制备得到丝素蛋白/聚乙二醇双网络水凝胶;
2)本发明提供的可快速固化的双网络水凝胶,结合了物理超声和生物正交点击化学反应两种作用方式,其优点在于生物正交反应快速进行的特性使得水凝胶体系迅速固化;然后,随着时间的延长,β折叠逐渐形成以提高凝胶的机械性能,同时制备方法简单,可大量制备;
3)本发明的可快速固化的双网络水凝胶,将常用的人工合成材料聚乙二醇进行功能化修饰,获得苯并噻唑修饰的四臂聚乙二醇和半胱氨酸修饰的四臂聚乙二醇,将天然蚕茧来源的丝素蛋白进行超声,然后作为溶剂分别溶解苯并噻唑修饰的四臂聚乙二醇和半胱氨酸修饰的四臂聚乙二醇,得到两种前体溶液,之后与细胞共混,将丝素蛋白与苯并噻唑修饰的四臂聚乙二醇和半胱氨酸修饰的四臂聚乙二醇相结合,一方面显著提升了该水凝胶体系的固化速度,另一方面增强了该水凝胶体系的机械性能,所获的双交联水凝胶的固化时间短、内部孔隙分布均匀、生物相容性好、毒性低,其内部孔径100-200μm,适合营养物质和细胞代谢废物的流通,为干细胞的存活和增殖提供良好的三维支撑生存环境,同时所述制备的双网络水凝胶采用干细胞共混成型的方法,通过加入促软骨分化生长因子(TGF-β1/bFGF),有效促进干细胞成软骨细胞分化。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明一典型实施例中所获双网络水凝胶的制备机理示意图。
图2是本发明一典型实施例中所获双网络水凝胶的微观结构图。
图3a-图3c分别是本发明一典型实施例中所获双网络水凝胶的机械性能图。
图4a-图4c分别是干细胞在本发明一典型实施例中所获双网络水凝胶中的生长共聚焦图、三维扫描图以及增殖图。
图5a-图5c是干细胞在本发明一典型实施例中所获双网络水凝胶中于体外培养条件下向软骨细胞分化的mRNA表达水平图。
具体实施方式
如前所述,鉴于现有技术的缺陷,本案发明人经长期研究和大量实践,得以提出本发明的技术方案。通过应连同所附图式一起阅读的以下具体实施方式将更完整地理解本发明。本文中揭示本发明的详细实施例;然而,应理解,所揭示的实施例仅具本发明的示范性,本发明可以各种形式来体现。因此,本文中所揭示的特定功能细节不应解释为具有限制性,而是仅解释为权利要求书的基础且解释为用于教示所属领域的技术人员在事实上任何适当详细实施例中以不同方式采用本发明的代表性基础。
作为本发明技术方案的一个方面,其所涉及的系一种可快速固化的双网络水凝胶的制备方法,其包括:
(1)提供丝素蛋白;
(2)将苯并噻唑修饰到四臂聚乙二醇上,获得苯并噻唑修饰的四臂聚乙二醇;
(3)将半胱氨酸修饰到四臂聚乙二醇上,获得半胱氨酸修饰的四臂聚乙二醇;
(4)使包含丝素蛋白、苯并噻唑修饰的四臂聚乙二醇和半胱氨酸修饰的四臂聚乙二醇的均匀混合体系进行生物正交反应,形成第一重水凝胶网络,之后通过诱导丝素蛋白形成β折叠获得可快速固化的双网络水凝胶。
在一些实施方案中,步骤(1)具体包括:使包含质量体积比为1~3:10的天然丝素蛋白与中性盐溶液的第一混合反应体系于50~60℃反应4~6h,再经后处理,获得纯的可溶于水的丝素蛋白。
进一步地,步骤(1)还包括:在所述的反应结束后,将所获反应混合物透析1~3天,其中采用的透析袋的截留分子量为7~14KDa,之后冷冻干燥,获得纯的丝素蛋白。
进一步地,步骤(1)具体包括:将天然蚕茧脱胶,获得所述的天然丝素蛋白。
在一些优选的实施方案中,步骤(1)具体包括:将挑选干净的蚕茧加入0.02mol/LNa2CO3溶液中于100℃水浴锅中煮沸2遍,每次至少40min,用去离子水清洗多次并拧干以除去丝胶,60℃烘箱过夜干燥,随后将干燥后的丝素蛋白放入中性盐溶液中形成第一混合反应体系进行所述的反应,并维持反应体系的温度为50~60℃。
进一步地,所述中性盐溶液所含盐包括硝酸镁、氯化钙、溴化锂等中的任意一种或两种以上的组合,但不限于此。
进一步地,所述中性盐溶液的浓度为9~10mol/L。
进一步地,所述天然丝素蛋白与中性盐溶液的质量体积比为1~3:10w/v%。
在一些实施方案中,步骤(2)具体包括:将苯并噻唑与四臂聚乙二醇混合均匀,并于15~30℃反应10~20h,获得苯并噻唑修饰的四臂聚乙二醇。
进一步地,所述苯并噻唑修饰的四臂聚乙二醇的结构式如式(1)所示:
其中,n的取值为50~130。
在一些较为优选的实施方案中,步骤(2)具体包括:
使包含四臂聚乙二醇、缩合剂和第一溶剂的第二混合反应体系于0~8℃反应10~30min活化羧基,之后加入苯并噻唑,混合均匀形成第三混合反应体系,之后使所述第三混合反应体系于15~30℃反应10~20h,获得苯并噻唑修饰的四臂聚乙二醇。
作为优选方案之一,所述缩合剂与四臂聚乙二醇的摩尔比为1~3:1。
进一步地,所述缩合剂包括二环己基碳二亚胺、苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐、N-甲基吗啉、1-羟基苯并三唑、氯甲酸异丁酯、2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐等中的任意一种或两种以上的组合,但不限于此。
进一步地,所述苯并噻唑与四臂聚乙二醇的摩尔比为1~3:1。
进一步地,所述第一溶剂包括N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、四氢呋喃等中的任意一种或两种以上的组合,但不限于此。
进一步地,步骤(2)还包括:在所述第三混合反应体系的反应结束后,将所获反应混合物加入到大量不良溶剂中,并收集沉淀;随后通过葡聚糖凝胶柱G-15纯化并冷冻干燥,即得到苯并噻唑修饰的四臂聚乙二醇。
进一步地,所述不良溶剂包括正己烷、乙醚等,但不限于此。且所述不良溶剂与第三混合反应体系的体积比为10~20:1。
在一些实施方案中,步骤(3)具体包括:使包含有第二溶剂、氨基巯基被保护的半胱氨酸和缩合剂的第四混合反应体系于0~8℃反应10~30min活化羧基,之后再加入四臂聚乙二醇,混合均匀形成第五混合反应体系,之后使所述第五混合反应体系于15~30℃反应10~20h,获得氨基巯基被保护的半胱氨酸修饰的四臂聚乙二醇。
进一步地,所述氨基巯基被保护的半胱氨酸与四臂聚乙二醇的摩尔比为1~3:1。
进一步地,所述缩合剂与氨基巯基被保护的半胱氨酸的摩尔比为1~3:1。
进一步地,所述缩合剂包括二环己基碳二亚胺、苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐、N-甲基吗啉、1-羟基苯并三唑、氯甲酸异丁酯、2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐等中的任意一种或两种以上的组合,但不限于此。
进一步地,所述第二溶剂包括N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、四氢呋喃等中的任意一种或两种以上的组合,但不限于此。
进一步地,步骤(3)还包括:在所述第五混合反应体系的反应结束后,将所获反应混合物加入不良溶剂中,并收集沉淀、提纯,之后冷冻干燥,获得氨基巯基被保护的半胱氨酸修饰的四臂聚乙二醇。
进一步地,所述不良溶剂包括正己烷、乙醚等,但不限于此,且所述不良溶剂与第五混合反应体系的体积比为10~20:1。
在一些较为优选的实施方案中,步骤(3)还包括:将氨基巯基被保护的半胱氨酸修饰的四臂聚乙二醇、三氟乙酸和第三溶剂均匀混合形成第六混合反应体系,于10~30℃反应1~4h,将所获反应混合物透析1~3天,之后冷冻干燥,获得巯基被保护的半胱氨酸修饰的四臂聚乙二醇。
进一步地,所述三氟乙酸与氨基巯基被保护的半胱氨酸修饰的四臂聚乙二醇的质量比为30~100:1。
进一步地,所述第三溶剂包括N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、四氢呋喃等中的任意一种或两种以上的组合,但不限于此。
作为优选方案之一,所述制备方法还包括:在所述第六混合反应体系的反应结束后,将所获反应混合物以截留分子量为3500~14000Da的透析袋透析1~3天,之后通过葡聚糖凝胶柱G-15进行提纯,之后冷冻干燥,即得到巯基被保护的半胱氨酸修饰的四臂聚乙二醇。
在一些较为优选的实施方案中,步骤(3)还包括:将所述巯基被保护的半胱氨酸修饰的四臂聚乙二醇与二硫苏糖醇于磷酸盐缓冲溶液中混合均匀形成第七混合反应体系,于10~30℃反应5~20min,获得半胱氨酸修饰的四臂聚乙二醇。
进一步地,所述的二硫苏糖醇与巯基被保护的半胱氨酸修饰的四臂聚乙二醇的摩尔比为3~5:1。
进一步地,所述半胱氨酸修饰的四臂聚乙二醇的结构式如式(2)所示:
其中,m的取值为50~130。
在一些实施方案中,步骤(4)具体包括:
将丝素蛋白与磷酸缓冲盐溶液混合,形成丝素蛋白溶液;
将所述丝素蛋白溶液分别与苯并噻唑修饰的四臂聚乙二醇、半胱氨酸修饰的四臂聚乙二醇混合,从而形成苯并噻唑修饰的四臂聚乙二醇前体溶液、半胱氨酸修饰的四臂聚乙二醇前体溶液;以及,
使所述苯并噻唑修饰的四臂聚乙二醇前体溶液、半胱氨酸修饰的四臂聚乙二醇前体溶液混合进行生物正交反应,形成第一重水凝胶网络,之后通过诱导丝素蛋白形成β折叠,获得可快速固化的双网络水凝胶。
在一些较为优选的实施方案中,步骤(4)具体包括:
将丝素蛋白溶解于磷酸缓冲盐溶液(PBS)中形成浓度为5~10w/v%的溶液,随后将丝素蛋白溶液超声,作为溶剂分别溶解四臂聚乙二醇-嗪聚合物和四臂聚乙二醇-环辛烯聚合物,获得两种前体溶液;
将所述前体溶液等体积混合均匀后转移到模具中,形成初步固化成型的水凝胶,再于培养箱内放置30min,通过诱导丝素蛋白缓慢形成β折叠,获得二次固化的双网络水凝胶。
进一步地,所述丝素蛋白溶液中丝素蛋白的浓度为5~10w/v%。
进一步地,所述超声的条件为:超声功率为180~240W,超声时间为2~5s,暂停2~5s,循环6~10次。
进一步地,所述苯并噻唑修饰的四臂聚乙二醇与半胱氨酸修饰的四臂聚乙二醇的摩尔比为1:1~3。
其中,本发明采用生物正交反应快速固化成型,进一步采用物理超声诱导丝素蛋白形成β折叠。
在一些更为具体的实施例之中,所述可快速固化的双网络水凝胶的制备方法包括以下步骤:
(1)至少将天然蚕茧脱胶,然后与溴化锂混合反应获得丝素蛋白;
(2)至少将苯并噻唑修饰到四臂聚乙二醇上,获得苯并噻唑修饰的四臂聚乙二醇;
(3)至少将半胱氨酸修饰到四臂聚乙二醇上,获得半胱氨酸修饰的四臂聚乙二醇;
(4)至少将丝素蛋白超声后分别溶解苯并噻唑修饰的四臂聚乙二醇和半胱氨酸修饰的四臂聚乙二醇,获得两种前体溶液;
(5)至少将所述两种前体溶液混合均匀通过生物正交反应形成第一重水凝胶网络,之后于培养箱内放置30min,通过诱导丝素蛋白形成β折叠获得双网络水凝胶。
本发明实施例的另一个方面还提供了由前述方法制备的可快速固化的双网络水凝胶,所述双网络水凝胶的储能模量为2~20KPa,最大拉伸强度为0.01~0.1MPa,压缩应变为65%时压缩强度为0.05~0.5MPa,并具有多孔结构,其中所含孔洞的孔径为100~200μm。
本发明实施例的另一个方面还提供了前述的可快速固化的双网络水凝胶于细胞培养或组织工程领域中的用途。
本发明实施例的另一个方面还提供了一种三维细胞培养载体,其包含前述的可快速固化的双网络水凝胶。
本发明实施例的另一个方面还提供了一种细胞培养方法,其包括:
以前述的可快速固化的双网络水凝胶作为三维细胞培养载体进行干细胞的培养,并促使所述干细胞进行增殖和分化。
在一些实施方案中,所述细胞为大鼠骨髓间充质干细胞。
进一步地中,干细胞于所述双网络水凝胶上的负载量为100~1000万个/mL。
藉由上述技术方案,本发明的双网络水凝胶将常用的人工合成材料聚乙二醇进行功能化修饰,获得苯并噻唑修饰的四臂聚乙二醇和半胱氨酸修饰的四臂聚乙二醇,将天然蚕茧来源的丝素蛋白进行超声,然后作为溶剂分别溶解苯并噻唑修饰的四臂聚乙二醇和半胱氨酸修饰的四臂聚乙二醇,得到两种前体溶液,之后与细胞共混,将丝素蛋白与苯并噻唑修饰的四臂聚乙二醇和半胱氨酸修饰的四臂聚乙二醇相结合,一方面显著提升了该水凝胶体系的固化速度,另一方面增强了该水凝胶体系的机械性能,所获的双交联水凝胶的固化时间短、内部孔隙分布均匀、生物相容性好、毒性低,其内部孔径100-200μm,适合营养物质和细胞代谢废物的流通,为干细胞的存活和增殖提供良好的三维支撑生存环境,同时所述制备的双网络水凝胶采用与干细胞共混成型的方法,通过加入促血管化生长因子(TGF-β1/bFGF),有效促进干细胞分化成软骨细胞。同时制备方法简单,可大量制备。
下面结合若干优选实施例及附图对本发明的技术方案做进一步详细说明,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。以下实施例中采用的实施条件可以根据实际需要而做进一步调整,未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。
实施例1
步骤一:将挑选干净的蚕茧加入0.02mol/L Na2CO3溶液中于100℃水浴锅中煮沸2遍,每次至少40min,用去离子水清洗多次并拧干以除去丝胶,60℃烘箱过夜干燥,随后将干燥后的丝素蛋白放入LiBr溶液中形成第一混合反应体系进行所述的反应,并维持反应体系的温度为60℃,反应4h,其中,LiBr溶液浓度为9.3mol/L,LiBr与丝素蛋白的质量比为10:1。
步骤一反应结束后用7KDa截留量透析3天除去杂质,-80℃冷冻过夜,-50℃冷冻干燥3天,获得纯的丝素蛋白。
步骤二:将四臂聚乙二醇溶解于1%无水N,N-二甲基甲酰胺溶液中,并加入N-甲基吗啉、氯甲酸异丁酯于4℃反应20min。其中,所述N-甲基吗啉与四臂聚乙二醇的摩尔比为1:1,氯甲酸异丁酯与四臂聚乙二醇的摩尔比为1:1。
步骤三:步骤一的反应结束后,加入苯并噻唑,于15℃反应20h。其中,所述苯并噻唑与四臂聚乙二醇的摩尔比为1.5:1。
步骤三的反应结束后,在乙醚中沉淀,乙醚与混合体系的体积比为10:1,得到白色絮状沉淀,12000rpm离心5min收集沉淀,水溶解后通过葡聚糖凝胶柱G-15提纯,冻干,得到苯并噻唑修饰的四臂聚乙二醇,其结构式如式(1)所示:
其中,n的取值为113。
这种苯并噻唑修饰的四臂聚乙二醇,主要是将苯并噻唑分子修饰到四臂聚乙二醇上,改善了其水溶性,使本只不溶于水的苯并噻唑分子溶解在水相中。
步骤四:将氨基巯基被保护的半胱氨酸溶于无水N,N-二甲基甲酰胺溶液中,加入1-羟基苯并三唑、2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯混合后于4℃反应15min,再加入四臂聚乙二醇,于15℃反应20h。其中,1-羟基苯并三唑与氨基巯基被保护的半胱氨酸的摩尔比为1.5:1,2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯与氨基巯基被保护的半胱氨酸的摩尔比为1.5:1,四臂聚乙二醇与氨基巯基被保护的半胱氨酸的摩尔比为0.667:1。
步骤四的反应结束后,在乙醚中沉淀,乙醚与混合体系的体积比为10:1,得到白色絮状沉淀,12000rpm离心5min收集沉淀,水溶解后通过葡聚糖凝胶柱G-15提纯,冻干,得到氨基巯基被保护的半胱氨酸修饰的四臂聚乙二醇。
步骤五:将氨基巯基被保护的半胱氨酸修饰的四臂聚乙二醇、三氟乙酸和二氯甲烷均匀混合,于20℃反应2h。其中,三氟乙酸与氨基巯基被保护的半胱氨酸修饰的四臂聚乙二醇质量比为100:1。
反应步骤五结束后,将所获反应混合物以截留分子量为3500Da的透析袋透析3天,之后通过葡聚糖凝胶柱G-15进行提纯,之后冷冻干燥,即得到巯基被保护的半胱氨酸修饰的四臂聚乙二醇。
步骤六:将所述巯基被保护的半胱氨酸修饰的四臂聚乙二醇与二硫苏糖醇于磷酸盐缓冲溶液中混合均匀,于15℃反应15min。其中,二硫苏糖醇与巯基被保护的半胱氨酸修饰的四臂聚乙二醇摩尔比为4:1。
步骤六结束后,冷冻干燥后获得半胱氨酸修饰的四臂聚乙二醇,所述半胱氨酸修饰的四臂聚乙二醇的结构式如式(2)所示:
其中,m的取值为113。
这种半胱氨酸修饰的四臂聚乙二醇主要是在人工合成的聚乙二醇高分子上修饰上生物正交反应官能团半胱氨酸,用于快速交联成胶。
步骤七:将丝素蛋白溶解于PBS中形成浓度为5w/v%的溶液,随后将丝素蛋白溶液超声(功率240w,超声5s,暂停5s,循环6次),作为溶剂分别溶解苯并噻唑修饰的四臂聚乙二醇和半胱氨酸修饰的四臂聚乙二醇,获得两种前体溶液(5%SF/2.5%PEG-CBT溶液和5%SF/2.5%PEG-Cys),然后将所述前体溶液等体积混合均匀后转移到模具中,初步固化成型,再于培养箱内放置30min,通过诱导丝素蛋白缓慢形成β折叠,获得二次固化的双网络水凝胶。
实施例2
步骤一:将挑选干净的蚕茧加入0.02mol/L Na2CO3溶液中于100℃水浴锅中煮沸2遍,每次至少40min,用去离子水清洗多次并拧干以除去丝胶,60℃烘箱过夜干燥,随后将干燥后的丝素蛋白放入LiBr溶液中形成第一混合反应体系进行所述的反应,并维持反应体系的温度为60℃,反应5h;其中,LiBr溶液浓度为9.3mol/L,LiBr与丝素蛋白的质量比为10:1。
步骤一反应结束后用7KDa截留量透析2天除去杂质,-80℃冷冻过夜,-50℃冷冻干燥3天,获得纯的丝素蛋白。
步骤二:将四臂聚乙二醇溶解于1%无水N,N-二甲基甲酰胺溶液中,并加入N-甲基吗啉、氯甲酸异丁酯于4℃反应20min。其中,所述N-甲基吗啉与四臂聚乙二醇的摩尔比为1:1,氯甲酸异丁酯与四臂聚乙二醇的摩尔比为1:1。
步骤三:步骤二的反应结束后,加入苯并噻唑,于15℃反应20h。其中,所述苯并噻唑与四臂聚乙二醇的摩尔比为1:1。
步骤三的反应结束后,在乙醚中沉淀,乙醚与混合体系的体积比为15:1,得到白色絮状沉淀,12000rpm离心5min收集沉淀,水溶解后通过葡聚糖凝胶柱G-15提纯,冻干,得到苯并噻唑修饰的四臂聚乙二醇,其结构式如式(1)所示。其中,n的取值为50。
步骤四:将氨基巯基被保护的半胱氨酸溶于无水N,N-二甲基甲酰胺溶液中,加入1-羟基苯并三唑、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯混合后于6℃反应20min,再加入四臂聚乙二醇,于15℃反应20h。其中,1-羟基苯并三唑与氨基巯基被保护的半胱氨酸的摩尔比为1.5:1,苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯与氨基巯基被保护的半胱氨酸的摩尔比为1.5:1,四臂聚乙二醇与氨基巯基被保护的半胱氨酸的摩尔比为0.667:1。
步骤四的反应结束后,在乙醚中沉淀,乙醚与混合体系的体积比为15:1,得到白色絮状沉淀,12000rpm离心5min收集沉淀,水溶解后通过葡聚糖凝胶柱G-15提纯,冻干,得到氨基巯基被保护的半胱氨酸修饰的四臂聚乙二醇。
步骤五:将氨基巯基被保护的半胱氨酸修饰的四臂聚乙二醇、三氟乙酸和二氯甲烷均匀混合,于10℃反应4h。其中,三氟乙酸与氨基巯基被保护的半胱氨酸修饰的四臂聚乙二醇质量比为100:1。
反应步骤五结束后,将所获反应混合物以截留分子量为3500Da的透析袋透析3天,之后通过葡聚糖凝胶柱G-15进行提纯,之后冷冻干燥,即得到巯基被保护的半胱氨酸修饰的四臂聚乙二醇。
步骤六:将所述巯基被保护的半胱氨酸修饰的四臂聚乙二醇与二硫苏糖醇于磷酸盐缓冲溶液中混合均匀,于10℃反应20min。其中,二硫苏糖醇与巯基被保护的半胱氨酸修饰的四臂聚乙二醇摩尔比为4:1。
步骤六结束后,冷冻干燥后获得半胱氨酸修饰的四臂聚乙二醇,半胱氨酸修饰的四臂聚乙二醇的结构式如式(2)所示。其中,m的取值是50。
步骤七:将丝素蛋白溶解于PBS中形成浓度为5w/v%的溶液,随后将丝素蛋白溶液超声(功率180w,超声5s,暂停5s,循环6次),作为溶剂分别溶解苯并噻唑修饰的四臂聚乙二醇和半胱氨酸修饰的四臂聚乙二醇,获得两种前体溶液(3%SF/3.5%PEG-CBT溶液和3%SF/3.5%PEG-Cys),然后将所述前体溶液等体积混合均匀后转移到模具中,初步固化成型,再于培养箱内放置30min,通过诱导丝素蛋白缓慢形成β折叠,获得二次固化的双网络水凝胶。
实施例3
步骤一:将挑选干净的蚕茧加入0.02mol/L Na2CO3溶液中于100℃水浴锅中煮沸2遍,每次至少40min,用去离子水清洗多次并拧干以除去丝胶,60℃烘箱过夜干燥,随后将干燥后的丝素蛋白放入LiBr溶液中形成第一混合体系进行所述的反应,并维持反应体系的温度为60℃,反应4h;其中,LiBr溶液浓度为9.3mol/L,LiBr与丝素蛋白的质量比为10:1。
步骤一反应结束后用7KDa截留量透析1天除去杂质,-80℃冷冻过夜,-50℃冷冻干燥3天,获得纯的丝素蛋白。
步骤二:将四臂聚乙二醇溶解于1%无水N,N-二甲基甲酰胺溶液中,并加入N-甲基吗啉、氯甲酸异丁酯于4℃反应20min。其中,所述N-甲基吗啉与四臂聚乙二醇的摩尔比为1.5:1,氯甲酸异丁酯与四臂聚乙二醇的摩尔比为1.5:1。
步骤三:步骤二的反应结束后,加入苯并噻唑,于15℃反应20h。其中,所述苯并噻唑与四臂聚乙二醇的摩尔比为1.5:1。
步骤三的反应结束后,在乙醚中沉淀,乙醚与混合体系的体积比为18:1,得到白色絮状沉淀,12000rpm离心5min收集沉淀,水溶解后通过葡聚糖凝胶柱G-15提纯,冻干,得到苯并噻唑修饰的四臂聚乙二醇,其结构式如式(1)所示。其中,n的取值为130。
步骤四:将氨基巯基被保护的半胱氨酸溶于无水N,N-二甲基甲酰胺溶液中,加入1-羟基苯并三唑、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯混合后于5℃反应18min,再加入四臂聚乙二醇,于15℃反应20h。其中,1-羟基苯并三唑与氨基巯基被保护的半胱氨酸的摩尔比为1.5:1,苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯与氨基巯基被保护的半胱氨酸的摩尔比为1:1,四臂聚乙二醇与氨基巯基被保护的半胱氨酸的摩尔比为0.667:1。
步骤四的反应结束后,在乙醚中沉淀,乙醚与混合体系的体积比为15:1,得到白色絮状沉淀,12000rpm离心5min收集沉淀,水溶解后通过葡聚糖凝胶柱G-15提纯,冻干,得到氨基巯基被保护的半胱氨酸修饰的四臂聚乙二醇。
步骤五:将氨基巯基被保护的半胱氨酸修饰的四臂聚乙二醇、三氟乙酸和二氯甲烷均匀混合,于30℃反应1h。其中,三氟乙酸与氨基巯基被保护的半胱氨酸修饰的四臂聚乙二醇质量比为100:1。
反应步骤五结束后,将所获反应混合物以截留分子量为3500Da的透析袋透析3天,之后通过葡聚糖凝胶柱G-15进行提纯,之后冷冻干燥,即得到巯基被保护的半胱氨酸修饰的四臂聚乙二醇。
步骤六:将所述巯基被保护的半胱氨酸修饰的四臂聚乙二醇与二硫苏糖醇于磷酸盐缓冲溶液中混合均匀,于15℃反应5min。其中,二硫苏糖醇与巯基被保护的半胱氨酸修饰的四臂聚乙二醇摩尔比为4:1。
步骤六结束后,冷冻干燥后获得半胱氨酸修饰的四臂聚乙二醇,半胱氨酸修饰的四臂聚乙二醇的结构式如式(2)所示。其中,m的取值是130。
步骤七:将丝素蛋白溶解于PBS中形成浓度为10w/v%的溶液,随后将丝素蛋白溶液超声(功率240w,超声2s,暂停2s,循环8次),作为溶剂分别溶解苯并噻唑修饰的四臂聚乙二醇和半胱氨酸修饰的四臂聚乙二醇,获得两种前体溶液(5%SF/2.5%PEG-CBT溶液和5%SF/2.5%PEG-Cys),然后将所述前体溶液等体积混合均匀后转移到模具中,所述四苯并噻唑修饰的四臂聚乙二醇与半胱氨酸修饰的四臂聚乙二醇的摩尔比为1:1,初步固化成型,再于培养箱内放置30min,通过诱导丝素蛋白缓慢形成β折叠,获得二次固化的双网络水凝胶。
实施例4
步骤一:将挑选干净的蚕茧加入0.02mol/L Na2CO3溶液中于100℃水浴锅中煮沸2遍,每次至少40min,用去离子水清洗多次并拧干以除去丝胶,60℃烘箱过夜干燥,随后将干燥后的丝素蛋白放入LiBr溶液中形成第一混合反应体系进行所述的反应,并维持反应体系的温度为55℃,反应5h;其中,LiBr溶液浓度为9mol/L,丝素蛋白与溴化锂的质量体积比为2:10(w/v,%)。
步骤一反应结束后用14KDa截留量透析1天除去杂质,-80℃冷冻过夜,-50℃冷冻干燥3天,获得纯的可溶于水的丝素蛋白。
步骤二:将四臂聚乙二醇溶解于1%无水N,N-二甲基甲酰胺溶液中,并加入N-甲基吗啉、氯甲酸异丁酯于8℃进行冰上反应30min。其中,所述N-甲基吗啉与四臂聚乙二醇的摩尔比为1:1,氯甲酸异丁酯与四臂聚乙二醇的摩尔比为2:1。
步骤三:步骤二的反应结束后,加入苯并噻唑,于25℃反应10h。其中,所述四臂聚乙二醇与苯并噻唑的摩尔比为1:3。
步骤三的反应结束后,在乙醚中沉淀,乙醚与混合体系的体积比为20:1,得到白色絮状沉淀,12000rpm离心5min收沉淀,用水溶解上述沉淀,通过葡聚糖凝胶柱G-15进行提纯,得到苯并噻唑修饰的四臂聚乙二醇溶液,苯并噻唑修饰的四臂聚乙二醇结构式如上述式(1)所示。其中,n的取值为60。
步骤四:将氨基巯基被保护的半胱氨酸溶于N,N-二甲基甲酰胺溶液中,加入1-羟基苯并三唑、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯混合后于8℃反应10min,再加入四臂聚乙二醇,于25℃反应10h。其中,1-羟基苯并三唑与氨基巯基被保护的半胱氨酸的摩尔比为21:1,苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯与氨基巯基被保护的半胱氨酸的摩尔比为2:1,四臂聚乙二醇与氨基巯基被保护的半胱氨酸的摩尔比为1:1。
步骤四的反应结束后,在乙醚中沉淀,乙醚与混合体系的体积比为18:1,得到白色絮状沉淀,12000rpm离心5min收集沉淀,水溶解后通过葡聚糖凝胶柱G-15提纯,冻干,得到氨基巯基被保护的半胱氨酸修饰的四臂聚乙二醇。
步骤五:将氨基巯基被保护的半胱氨酸修饰的四臂聚乙二醇、三氟乙酸和二氯甲烷均匀混合,于18℃反应1h。其中,三氟乙酸与二氯甲烷与氨基巯基被保护的半胱氨酸修饰的四臂聚乙二醇质量比均为50:1。
反应步骤五结束后,将所获反应混合物以截留分子量为14000Da的透析袋透析1天,之后通过葡聚糖凝胶柱G-15进行提纯,之后冷冻干燥,即得到巯基被保护的半胱氨酸修饰的四臂聚乙二醇。
步骤六:将所述巯基被保护的半胱氨酸修饰的四臂聚乙二醇与二硫苏糖醇于磷酸盐缓冲溶液中混合均匀,于20℃反应10min。其中,二硫苏糖醇与巯基被保护的半胱氨酸修饰的四臂聚乙二醇摩尔比为3:1。
步骤六结束后,冷冻干燥后获得半胱氨酸修饰的四臂聚乙二醇,半胱氨酸修饰的四臂聚乙二醇的结构式如上述式(2)所示。其中,m的取值为115。
步骤七:将丝素蛋白溶解于PBS中形成浓度为10w/v%的溶液,随后将丝素蛋白溶液超声(功率200w,超声3s,暂停3s,循环6次),作为溶剂分别溶解苯并噻唑修饰的四臂聚乙二醇和半胱氨酸修饰的四臂聚乙二醇,获得两种前体溶液(7%SF/1.5%PEG-CBT溶液和7%SF/1.5%PEG-Cys),然后将所述前体溶液混合均匀后转移到模具中,所述四苯并噻唑修饰的四臂聚乙二醇与半胱氨酸修饰的四臂聚乙二醇的摩尔比为1:2,初步固化成型,再于培养箱内放置30min,通过诱导丝素蛋白缓慢形成β折叠,获得二次固化的双网络水凝胶。
实施例5
步骤一:将挑选干净的蚕茧加入0.02mol/L Na2CO3溶液中于100℃水浴锅中煮沸2遍,每次至少40min,用去离子水清洗多次并拧干以除去丝胶,60℃烘箱过夜干燥,随后将干燥后的丝素蛋白放入LiBr溶液中形成第一混合反应体系进行所述的反应,并维持反应体系的温度为50℃,反应6h;其中,LiBr溶液浓度为10mol/L,丝素蛋白与溴化锂的质量体积比为3:10(w/v,%)。
步骤一反应结束后用10KDa截留量透析2天除去杂质,-80℃冷冻过夜,-50℃冷冻干燥1天,获得纯的丝素蛋白。
步骤二:将四臂聚乙二醇溶解于1%无水N,N-二甲基甲酰胺溶液中,并加入N-甲基吗啉、氯甲酸异丁酯于0℃进行冰上反应10min。其中,所述N-甲基吗啉与四臂聚乙二醇的摩尔比为2:1,氯甲酸异丁酯与四臂聚乙二醇的摩尔比为1:1。
步骤三:步骤二的反应结束后,加入苯并噻唑,于30℃反应15h。其中,所述四臂聚乙二醇与苯并噻唑的摩尔比为1:2。
步骤三的反应结束后,在正己烷中沉淀,正己烷与混合体系的体积比为20:1,得到白色絮状沉淀,12000rpm离心5min收沉淀,用水溶解上述沉淀,通过葡聚糖凝胶柱G-15进行提纯,得到苯并噻唑修饰的四臂聚乙二醇溶液,苯并噻唑修饰的四臂聚乙二醇结构式如上述式(1)所示。其中,n的取值为115。
步骤四:将氨基巯基被保护的半胱氨酸溶于N,N-二甲基甲酰胺溶液中,加入1-羟基苯并三唑、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯混合后于0℃反应30min,再加入四臂聚乙二醇,于30℃反应15h。其中,1-羟基苯并三唑与氨基巯基被保护的半胱氨酸的摩尔比为1:1,苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯与氨基巯基被保护的半胱氨酸的摩尔比为1:1,四臂聚乙二醇与氨基巯基被保护的半胱氨酸的摩尔比为1:3。
步骤四的反应结束后,在正己烷中沉淀,正己烷与混合体系的体积比为20:1,得到白色絮状沉淀,12000rpm离心5min收集沉淀,水溶解后通过葡聚糖凝胶柱G-15提纯,冻干,得到氨基巯基被保护的半胱氨酸修饰的四臂聚乙二醇。
步骤五:将氨基巯基被保护的半胱氨酸修饰的四臂聚乙二醇、三氟乙酸和二氯甲烷均匀混合,于25℃反应3h。其中,三氟乙酸与二氯甲烷与氨基巯基被保护的半胱氨酸修饰的四臂聚乙二醇质量比均为30:1。
反应步骤五结束后,将所获反应混合物以截留分子量为10000Da的透析袋透析2天,之后通过葡聚糖凝胶柱G-15进行提纯,之后冷冻干燥,即得到巯基被保护的半胱氨酸修饰的四臂聚乙二醇。
步骤六:将所述巯基被保护的半胱氨酸修饰的四臂聚乙二醇与二硫苏糖醇于磷酸盐缓冲溶液中混合均匀,于30℃反应5min。其中,二硫苏糖醇与巯基被保护的半胱氨酸修饰的四臂聚乙二醇摩尔比为5:1。
步骤六结束后,冷冻干燥后获得半胱氨酸修饰的四臂聚乙二醇,半胱氨酸修饰的四臂聚乙二醇的结构式如上述式(2)所示。其中,m的取值为115。
步骤七:将丝素蛋白溶解于PBS中形成浓度为8w/v%的溶液,随后将丝素蛋白溶液超声(功率220w,超声5s,暂停5s,循环10次),作为溶剂分别溶解苯并噻唑修饰的四臂聚乙二醇和半胱氨酸修饰的四臂聚乙二醇,获得两种前体溶液(5%SF/2.5%PEG-CBT溶液和5%SF/2.5%PEG-Cys),然后将所述前体溶液混合均匀后转移到模具中,所述四苯并噻唑修饰的四臂聚乙二醇与半胱氨酸修饰的四臂聚乙二醇的摩尔比为1:3,初步固化成型,再于培养箱内放置30min,通过诱导丝素蛋白缓慢形成β折叠,获得二次固化的双网络水凝胶。
上述步骤一至步骤七可通过图1表示。
性能测试一
在场环扫描电镜测试仪上测试本实施例所获双网络水凝胶内部结构及孔径大小,其操作方法包括:
将上述双网络水凝胶液氮冷冻,-50℃冷冻干燥24h,0.2mA喷金3min,扫描电镜观察水凝胶微观形貌图(如图2所示)。通过扫描电镜可以看出,该双网络水凝胶微观结构多孔,孔径约为100~200μm。
性能测试二
将上述丝素蛋白溶解于PBS中形成浓度为5w/v%的溶液,随后将丝素蛋白溶液超声(功率240w,超声5s,暂停5s,循环6次),作为溶剂分别溶解苯并噻唑修饰的四臂聚乙二醇和半胱氨酸修饰的四臂聚乙二醇,获得两种前体溶液(5%SF/2.5%PEG-CBT溶液和5%SF/2.5%PEG-Cys),然后将所述前体溶液等体积混合均匀后转移到模具中,初步固化成型,再于培养箱内放置30min,通过诱导丝素蛋白缓慢形成β折叠,获得二次固化的双网络水凝胶。将上述双网络水凝胶在流变测试仪上测试本实施例所获双网络水凝胶的储能模量,通过流变结果图3a可以看出,G’>G”且呈线性关系,说明已成凝胶状态,而且G’在7.5KPa左右;将上述双网络水凝胶材料试验机检测本实施例所获双网络水凝胶的拉伸性能,通过拉伸性能结果图3b可以看出,水凝胶的最大拉伸应力约为90kPa,将上述双网络水凝胶材料试验机检测本实施例所获双网络水凝胶的压缩性能,通过压缩性能结果图3c可以看出,将水凝胶压缩至65%时,水凝胶的压缩应力约为0.37MPa。
性能测试三
通过X-射线衍射仪和傅里叶红外光谱仪测试本实施例所获双网络水凝胶的构象结构,其操作方法包括:
将上述双网络水凝胶液氮冷冻,-50℃冷冻干燥24h,采用X-射线粉末衍射仪进行晶体结构分析。使用单色CuKa射线为靶材,电流30mA,电压40kV,扫描速度为0.5°/min,衍射角范围为10°-50°,通过图4a-图4c可以看出2θ=21°和24°附近的吸收峰,代表β-sheet结构。
性能测试四
本实施例所获双网络水凝胶对细胞增殖检测
用钙黄绿素染色法和四唑盐比色法(WST法)来测定本实施例双网络水凝胶中包埋的大鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)的存活和细胞增殖情况,其操作方法包括:
将丝素蛋白溶解于PBS中形成浓度为5w/v%的溶液,随后将丝素蛋白溶液超声(功率240w,超声5s,暂停5s,循环6次),作为溶剂分别溶解苯并噻唑修饰的四臂聚乙二醇和半胱氨酸修饰的四臂聚乙二醇,获得两种前体溶液(5%SF/2.5%PEG-CBT溶液和5%SF/2.5%PEG-Cys),将基础培养基培养的第3-6代BMSC细胞消化、计数、1000rpm离心3min;分别与上述两种前体溶液混合均匀确保细胞浓度为2×106个/mL;取上述共混液各50μL于模具中混合均匀,形成初步固化成型的水凝胶,再于培养箱内放置30min,通过诱导丝素蛋白缓慢形成β折叠,获得二次固化的负载BMSC的双网络水凝胶,细胞与本实施例的双网络水凝胶共混,将该水凝胶转移至24孔板中,加入基础培养基,放入5%CO2、37℃培养箱中培养。
培养1天和7天后后将培养基取出,PBS清洗3次,利用Live/dead试剂盒测定,在激光共聚焦488/561nm激发下观察细胞活性;活细胞被钙黄绿素染色发出绿色荧光,死细胞被染色发出红色荧光。
如图5a和图5b所示,BMSC在本实施例所获光固化水凝胶中存活较好并显示三维结构和明显增殖,表明本发明对细胞增殖无影响且能为细胞提供三维生长环境。
培养1天、3天和7天后将培养基取出,每孔加入450μL新鲜培养基,加入50μL WST-1充分混匀,放入5%CO2、37℃培养箱中孵育4h,取100μL于96孔板中酶标仪450nm处测试OD值。
如图5c所示BMSC与本实施例所获双网络水凝胶共混后,培养1天细胞存活较好,培养7天细胞呈现明显增殖,表明本实施例所获双网络水凝胶毒性低、生物相容性好。
性能测试五
大鼠骨髓间充质干细胞在本实施例所获双网络水凝胶中向软骨细胞分化检测
用RT-PCR检测软骨特异性基因mRNA的表达水平来判断干细胞的是否分化。
第3-6代BMSC细胞分为两组:
第一组将第3-6代BMSC细胞与本实施例所获双网络水凝胶共混后于成软骨分化培养基培养作为对照组;
第二组将第3-6代BMSC细胞于培养瓶中用完全培养基培养作为对照组;
将两组细胞负载的水凝胶放入5%CO2、37℃培养箱中培养,隔天换新鲜培养基,培养28天,弃去培养基,PBS洗3次,在每个时间点通过TRIzol Plus RNA纯化试剂盒从分别负载BMSC的双网络水凝胶中提取总细胞RNA。使用A260/280nm评估RNA的纯度。之后,使用PrimeScriptTM RT试剂盒将500ng RNA逆转录成cDNA。使用SYBR Green I PCR试剂盒RT-PCR检测。将培养皿中没有经过血管分化培养基培养的第3-6代BMSC细胞设为校准品对照,并通过非调节参考基因表达(Gapdh)将目标基因表达标准化。
如图5a-图5c所示,与细胞共混的双网络水凝胶中的干细胞在成软骨分化培养条件下较对照组的干细胞成软骨分化特异性基因II型胶原蛋白(Col II),蛋白聚糖(AGG)和性别决定区Y框蛋白9(Sox 9)的表达有明显的增高,这些结果提示BMSC于本实施例所获双网络水凝胶三维结构上能正常分化,表示本实施例所获双网络水凝胶有非常好的生物相容性和安全性。
对照例1
一般情况下,利用纯的丝素蛋白形成高强度水凝胶时需要借助有机化学试剂,但有机试剂具有细胞毒性,不利于细胞包埋,从而限制了其在生物医学中的应用。
与对照例1相比,本发明实施例1-5所获水凝胶采用简单的物理超声诱导丝素蛋白形成β折叠进而固化形成高强度水凝胶,较上述方法而言,采用物理超声交联形成的水凝胶有更广泛的生物应用,例如,本发明实现与细胞共混凝胶化,较上述三维支架材料更易于细胞包埋。
对照例2
一般情况下,利用纯的丝素蛋白采用简单的物理超声诱导丝素蛋白形成β折叠进而固化形成高强度水凝胶的速度较慢,根据超声的强度,其成胶时间从几十分钟到几小时,甚至数天不等,不利于支架的快速形成以及共混负载细胞,此外纯的丝素蛋白形成的水凝胶内部孔径较小,不利于营养物质以及代谢废物的交换。
与对照例2相比,本发明实施例1-5所获双网络水凝胶,利用生物正交的快速交联得到快速固化的第一重水凝胶网络,进一步通过诱导丝素蛋白β折叠的缓慢形成,构建第二重水凝胶网络,提升水凝胶的性能以满足软骨组织工程需求,形成的双网络水凝胶有更强的力学性能,更适宜的孔径和三维微环境以及生物学应用,例如,本发明结合了单一网络水凝胶的优点构建了即可快速固化又具有较强力学性能的双网络水凝胶,且实现与细胞共混凝胶化,较上述三维支架材料交联速度更快,性能更好。
对照例3
一般情况下,利用单纯的生物正交反应可快速交联形成水凝胶,但形成的水凝胶机械性能较低,从而限制了其在生物医学中的应用。
与对照例3相比,本发明实施例1-5所获双网络水凝胶,利用生物正交的快速交联得到快速固化的第一重水凝胶网络,进一步通过诱导丝素蛋白β折叠的缓慢形成,构建第二重水凝胶网络,提升水凝胶的机械性能以满足软骨组织工程需求,形成的双网络水凝胶有更强的力学性能以及生物学应用,例如,本发明结合了单一网络水凝胶的优点构建了即可快速固化又具有较强力学性能的双网络水凝胶,且实现与细胞共混凝胶化,较上述三维支架材料交联速度更快性能更好。
对照例4
本对照例与实施例1相比,缺少步骤四至步骤六。
一般情况下,采用物理超声诱导丝素蛋白形成β折叠与纯苯并噻唑修饰四臂聚乙二醇复合,生物正交反应无法发生,双网络水凝胶无法形成。
与对照例4相比,本发明实施例1所获双网络水凝胶,利用生物正交的快速交联得到快速固化的第一重水凝胶网络,进一步通过诱导丝素蛋白β折叠的缓慢形成,构建第二重水凝胶网络,提升水凝胶的机械性能以满足软骨组织工程需求,形成的双网络水凝胶有更强的力学性能以及生物学应用,例如,本发明结合了单一网络水凝胶的优点构建了即可快速固化又具有较强力学性能的双网络水凝胶,且实现与细胞共混凝胶化,较上述三维支架材料交联速度更快性能更好。
对照例5
本对照例与实施例1相比,缺少步骤二至步骤三。
一般情况下,采用物理超声诱导丝素蛋白形成β折叠与纯半胱氨酸修饰四臂聚乙二醇复合,生物正交反应无法发生,双网络水凝胶无法形成。
与对照例5相比,本发明实施例1所获双网络水凝胶,利用生物正交的快速交联得到快速固化的第一重水凝胶网络,进一步通过诱导丝素蛋白β折叠的缓慢形成,构建第二重水凝胶网络,提升水凝胶的机械性能以满足软骨组织工程需求,形成的双网络水凝胶有更强的力学性能以及生物学应用,例如,本发明结合了单一网络水凝胶的优点构建了即可快速固化又具有较强力学性能的双网络水凝胶,且实现与细胞共混凝胶化,较上述三维支架材料交联速度更快性能更好。
综上所述,藉由本发明的上述技术方案,本发明的双网络水凝胶的固化时间短、水凝胶内部孔隙分布均匀,生物相容性好、毒性低、可给细胞提供三维生存环境,提高干细胞在三维支架上的粘附和增殖,并且实现向软骨细胞分化;同时制备方法简单,可大量制备。
本发明的各方面、实施例、特征及实例应视为在所有方面为说明性的且不打算限制本发明,本发明的范围仅由权利要求书界定。在不背离所主张的本发明的精神及范围的情况下,所属领域的技术人员将明了其它实施例、修改及使用。
在本发明案中标题及章节的使用不意味着限制本发明;每一章节可应用于本发明的任何方面、实施例或特征。
在本发明案通篇中,在将组合物描述为具有、包含或包括特定组份之处或者在将过程描述为具有、包含或包括特定过程步骤之处,预期本发明教示的组合物也基本上由所叙述组份组成或由所叙述组份组成,且本发明教示的过程也基本上由所叙述过程步骤组成或由所叙述过程步骤组组成。
除非另外具体陈述,否则术语“包含(include、includes、including)”、“具有(have、has或having)”的使用通常应理解为开放式的且不具限制性。
除非另外具体陈述,否则本文中单数的使用包含复数(且反之亦然)。此外,除非上下文另外清楚地规定,否则单数形式“一(a、an)”及“所述(the)”包含复数形式。另外,在术语“约”的使用在量值之前之处,除非另外具体陈述,否则本发明教示还包括特定量值本身。
应理解,各步骤的次序或执行特定动作的次序并非十分重要,只要本发明教示保持可操作即可。此外,可同时进行两个或两个以上步骤或动作。
此外,本案发明人还参照前述实施例,以本说明书述及的其它原料、工艺操作、工艺条件进行了试验,并均获得了较为理想的结果。
尽管已参考说明性实施例描述了本发明,但所属领域的技术人员将理解,在不背离本发明的精神及范围的情况下可做出各种其它改变、省略及/或添加且可用实质等效物替代所述实施例的元件。另外,可在不背离本发明的范围的情况下做出许多修改以使特定情形或材料适应本发明的教示。因此,本文并不打算将本发明限制于用于执行本发明的所揭示特定实施例,而是打算使本发明将包含归属于所附权利要求书的范围内的所有实施例。此外,除非具体陈述,否则术语第一、第二等的任何使用不表示任何次序或重要性,而是使用术语第一、第二等来区分一个元素与另一元素。
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