一种样本afai-desi检测方法及其应用
阅读说明：本技术 一种样本afai-desi检测方法及其应用 (Sample AFAI-DESI detection method and application thereof ) 是由 付艳蕾 季佩佩 杨贤法 胡哲 陆嘉伟 舒烈波 于 2021-09-02 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种样本AFAI-DESI检测方法,包括：将组织样本冰冻切片后获得的样片染色,采用AFAI-DESI进行检测,水平位移速率为0.03-0.05mm/s,垂直位移距离为0.01-0.03mm,雾化气流量为0.65-0.75MPa,喷雾溶剂流速为5.5-6.5μL/min,喷针伸出的长度为0.45-0.55mm,DESI喷针与载玻片之间的夹角为45-55°。本发明进一步提供上述方法在提高空间分辨率的用途。本发明提供的一种样本AFAI-DESI检测方法及其应用,提高了本技术的空间分辨率至20μm,同时保证了代谢物检测灵敏度和覆盖度。(The invention provides a sample AFAI-DESI detection method, which comprises the following steps: staining a sample obtained after the tissue sample is frozen and sliced, and detecting by adopting AFAI-DESI, wherein the horizontal displacement rate is 0.03-0.05mm/s, the vertical displacement distance is 0.01-0.03mm, the atomized gas flow is 0.65-0.75MPa, the flow rate of the atomized solvent is 5.5-6.5 muL/min, the extending length of the spray needle is 0.45-0.55mm, and the included angle between the DESI spray needle and the glass slide is 45-55 degrees. The invention further provides the use of the above method for increasing spatial resolution. The sample AFAI-DESI detection method and the application thereof provided by the invention improve the spatial resolution of the technology to 20 μm, and simultaneously ensure the detection sensitivity and coverage of metabolites.)
技术领域
本发明属于质谱分析的技术领域，涉及一种样本AFAI-DESI检测方法及其应用，具体涉及一种样本AFAI-DESI检测方法及其在小尺寸如微米级样本空间代谢组方面的应用。
背景技术
传统的非靶向代谢组学主要通过组织匀浆的方式对组织中代谢物进行高通量检测，但是组织匀浆会损失样本的空间信息。原位质谱技术通过原位离子化技术对冷冻组织切片中的外源性物质如药物，内源性物质如小分子代谢物、脂质及蛋白质等原位电离后实现质谱分析，通过对数据的解析得到不同物质在组织中的分布特点。原位质谱技术是原位离子化质谱分析技术及组织切片技术的整合。而空间代谢组是基于原位质谱技术和代谢组学数据处理方法发展而来的，由于其前处理简单、免标记、通量高，能同时呈现上千中分子在不同组织器官或组织微区中分布表达情况，因而被广泛应用于肿瘤代谢、药物筛选、疾病诊断、毒理研究等领域。
目前最常用的质谱成像技术有基质辅助激光解析质谱成像技术(Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Mass Spectrometry Imaging，MALDI-MSI)和电喷雾解析电离成像技术(Desorption Electrospray Ionization-Mass SpectrometryImaging，DESI-MSI)。MALDI-MSI最大优势在于空间分辨率高，可以高达5μm，但是也存在需真空中操作，不方便，空间有限，不适合大体积组织样本，需加基质，存在基质效应等缺点；DESI-MSI的优势在于在常压下进行，操作方便，适用于不同分子分析，无需添加基质，但是也存在空间分辨率低、灵敏度不高的缺点。AFAI-DESI质谱成像技术是在DESI-MSI的基础上做了优化，通过增加了离子传输管的距离和空气辅助动力提高了检测的灵敏度，并且适合大体积样本的采集，但是空间分辨率低，目前最优的分辨率仅能达到100μm，不适合精细微区的分辨，如小鼠胚胎、小鼠肾小球等精细组织微区等，很大程度上限定了AFAI-DESI技术在生殖遗传、生长发育、脑神经科学等领域的应用。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种样本AFAI-DESI检测方法及其应用，用于解决现有技术中缺乏保证代谢物检测灵敏度和覆盖度的方法及在微米级小尺寸样本空间代谢组成像分析中提高AFAI-DESI空间分辨率上的应用的问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种样本AFAI-DESI检测方法，包括：将组织样本冰冻切片后获得的样片染色，采用AFAI-DESI进行检测，水平位移速率为0.03-0.05mm/s，垂直位移距离为0.01-0.03mm，雾化气流量为0.65-0.75MPa，喷雾溶剂流速为5.5-6.5μL/min，喷针伸出的长度为0.45-0.55mm，DESI喷针与载玻片之间的夹角为45-55°。
所述AFAI-DESI(Air Flow Assisted Ionization Electrospray desorptionionization)为空气动力辅助离子化解吸电喷雾离子源的质谱成像技术。
优选地，所述组织样本冰冻切片包括：将组织样本冰冻后解冻、固定、切片，粘附于玻片上，获得的样片再进行冰冻保存，待用。
所述样片为粘附有样本切片的玻片。
更优选地，所述冰冻在-85～-75℃超低温冰箱保存。
更优选地，所述解冻在-25～-15℃冰箱过夜解冻。
更优选地，所述固定是在包埋盒底托上添加包埋胶固定组织样本。所述包埋胶完全覆盖组织样本即可。
进一步优选地，所述包埋胶为Cryo-Gel包埋胶(Leica Cryo-Gel EmbeddingMedium,Item No.39475237)。
更优选地，所述切片是将固定后的组织样本经切片机切片。
更优选地，所述切片的厚度为8-20μm。
更优选地，所述玻片为Superfrost Plus正电荷防脱载玻片。
优选地，所述染色包括以下步骤：
1)将样片浸没在甲醇中固定，再浸没在纯水后，再浸没在苏木素中进行第一次染色形成蓝化，然后浸没在盐酸乙醇中分化；
2)将分化后的样片浸没在纯水中水洗后，再浸没在伊红中进行第二次染色，然后浸没在梯度乙醇中脱水，浸没在二甲苯中透化，中性树胶封片。
更优选地，步骤1)中，所述甲醇在-25～-15℃提前预冷，优选为-20℃。
进一步优选地，所述预冷时间为1-2h。
更优选地，步骤1)中，所述甲醇的浸没体积为200-300mL，优选为250mL。
更优选地，步骤1)中，所述切片浸没在甲醇中的固定时间为45-90s，优选为60s。
更优选地，步骤1)中，所述切片浸没在纯水中的时间为8-12s，优选为10s。
更优选地，步骤1)中，所述纯水的浸没体积为200-300mL，优选为250mL。
更优选地，步骤1)中，所述苏木素的浸没体积为200-300mL，优选为250mL。
更优选地，步骤1)中，所述第一次染色的时间为5-7min。
更优选地，步骤1)中，所述盐酸乙醇的浸没体积为200-300mL，优选为250mL。
更优选地，步骤1)中，所述盐酸乙醇为0.5-1％盐酸溶于70％乙醇溶液所得。
所述分化是指将组织样片上过多结合的染色剂脱去。
更优选地，步骤1)中，所述分化的时间为1-3s。
更优选地，步骤2)中，所述纯水中水洗的重复次数为2-3次，每次水洗时间为10-20s，优选为15s。
更优选地，步骤2)中，所述纯水中水洗的浸没体积为200-300mL，优选为250mL。
更优选地，步骤2)中，所述伊红的浸没体积为200-300mL，优选为250mL。
更优选地，步骤2)中，所述第二次染色的时间为10-30s。
更优选地，步骤2)中，所述脱水时，先后依次为100％乙醇、95％乙醇、75％乙醇进行脱水。
上述脱水是利用乙醇的穿透速度很快，对于样片组织会有明显的收缩作用。
所述95％乙醇为体积百分比为95％的乙醇水溶液。所述75％乙醇为体积百分比为75％的乙醇水溶液。
更优选地，步骤2)中，所述脱水中，所述100％乙醇、95％乙醇、75％乙醇的浸没体积分别为200-300mL，优选为250mL。
更优选地，步骤2)中，所述梯度乙醇中脱水的时间均为25-35s，优选为30s。
更优选地，步骤2)中，所述二甲苯的浸没体积为200-300mL，优选为250mL。
更优选地，步骤2)中，所述二甲苯中透化的时间为9-11min，优选为10min。
上述二甲苯透化是利用二甲苯溶解样片的一些脂肪组织。
更优选地，步骤2)中，所述中性树胶为溶解在二甲苯中的天然树胶。
进一步优选地，所述中性树胶为55-65wt％的天然树胶的二甲苯溶液，优选为60wt％的天然树胶的二甲苯溶液。
所述中性树胶完成覆盖样片即可封片。
优选地，所述染色时，所述样片保持潮湿状态。即粘附有样本切片的玻片在整个实验过程中不要干掉。
优选地，所述AFAI-DESI的进行检测时，数据采集用Xcalibur数据采集和处理系统。
优选地，所述AFAI-DESI的检测条件如表1所示，为：喷雾电压为0V；传输管电压为0V；扫描极性为正/负离子模式；毛细管温度为350℃；辅助气温度为0℃；扫描模式为全扫描scan；扫描范围为100-1000Da；分辨率为70000。
表1AFAI离子源及质谱扫描常用参数表
参数
值
喷雾电压
0V
传输管电压
0V
扫描极性
正/负
毛细管温度
350℃
辅助气温度
0
扫描模式
全扫描
扫描范围
100-1000Da
分辨率
70000
优选地，所述AFAI-DESI进行检测时，质谱成像平台采用逐行扫描方式，扫描速度(水平位移速率)为0.035-0.045(Vx，mm/s)，优选为0.04(Vx，mm/s)；相邻两个扫描行之间的步进间距(垂直位移距离)为0.015-0.025(Dy，mm)，优选为0.02(Dy，mm)；每一行扫描结束后的延迟时间为6-8(Dt，ms)，优选为7(Dt，ms)；返回到同一行的扫描起点的速度为9-11mm/s，优选为10mm/s。
上述质谱成像平台进行数据采集时，采用逐行扫描的方式，根据前期确定的组织样片尺寸大小，确定扫描区域的X轴及Y轴，X轴方向设定为扫描速度(Vx，mm/s)，Y轴方向设定为扫描长度(mm)，并在Y轴上设定相邻两个扫描行之间的步进间距。在每一行扫描结束后，为了保持与质谱数据采集的同步，通常需要设定一定的延迟时间(Dt，s)，然后平台快速返回到同一行的扫描起点，以避免对未检测行带来污染和破坏，接着沿Y轴步进设定的位移距离后，再按上述步骤开始下一行的扫描，并循环直至完成所有的样品区域扫描，该扫描方式保证了质谱成像结果的准确性和可靠性。
优选地，所述AFAI-DESI进行检测时，喷雾点状态条件为：雾化气流量为0.69-0.71MPa，优选为0.7MPa；喷雾溶剂流速为5.9-6.1μL/min，优选为6μL/min；喷针伸出的长度d2为0.49-0.51mm，优选为0.5mm。
上述三者可中，雾化气流量越大，雾化效果越好，喷雾溶剂流速越大，对样本萃取解吸的效率也越高，但是会导致雾化效果降低，且高流速会导致液体蔓延，成像效果差等问题，喷针伸出的长度越长，雾化效果越差，因此需要获得优化组合。
优选地，所述AFAI-DESI进行检测时，空间几何参数为：DESI喷针与载玻片之间的夹角α1为49-51°，优选为50°；离子传输管与载玻片之间的夹角α2为14-16°，优选为15°；喷针距离载玻片的垂直距离d1为1.9-2.1mm，优选为2.0mm；喷雾点距离离子传输管的水平距离d3为1-3mm，优选为2mm；离子传输管下缘距离载玻片距离d4为0.98-1.02mm，优选为1mm。
上述AFAI-DESI进行检测时，关键是产生一个聚焦的，同轴排列的喷雾，这由溶剂流、雾化气体流、喷嘴突起、喷嘴到发射器尖端的距离和施加的高电压之间的关系决定。一旦喷雾器参数达到最佳，最终任务是优化几何参数，即喷雾器在表面上方的高度以及喷雾器和入口毛细管之间的距离等。
本发明第二方面提供上述样本AFAI-DESI检测方法在微米级小尺寸样本空间代谢组成像分析中提高空间分辨率上的用途。
优选地，所述样本包括且不限于小鼠眼球组织、小鼠肾脏肾小球组织、小鼠胚胎组织。
优选地，所述样本的空间分辨率≥20μm，具体如20-90μm、20-30μm、30-60μm、60-90μm，优选为20μm。
如上所述，本发明提供的一种样本AFAI-DESI检测方法及其应用，通过优化AFAI-DESI的空间几何参数及位移平台移动速率等参数极大的提高了本技术的空间分辨率至20μm。该种方法同时保证了代谢物检测灵敏度和覆盖度，并将该空间分辨率成功应用于小鼠肾脏肾小球、小鼠胚胎、小鼠眼球等微米级小尺寸样本空间代谢组成像分析，为后续应用于遗传生殖、组织器官发育、脑科学研究等相关研究提供了新方法。
附图说明
图1显示为本发明的小鼠眼球HE染色图。
图2显示为本发明的小鼠眼球切片在不同参数组合下的质谱成像图2a、2b、2c，其中，图2a采用参数组合a；图2b采用参数组合b；图2c采用参数组合c。
图3显示为本发明的小鼠脑组织切片的成像效果图3a、3b、3c、3d，其中，图3a采用组合参数1；图3b采用组合参数3；图3c采用组合参数2；图3d采用组合参数4。
图4显示为本发明的小鼠脑组织切片的采集区域内质谱平均强度比较图4a、4b、4c，其中，图4a采用组合参数1；图4b采用组合参数2；图4c采用组合参数3。
图5a显示为本发明的小鼠眼球HE染色图。
图5b显示为本发明的小鼠眼球20μm分辨率质谱成像图。
图5c显示为本发明的小鼠胚胎结晶紫染色图。
图5d显示为本发明的小鼠胚胎20μm分辨率质谱成像图。
图5e显示为本发明的小鼠肾皮质HE染色图。
图5f显示为本发明的小鼠肾皮质20μm分辨率质谱成像图。
图6a显示为本发明的小鼠眼球20μm分辨率质谱成像的精确图。
图6b显示为本发明的小鼠眼球20μm下代谢物质谱峰检出情况图。
图7a显示为本发明的小鼠胚胎20μm分辨率质谱成像的精确图。
图7b显示为本发明的小鼠胚胎20μm下代谢物质谱峰检出情况图。
图8a显示为本发明的小鼠肾皮质20μm分辨率质谱成像的精确图。
图8b显示为本发明的小鼠肾皮质20μm下代谢物质谱峰检出情况图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐述本发明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
以下实施例使用的试剂和仪器如下：
1、试剂
蒸馏水(屈臣氏)；苏木素、伊红(Sigma)；甲醇、100％乙醇、95％乙醇、75％乙醇、二甲苯(麦克林)；盐酸乙醇(阿拉丁)；乙腈(赛默飞)；Cryo-Gel包埋胶(Leica Cryo-GelEmbedding Medium,Item No.39475237)。
小鼠肾脏、小鼠眼球、小鼠胚胎取材于中国科学院上海实验动物中心。
2、仪器
AFAI-DESI质谱成像仪[维科托(北京)科技有限公司]；包埋盒(江苏世泰实验器材有限公司)。
实施例1
1、样本处理
将组织样本在-80℃超低温冰箱冰冻后取出，置于-20℃冰箱过夜解冻。在包埋盒底托上添加Cryo-Gel包埋胶，Cryo-Gel包埋胶完全覆盖组织样本以固定解冻后的组织样本。将固定的组织样本采用切片机切片，粘附固定于Superfrost Plus正电荷防脱载玻片上，获得样片1#。切片的厚度为14μm。再将样片1#再放入-80℃超低温冰箱中冰冻保存，供后续成像分析使用。
然后，将样片1#浸没在-20℃提前预冷2h的250mL甲醇中固定60s，再浸没在250mL纯水中10s，再浸没在250mL苏木素中进行第一次染色6min形成蓝化，再浸没在250mL盐酸乙醇中分化2s。将分化后的样片1#分别浸没在250mL纯水中重复水洗2次，每次水洗时间为15s。再浸没在250mL伊红中进行第二次染色20s，先后依次浸没在250mL 100％乙醇、250mL95％乙醇、250mL75％乙醇进行梯度乙醇脱水，浸没在250mL二甲苯中透化，采用60wt％的天然树胶的二甲苯溶液作为中性树胶覆盖样片进行封片，获得待测样品1#。
2、仪器检测
将待测样品1#采用AFAI-DESI进行检测，AFAI-DESI的检测条件如表1所示，数据采集用Xcalibur数据采集和处理系统。
AFAI-DESI进行检测时，质谱成像平台采用逐行扫描方式，扫描速度(水平位移速率)为0.04(Vx，mm/s)；相邻两个扫描行之间的步进间距(垂直位移距离)为0.02(Dy，mm)；每一行扫描结束后的延迟时间为为7(Dt，ms)；返回到同一行的扫描起点的速度为10mm/s。
喷雾点状态条件为：雾化气流量为0.7MPa；喷雾溶剂流速为6μL/min；喷针伸出的长度d2为0.5mm。
空间几何参数为：DESI喷针与载玻片之间的夹角α1为50°；离子传输管与载玻片之间的夹角α2为15°；喷针距离载玻片的垂直距离d1为2.0mm；喷雾点距离离子传输管的水平距离d3为2mm；离子传输管下缘距离载玻片距离d4为1mm。
实施例2
将小鼠眼球按实施例1中步骤1进行样本处理，获得如图1所示进行染色的小鼠眼球切片样品。
再将小鼠眼球切片样品按实施例1中步骤2进行AFAI-DESI检测，其中，扫描速度(水平位移速率)与相邻两个扫描行之间的步进间距(垂直位移距离)2个参数设置参数组合a、b、c，具体数值见表2。具体不同参数组合下的质谱成像图见图2。
表2
参数
参数组合a
参数组合b
参数组合c
X轴扫描速度(Vx，mm/s)
0.08
0.04
0.02
Y轴步进间距(Dy，mm)
0.04
0.02
0.01
由图2a、2b、2c中可知，在参数组合b下可以精细的区分组织微区在20μm左右的，参数组合a相较于b的成像图轮廓更宽，而组合c下的成像图存在明显的横条纹，且组织区域也不清楚，因此在参数组合b，即X轴扫描速度为0.04mm/s，Y轴步进间距(Dy，mm)为0.02mm时，能实现空间分辨率为20μm。
实施例3
将小鼠脑组织按实施例1中步骤1进行样本处理，获得小鼠脑组织切片样品。
再将小鼠脑组织切片样品按实施例1中步骤2进行AFAI-DESI检测，其中，分别设置组合参数1、组合参数2、组合参数3、组合参数4。具体不同参数组合下的质谱成像图见图3。
由图3a、3b、3c、3d中可知，采用组合参数1(雾化气流量为0.7MPa，喷雾溶剂流速为6μL/min，喷针伸出长度d2为0.5mm，喷针水平夹角为50°，喷针距离载玻片垂直距离为2mm)，脑组织切片的成像效果达到最佳状态。采用组合参数2(雾化气流量为0.6MPa、喷针伸出的长度高于1mm或者喷雾溶剂流速高于6μL/min，喷针水平夹角为50°，喷针距离载玻片垂直距离为2mm)，容易出现雾化不完全的情况，导致溶剂扩散，组织微区界限不明。采用组合参数3(雾化气流量0.8MPa，喷雾溶剂流速为3μL/min，喷针伸出长度d2为0.5mm，喷针水平夹角为50°，喷针距离载玻片垂直距离为2mm)，容易导致代谢物解吸效率低，灵敏度下降。采用组合参数4(雾化气流量0.7MPa，喷雾溶剂流速为6μL/min，喷针伸出长度d2为0.5mm，喷针水平夹角过大(＞50°)或者过小(＜35°)，喷针距离载玻片垂直距离为2mm)，容易出现条纹状的成像图。
同时，不同参数组合下胆碱(m/z，104.1072)的质谱平均强度(丰度)比较见图4。由图4a、4b、4c中可知，采用组合参数1的灵敏度明显优于组合参数2和组合参数3。
另外，不同参数组合下比较胆碱(m/z，104.1072)的质谱峰数量，具体结果见表3。由表3可知，采用组合参数1的覆盖度也明显优于组合参数2和3。可见，采用组合参数1，胆碱丰度最高，质谱峰数量最多，在该状态下，AFAI-DESI在实现空间高分辨率的同时，能保障质谱成像效果且代谢物检测的覆盖度广。
表3不同组合参数下扫描区域内质谱峰数量
组合参数1
组合参数2
组合参数3
质谱峰数量
27632
20350
10896
实施例4
将小鼠眼球、小鼠胚胎、小鼠肾脏三类微米级小尺寸样本进行空间代谢组学分析，按实施例1中步骤1进行样本处理，获得组织切片样品。小鼠眼球、小鼠胚胎、小鼠肾脏的染色图分别见图5a、5c、5e。
再将组织切片样品按实施例1中步骤2进行AFAI-DESI检测，具体质谱成像图见图5b、5d、5f。成像结果显示，该方法能对微米级组织微区进行很好的分辨，分辨率可达20μm，且能保证检测的灵敏度，能同时检测到上万质谱峰。
小鼠眼球、小鼠胚胎、小鼠肾脏三类微米级小尺寸样本在20μm分辨率检测到的代谢物情况见表4、图6a、6b、7a、7b、8a、8b。
表4组织切片质谱峰检出情况
小鼠眼球
小鼠胚胎
小鼠肾皮质
质谱峰数量
14035
20440
25034
可见，当位移平台速率优化至水平位移速率为0.04mm/s，垂直位移距离为0.02mm，且几何参数优化至喷雾溶剂流量为6μL/min，雾化气压力为0.7MPa，喷针伸出长度为0.5mm，喷针水平夹角为50°时，AFAI-DESI空间分辨率可以高达20μm，且同时保证了代谢物检测灵敏度和覆盖度，并将该空间分辨率成功应用于小鼠肾脏肾小球、小鼠胚胎、小鼠眼球等微米级小尺寸样本空间代谢组成像分析，为后续应用于遗传生殖、组织器官发育、脑科学研究等相关研究提供了新方法。
综上所述，本发明提供的一种样本AFAI-DESI检测方法及其应用，提高了本技术的空间分辨率至20μm，同时保证了代谢物检测灵敏度和覆盖度。所以，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。