具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本公开。应理解，这些实施例仅用于说明本公开而不用于限制本公开的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。本发明所使用的试剂或原料均可通过常规途径购买获得，如无特殊说明，本发明所使用的试剂或原料均按照本领域常规方式使用或者按照产品说明书使用。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本公开的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。

目前，类氧化酶应用在电化学生物传感器中的相关研究却很少。同时，现有的对UDG的检测，往往需要天然酶参与其中，用来放大信号，提高灵敏度，但天然酶也带来了新的问题，如成本高和稳定性差。因此，本公开提供了一种UDG检测用电化学生物传感器及其检测方法。

在本公开的一种实施方式中，一种UDG检测用电化学生物传感器，包括：以负载有金纳米颗粒的空心Mn/Ni层状双金属氢氧化物与DNA1、发卡DNA共同孵育得到。空心Mn/Ni层状双金属氢氧化物具有更大的比表面积，再加上多孔以及可渗透的外壳，不仅使空心材料暴露出更多的表面活性位点，避免了大量的无效空间，而且还减少了物质和电子的传输长度，从而进一步大幅度提高其催化活性，将其用于电化学生物传感器检测UDG，极大的提高了检测灵敏度。

其中，金纳米颗粒(AuNPs)修饰在h-Mn/Ni LDHs上，不仅成为后续DNA的连接点，而且有效地提高了整个材料的导电性。

在本公开的一种实施方式中，所述空心Mn/Ni层状双金属氢氧化物的制备方法包括：将SiO₂、溴酸钾、丙烯酰胺、NiCl₂·6H₂O、MnCl₂·4H₂O密封在高压反应釜中，高温反应得到SiO₂@Mn/Ni LDHs；然后，将SiO₂@Mn/Ni LDHs分散在强碱溶液中，刻蚀反应得到空心Mn/Ni层状双金属氢氧化物；或，所述高温反应的温度为120-160℃，优选的，为140℃；反应时间为8-13h，优选的，为10h。控制好反应的温度和时间，对于获得导电性更高的空心Mn/Ni层状双金属氢氧化物具有一定的影响。在刻蚀过程中，如果刻蚀时间较长，会导致结构破裂，不利于获得性能更高的电化学传感器。

在本公开的一种实施方式中，负载金纳米颗粒的方法包括：将半胱胺溶液加入到HAuCl₄溶液中，然后将NaBH₄加入上述混合物中，在室温下搅拌反应获得带正电的金纳米颗粒；将空心Mn/Ni层状双金属氢氧化物分散在水中，加入带正电的金纳米颗粒，在室温下搅拌即得h-Mn/Ni [email protected]。

通过获得带正电的金纳米颗粒，有助于提高导电性，并且可以作为连接点，有助于构建灵敏度更高的电化学传感器。AuNPs呈现出均匀的球形结构，均匀地分散在h-Mn/NiLDHs的表面，并且外壳结构保留完好。

在本公开的一种实施方式中，DNA1由5′到3′的序列为SH-AGAATT GTACTT AAACACCTT；或，发卡DNA由5′到3′的序列为SH-TTT TTG CUG UCU GUG AAG GAG GTAGAT CACAGACAG C。

在本公开的一种实施方式中，所述孵育包括：将发卡DNA(hDNA)热处理、冷却形成发卡结构，然后与DNA1、三(2-羧乙基)膦进行孵育；孵育完成后，加入h-Mn/Ni [email protected]分散液，继续孵育得到h-Mn/Ni [email protected]/DNA1。

其中，hDNA和DNA1的体积比为1-5:1-5；优选的，在3:4的比例下，电流达到最大值。因此，3:4是h-Mn/Ni [email protected]/DNA1探针的最佳比例。

在本公开的一种实施方式中，一种UDG检测系统，包括任一所述的UDG检测用电化学生物传感器和电极。其中，所述电极表面依次修饰有金纳米颗粒、cDNA和MCH，命名为MCH/cDNA/AuNPs/GCE电极；所述cDNA由5′到3′的序列为SH-GCT GTC TGT GA。

在AuNPs被修饰到GCE上后，由于AuNPs的良好导电性，能够提高电极的灵敏度。当cDNA通过Au-S键连接到AuNPs/GCE上时，由于带负电荷的DNA排斥[Fe(CN)₆]^3-/4-探针，氧化还原峰下降。由于MCH的导电性差，用MCH封端cDNA/AuNPs/GCE后，电流峰值下降。然而，当MCH/cDNA/AuNPs/GCE与h-Mn/Ni [email protected]/DNA1在1U mL^-1UDG存在下孵育时，电流强度增加，反映了h-Mn/Ni [email protected]/DNA1探针上的AuNPs提高了电子转移能力。

在本公开的一种实施方式中，所述检测系统还包括h-Mn/Ni [email protected]和h-Mn/Ni [email protected]；或，所述DNA2由5′到3′的序列为SH-AAG GTG TTT AAG TAC AAT TCT；

或，所述h-Mn/Ni [email protected]的制备方法包括：将DNA1、三(2-羧乙基)膦进行孵育；再加入h-Mn/Ni [email protected]分散液孵育即得；

或，所述h-Mn/Ni [email protected]的制备方法包括：将DNA2、三(2-羧乙基)膦进行孵育；再加入h-Mn/Ni [email protected]分散液孵育即得。

在本公开的一种实施方式中，一种UDG检测方法，将任一所述的UDG检测用电化学生物传感器与不同浓度的UDG孵育，孵育完成后，滴加到MCH/cDNA/AuNPs/GCE电极表面，进行杂交；进行电化学响应表征测试，根据峰电流值和工作曲线确定UDG浓度。

在没有UDG的情况下，电化学信号峰可以忽略不计。hDNA茎部的四个尿嘧啶碱基可以被UDG特异性地识别和去除，形成AP位点，从而导致发夹结构展开为单链DNA。随后，将展开的hDNA与cDNA杂交，并将h-Mn/Ni [email protected]/DNA1探针连接到电极上。h-Mn/Ni LDHs可以有效地催化OPD氧化成DAP，作为一个可检测的电化学指示剂。

或，所述检测方法还包括：杂交后，再将h-Mn/Ni [email protected]滴加到电极上，孵育完成后，再将h-Mn/Ni [email protected]修饰到电极上，继续孵育、冲洗；再进行检测。

依次用h-Mn/Ni [email protected]和h-Mn/Ni [email protected]孵育后，DPV峰电流进一步增加到-9.22μA和-12.80μA，表明通过重复的DNA1-DNA2杂交形成h-Mn/Ni LDHs-DNA树枝状物，大大增强了催化材料的负载量，放大了电化学信号。上述结果证实，该电化学生物传感器在检测UDG方面的策略是可行的。

其中，随着UDG孵育时间从15到60分钟的增加，DPV反应明显增加，当时间延长到90分钟时，增加的速度减慢。因此，UDG孵育时间为15-100min，优选的，为75min。

在本公开的一种实施方式中，任一所述的UDG检测用电化学生物传感器和/或任一所述的UDG检测系统和/或所述的UDG检测方法在抑制剂筛选中的应用。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本公开的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本公开的技术方案。

实施例1

1.1合成SiO₂@Mn/Ni LDHs和空心Mn/Ni LDHs(h-Mn/Ni LDHs)

首先，通过传统的法合成SiO₂纳米颗粒：在异丙醇(140mL)中依次加入正硅酸乙酯(5mL)、超纯水(11.6mL)和氨水(4.4mL),得到的液体混合物在室温下搅拌五个小时，通过离心分离，乙醇洗涤，在80℃下干燥12小时，得到SiO₂固体。

SiO₂@Mn/Ni LDHs的合成：在18mL超纯水中加入SiO₂纳米颗粒(80mg)、溴酸钾(0.9g，5.39mM),丙烯酰胺(0.8g，11.25mM)、NiCl₂·6H₂O(0.12g，0.5mM)和MnCl₂·4H₂O(0.02g，0.1mM),室温搅拌1小时，密封在高压反应釜中，140℃反应10h，离心后用水清洗，80℃下干燥过夜，得到SiO₂@Mn/Ni LDHs。

为了制备中空的Mn/Ni LDHs，将SiO₂@Mn/Ni LDHs(30mg)分散在30mL氢氧化钠溶液(50mM)中，加热至50℃，反应7h以刻蚀SiO₂纳米颗粒，最后通过离心收集沉淀物，加水洗涤，80℃下干燥过夜。

1.2类氧化酶性能测试

通过考察材料对3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)，2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)和邻苯二胺(OPD)的催化氧化能力，来分析材料的类氧化酶性能。步骤如下：将200μL材料分散液(250μg/mL)加入到1.8mL含有0.5mM TMB或ABTS或OPD的醋酸缓冲液(pH 3.5)中，整个体系在室温下反应5分钟，并进一步进行紫外光谱测量。

1.3制备带正电的AuNPs，h-Mn/Ni [email protected]，h-Mn/Ni [email protected]/DNA1,h-Mn/[email protected] and h-Mn/Ni [email protected]

首先将400μL的半胱胺溶液(213mM)加入到HAuCl₄溶液(40mL,1.42mM)中,搅拌20min，然后将10μL NaBH₄(10mM)加入上述混合物中，在室温先剧烈搅拌25分钟，当溶液的颜色从微弱的黄色变成酒红色时，则带正电的AuNPs形成了。

将h-Mn/Ni LDHs(10mg)分散在10mL超纯水中，加入2.5mL带正电的AuNPs，在室温下搅拌12h，离心用水洗涤，将沉淀物在烘箱中干燥，便得到h-Mn/Ni [email protected]。

将30μL的发卡DNA(hDNA,10μM)热处理5min，冷却至室温以形成发卡结构。之后将hDNA和DNA1与三(2-羧乙基)膦(TCEP)孵育1h，断开二硫键。然后将hDNA和DNA1加入h-Mn/[email protected]分散液(0.8mL,1mg/mL),在室温下孵育过夜，离心，用10mM Tris-HCl缓冲液(pH7.4)洗涤三次，最后将得到的h-Mn/Ni [email protected]/DNA1重新分散在Tris-HCl(10mM，pH7.4)中，并储存在4℃以备下一步使用。

关于h-Mn/Ni [email protected]和h-Mn/Ni [email protected]的制备，与上述步骤类似，将DNA1(80μL,10μM)与DNA2(80μL,10μM)分别代替hDNA/DNA1。

1.4制备电极MCH/cDNA/AuNPs/GCE

将玻碳电极(GCE)先后用1.0μm、0.5μm以及50nm的Al₂O₃粉末打磨，然后用水-乙醇-水进行超声处理，每次5min，以获得一个光亮的表面。然后将10μL的AuNPs滴在电极上自然晾干，接下来，将电极与10μL的cDNA(1μM)在4℃下孵育12h，用Tris-HCl(10mM，pH 7.4)清洗电极以除去非特异性吸附的DNA，再用巯基己醇(MCH，1mM)封端1h，从而得到电极MCH/cDNA/AuNPs/GCE.

1.5UDG活性以及其抑制剂(UGI)的检测

为了检测UDG活性，将10μL h-Mn/Ni [email protected]/DNA1与不同浓度的UDG在37℃下孵育75min，然后滴在MCH/cDNA/AuNPs/GCE电极表面，室温杂交1h，随后将10μL h-Mn/[email protected]滴在电极上，再孵育1h，之后，如上一步，将10μLh-Mn/Ni [email protected]修饰到电极上，在上述每个修饰步骤之后，都需要用Tris-HCl(10mM，pH 7.4)清洗电极。最后，将构筑的生物传感器放在含有10mM OPD的0.1MPBS缓冲液(4mL,pH 3.5)中进行DPV测试，电压范围为-0.2至-0.6V，振幅为50mV,脉冲周期为50ms。具体基于h-Mn/Ni LDHs构建的信号增强的电化学传感器用于UDG检测的示意图如图1所示。

此外，还对UDG的抑制剂进行测试，在h-Mn/Ni [email protected]/DNA1探针与UDG孵育之前，先将UDG(1U mL^-1)与不同浓度的UGI在37℃下孵育30min，后续操作与上述UDG的检测过程相同。

结果与讨论：

首先，合成了SiO₂纳米颗粒作为牺牲模板，如TEM(图2A)所示，合成的SiO₂纳米颗粒表面光滑，平均尺寸约为287nm。通过混合金属盐溶液的水热反应，在SiO₂纳米颗粒表面上制备了片状的Mn/Ni LDHs。TEM图像显示SiO₂@h-Mn/Ni LDHs为核壳结构(图2B),在SiO₂纳米颗粒的光滑表面包裹着一层粗糙的外壳。进一步观察SEM图像发现，SiO₂@h-Mn/Ni LDHs的表面呈现出花状的分层结构(图2C)，壳是由无序的超薄纳米片组成。通过EDX分析验证了Ni、Mn、O和Si元素的存在，并且Mn/Ni的原子比为1:3.6(图2D)。此外，通过XRD研究了SiO₂@h-Mn/Ni LDHs的结构信息(图2E)。与SiO₂纳米颗粒相比，SiO₂@h-Mn/Ni LDHs在11.46°、23.78°、35.75°和59.97°处出现了新的衍射峰，分别对应LDH的(003)、(006)、(012)和(110)晶面，与其他文献报道的相吻合。从上述结果中我们可以得出结论，Mn²⁺和Ni²⁺以纳米片状的形态共沉淀在单个SiO₂纳米颗粒的表面形成了核壳结构。

接下来，通过用NaOH溶液蚀刻SiO₂@Mn/Ni LDHs得到h-Mn/Ni LDHs。如图2F所示，样品具有中空结构，内部的SiO₂纳米颗粒消失了，而Mn/Ni LDHs外壳保持完整，厚度约为50nm。从XRD图谱(图2E)来看，Mn/Ni LDHs外壳的衍射峰与SiO₂@Mn/Ni LDHs的衍射峰完全一致，表明刻蚀没有破坏LDHs结构。正因为随机堆积的片状和中空的结构，h-Mn/Ni LDHs的比表面积大大增加，有利于底物的扩散，进一步与活性位点反应，使得该材料具有优异的催化性能。为了给后续的DNA连接提供连接点，并有效地提高整个材料的导电性，我们合成了带正电的AuNPs，并负载到h-Mn/Ni LDHs上，形成纳米复合材料(h-Mn/Ni [email protected])。如图2G所示，AuNPs呈现出均匀的球形结构，平均尺寸为17nm。正如预期的那样，AuNPs均匀地分散在h-Mn/Ni LDHs的表面，并且外壳结构保留完好(图2H)。该结果通过zeta电位(图2I)的测量得到进一步证明。h-Mn/Ni LDHs的zeta电位被测量为-36.5±0.5mV。在负载AuNPs后，由于其与带正电荷的AuNPs的静电作用，h-Mn/Ni [email protected]的zeta电位降低到-20.4±0.6mV。上述结果表明，AuNPs被成功地修饰在h-Mn/Ni LDHs上，不仅成为后续DNA的连接点，而且有效地提高了整个材料的导电性。

通过使用TMB、ABTS和OPD作为酶底物，评估h-Mn/Ni LDHs的类氧化酶活性(图3)。从图3A可以清楚地看到，h-Mn/Ni LDHs催化TMB氧化产生了深蓝色产物，并在652nm处显示出最大的吸光峰(曲线c)，然而，SiO₂@Mn/Ni LDHs表现出弱的催化活性(曲线b)，这是由于h-Mn/Ni LDHs独特的中空结构和可渗透的外壳，这样的结构不仅允许小分子从壳外自由扩散到内腔，而且暴露出更多的活性位点，从而提高整个材料的催化活性。在ABTS和OPD体系中，出现了同样的结果(图3B和C)。基于上述结果，可以得出结论h-Mn/Ni LDHs具有优良的类氧化酶活性。氧化过程的机制是由于h-Mn/Ni LDHs对溶解的O₂有很好的催化活化作用，可以产生超氧负离子(O₂ ^·-)，进而氧化无色的氧化酶底物，形成有色的产物

除了比色法之外，我们还进行了电化学实验来评估h-Mn/Ni LDHs的类氧化酶活性，结果如图3D所示。在没有催化剂的情况下，裸露的GCE没有显示出氧化还原峰。而在SiO₂@Mn/Ni LDHs修饰的GCE中，在-0.5V附近观察到一个明显的还原峰，这个峰是由于Mn/Ni LDHs对OPD的催化氧化作用。与比色法结果一致，当h-Mn/Ni LDHs被固定在GCE上时，与SiO₂@Mn/Ni LDHs相比，还原峰电流增加到约两倍，这再次证明h-Mn/Ni LDHs具有出色的类氧化酶活性。

生物传感器的逐步构建过程通过电化学分析(包括在每个修饰阶段的CV和EIS)进行了表征。在图4A中，裸露的GCE显示了一对明显的[Fe(CN)₆]^3-/4-的氧化还原峰(曲线a)。在AuNPs被修饰到GCE上后，由于AuNPs的良好导电性，观察到氧化还原峰电流的明显增加(曲线b)。当cDNA通过Au-S键连接到AuNPs/GCE上时，由于带负电荷的DNA排斥[Fe(CN)₆]^3-/4-探针，氧化还原峰下降(曲线c)。由于MCH的导电性差，用MCH封端cDNA/AuNPs/GCE后，电流峰值下降(曲线d)。然而，当MCH/cDNA/AuNPs/GCE与h-Mn/Ni [email protected]/DNA1在1U mL^-1UDG存在下孵育时，电流强度增加(曲线e)，反映了h-Mn/Ni [email protected]/DNA1探针上的AuNPs提高了电子转移能力。当h-Mn/Ni [email protected](曲线f)和h-Mn/Ni [email protected](曲线g)先后被捕获在电极上时，探针的位阻效应阻碍了[Fe(CN)₆]^3-/4-向电极界面的扩散，导致电流进一步逐渐下降。

在CV测量之后，EIS也被用来验证电化学生物传感器的构建过程。Ret代表电极界面的电子转移电阻，它可以通过Nyquist图的半圆直径来确定。作为氧化还原电流的倒数参数，Ret的变化趋势与氧化还原电流的变化趋势完全相反(图4B)。CV和EIS的结果相吻合，都表明每个步骤都在电极表面成功修饰。

生物传感器检测UDG的可行性通过DPV测量得到了验证，DPV测量是在含有10mMOPD的0.1M PBS(pH 3.5)中进行的。如图5B所示，在没有UDG的情况下，电化学信号峰可以忽略不计(曲线a)。在这个过程中，没有催化材料连接到电极上，这是低背景信号的主要原因。另一个原因是没有H₂O₂，导致背景信号的进一步降低。如图5A所示，与没有H₂O₂(黑色曲线)相比，当H₂O₂被添加到电解质溶液中(红色曲线)，OPD的氧化速度将被加速，导致峰值电流增加。对于在OPD氧化体系用于构建传感器的类过氧化物酶材料，H₂O₂是不可或缺的。然而，在类氧化酶材料的情况下，没有H₂O₂的参与也能完成催化过程，这就有效地降低了背景信号，提高了生物传感器的灵敏度。

当h-Mn/Ni [email protected]/DNA1探针与UDG(1U mL^-1)反应时，在-0.45V处观察到一个中等还原峰，峰值为-5.91μA(曲线b)，这归因于DAP(2,3-二氨基吩嗪，OPD的氧化产物)的还原。这个过程的机理是，hDNA茎部的四个尿嘧啶碱基可以被UDG特异性地识别和去除，形成AP位点，从而导致发夹结构展开为单链DNA。随后，将展开的hDNA与cDNA杂交，并将h-Mn/Ni [email protected]/DNA1探针连接到电极上。h-Mn/Ni LDHs可以有效地催化OPD氧化成DAP，作为一个可检测的电化学指示剂。依次用h-Mn/Ni [email protected](曲线c)和h-Mn/Ni [email protected](曲线d)孵育后，DPV峰电流进一步增加到-9.22μA和-12.80μA，表明通过重复的DNA1-DNA2杂交形成h-Mn/Ni LDHs-DNA树枝状物，大大增强了催化材料的负载量，放大了电化学信号。上述结果证实，我们提出的生物传感器在检测UDG方面的策略是可行的。

为了获得UDG生物传感器的最佳检测性能，系统地研究了关键的实验参数，如UDG孵育时间、h-Mn/Ni [email protected]/DNA1探针的hDNA和DNA1的剂量比以及电解质溶液的pH。在图6A中，随着UDG孵育时间从15到60分钟的增加，DPV反应明显增加，当时间延长到90分钟时，增加的速度减慢。为了保证UDG和hDNA之间的充分反应并节省实验时间，我们选择75分钟作为最佳孵化时间。此外，对hDNA(10μM)和DNA1(10μM)的不同体积比(1：4，1：2，3：4，1：1，1.5：1)进行了优化(图6B)。随着剂量比的增加，DPV电流首先增加，然后减少。在3:4的比例下，电流达到最大值。因此，3:4是h-Mn/Ni [email protected]/DNA1探针的最佳比例。图6C显示了从2.5到7.5的不同pH值的电解质溶液对峰值电流的影响。峰值电流从2.5到3.5上升，随后随着pH值的增加而明显下降。原因是h-Mn/Ni LDHs的氧化酶活性在酸性条件下更强。因此，电解质溶液的最佳pH值为3.5。

在优化后的实验条件下，构建的生物传感器的分析性能通过UDG的定量检测进行了评估。从图7A中可以看出，与空白样品(曲线a)相比，随着UDG浓度的增加，还原峰电流也在增加(曲线b至k)。这是因为UDG越多，越多的h-Mn/Ni LDHs被连接到GCE表面，这导致电解质溶液中更多的OPD被氧化。根据图5B，在-0.45V的还原峰电流和UDG浓度的对数在0.001-1U mL^-1的范围内有良好的线性关系。回归方程为I(μA)＝-3.13lg C-12.39(R²＝0.9952)。此外，通过计算空白对照的平均响应加上3倍的标准偏差，计算出检测极限(LOD)为4.8×10^-4U mL^-1。与报道的UDG检测相比，构建的生物传感器表现出较低的检测限。其优越性能可归因于以下三个方面。(i)中空结构和双金属的协同作用使h-Mn/Ni LDHs具有优异的催化活性；(ii)h-Mn/Ni LDHs具有类氧化酶的催化活性，无需添加H₂O₂即可催化OPD的氧化，大大降低了背景信号；(iii)自连接过程增加了h-Mn/Ni LDHs的负载量，使电化学信号级联放大。

研究显示，UDG抑制剂可以作为化疗药物来治疗一些疾病，如癌症和艾滋病。因此，筛选UDG抑制剂也是非常重要的。为了评估所设计的生物传感器的筛选能力，接下来将UGI作为UDG的模型抑制剂加入到UDG检测系统中。UGI可以与UDG形成1:1的紧密复合物来抑制UDG的活性。结果发现，增加UGI的浓度会导致峰值电流明显下降(图7C)。当UGI的浓度达到1U mL^-1时，UDG的活性几乎被完全抑制。IC50值被进一步确定为约0.44U mL^-1，它代表了抑制酶的50％活性所需的抑制剂浓度。因此，我们的生物传感器有望成为筛选UDG抑制剂的一个有用工具。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东大学

<120> 一种UDG检测用电化学生物传感器及其检测方法

<130> 202125617

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 未知

<400> 1

agaattgtac ttaaacacct t 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 未知

<400> 2

aaggtgttta agtacaattc t 21

<210> 3

<211> 33

<212> DNA

<213> 未知

<400> 3

tttttgcgcg gaaggaggta gatcacagac agc 33

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 未知

<400> 4

aaggtgttta agtacaattc t 21