具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。需要说明的是，以下实施例中所提供的图示仅以示意方式说明本发明的基本构想，在不冲突的情况下，以下实施例及实施例中的特征可以相互组合。

实施例1

一种新的示差库仑法对水环境进行毒性预警，流程如图1所示，首先在待测水样中添加乙酸钠药剂，以达到样品中BOM充足的目的。选用乙酸钠作为添加药剂一方面是因为乙酸钠容易被阳极生物膜降解代谢，使阳极上微生物的酶利用率能够迅速达到饱和；另一方面是因为相比其它种类的BOM，乙酸钠不容易与毒性物质产生络合沉淀，这样可以保证水体毒性预警的准确度。

1、根据米氏方程可知(公式1.1)，当基质浓度超过一定浓度时，微生物中酶的利用率可以达到100％，有机物的浓度不再是影响其降解速率的因素。

其中V₀为反应速度，mg/min；K_m为米氏常数；[S]为底物浓度，mg/L；V_max为最大降解速率，mg/min。

因此，当样品中BOM的含量充足时，在MFC传感器检测过程中一定存在一段时间，电压信号不随BOM浓度的波动变化。因此可以借助BOM的含量充足这段时间的库仑量信号来检测水样中的毒性物质，避免BOM对信号的干扰。

2、MFC传感器的启动及微生物特征

采用以碳布(其中该碳布在长期运行的乙酸钠基质培养的大电池中培养一个月以上)为阳极材料、空气阴极碳布材料(包含基底层碳布和分别涂刷在所述基底层的防水层和催化层，所述防水层为塑性剂和粘合剂的混合物，所述催化层Pt/C，其中Pt和C的质量比为2︰8)为阴极材料的MFC传感器，随后转移到测试电池中，采用BOD₅值为200mg/L的乙酸钠培养液进行MFC传感器的启动，图2为MFC传感器在培养启动阶段的电压采集曲线，每24h更换一次营养液。培养8天后，观察到连续三个测试周期的库仑收集量误差在1％以内，表明阳极微生物达到稳定状态。培养稳定时最大电压达到559.85mV，稳定维护周期收集到的库仑量为18.22C。

图3为培养稳定后阳极表面微生物群落属类的相对丰度，测得前10种菌属中产电菌包括：地杆菌属(Geobacter，39.02％)、金黄色杆菌属(Chryseobacterium，12.03％)、水微菌属(Aquamicrobium，3.31％)、假单胞菌属(Pseudomonas，2.36％)，产电菌的占比高达56.72％以上。除此之外，阳极生物膜还包括其它杂菌如脱氯菌属(Dechlorosoma，5.07％)、脱氮菌属(Ignavibacterium，4.41％)、固氮螺菌属(Azospirillum，3.23％)、戈登氏菌属(Gordonia，2.02％)、军团菌属(Legionella，2.03％)，占比为16.76％。这表明阳极上微生物的优势菌为产电菌，其它菌属多为厌氧发酵菌。发酵菌可以将较大的有机物降解为较小的有机物，然后被产电菌完全降解发电，一定比例的厌氧发酵菌有助于有机物的降解以及产电。

图4为培养稳定后阳极表面微生物的SEM图，从图中可以明显看到在阳极碳布表面附着一层微生物，菌种紧密，并且多为杆状微生物。结合图4分析可知，杆状微生物多为阳极生物膜的优势菌种地杆菌属。图5为培养稳定后阳极表面微生物CLSM图，可以看到生物膜中活细胞的占比较多，还存在少部分老化失去活性的细胞，失去活性的细胞仍具有一定的电子传递能力。

综上所述，实验培养出电化学活性稳定的MFC传感器，可用于水体毒性预警。

实施例2

采用示差库仑法进行水环境的毒性预警，具体方法为：

(1)准备MFC传感器：以碳布(其中该碳布在长期运行的乙酸钠基质培养的大电池中培养一个月以上)为阳极材料、空气阴极碳布材料(包含基底层碳布和分别涂刷在所述基底层的防水层和催化层，所述防水层为塑性剂和粘合剂的混合物，所述催化层Pt/C，其中Pt和C的质量比为2︰8)为阴极材料；

(2)向待测水样中加入乙酸钠至水样中乙酸钠的浓度为384.6mg/L，相应标准品BOD₅值分别为200mg/L，然后将MFC传感器置于含有乙酸钠的待测水样中，采集加入含有乙酸钠的待测水样前和加入含有乙酸钠的待测水样后的库仑量，分别记为CY₁(18.22C)和CY₂(9.54C)；

(3)根据公式计算抑制率IR为47.64％，其中抑制率IR的计算公式为：

IR(％)＝100*(CY₁-CY₂)/CY₁＝100*(18.22C-9.54C)/18.22C＝47.64％。

实施例3

1、采集信号的选取

以碳布(其中该碳布在长期运行的乙酸钠基质培养的大电池中培养一个月以上)为阳极材料、空气阴极碳布材料(包含基底层碳布和分别涂刷在所述基底层的防水层和催化层，所述防水层为塑性剂和粘合剂的混合物，所述催化层Pt/C，其中Pt和C的质量比为2︰8)为阴极材料；向待测水样中加入乙酸钠至水样中乙酸钠的浓度分别为192.3mg/L、384.6mg/L、576.9mg/L、961.5mg/L和1538.4mg/L，相应标准品BOD₅值分别为100mg/L、200mg/L、300mg/L、500和800mg/L，其MFC传感器降解不同浓度乙酸钠的电压采集曲线图如图6所示。当乙酸钠浓度大于等于384.6mg/L时，电压采集曲线在2～5h内基本重合，库仑收集量浮动范围从9.54～9.60C(如图7所示)，相对标准偏差为0.3％，这说明当乙酸钠浓度达到一定值(384.6mg/L)后，阳极生物膜的电子传递速率不再受到有机物浓度变化的影响；当MFC传感器电压采集在测试初期(加入乙酸钠后0～2h的阶段)，微生物处于适应阶段即维护阶段，电子转移速率不稳定，采集电压上升曲线差异明显。当检测时间超过5h后，BOM浓度下降，逐渐成为限制阳极微生物电子转移速率的主要因素。

综上所述，采用MFC传感器对水样毒性物质预警步骤为：首先往水样中添加乙酸钠进行预处理，保证水样中乙酸钠浓度大于384.6mg/L；然后在测试过程中选取2～5h内的库仑量作为解析信号进行毒性预警分析。这样一方面可以有效避免水样中未知浓度BOM带来的干扰，另一方面可以缩短预警响应时间，减少毒性物质对阳极微生物的影响程度，便于检测完成后MFC传感器的快速恢复。

2、外加基质对MFC传感器电化学性能的影响

为了进一步说明本发明的方法的抵抗有机物干扰的可行性，采用电化学手段测试了水样中乙酸钠浓度大于等于384.6mg/L(浓度分别为384.6、576.9、961.5和1538.4mg/L)时，MFC传感器的电化学性能变化，如图8所示。图8中a为不同乙酸钠浓度基质下，MFC传感器的最大功率密度对比图，从中可以看出，最大功率密度浮动范围较小(1033.54～1074.10mW/m²)，相对标准偏差(RSD)为1.6％，这说明添加浓度为384.6mg/L以上的乙酸钠，底物浓度达到饱和，过多的有机物不会对MFC传感器的电子传递速率产生明显影响。图8中b为MFC传感器的阳极阻抗谱图，几种乙酸钠浓度基质下，阻抗谱图高度重合，欧姆内阻(4.53Ω～4.70Ω)和活化内阻(2.34Ω～2.84Ω)都维持在相近的数值内，相应的RSD分别为2.10％和8.20％。这也间接说明底物浓度达到饱和后，阳极微生物电化学活性的稳定性。循环伏安曲线(CV)可以反映阳极微生物的胞外电子传递能力，氧化峰值的电位在-0.28～-0.29V之间，最大电流密度在3.57～3.64μA/cm²之间。图8中c为MFC传感器阳极CV图，表明底物浓度达到饱和后，阳极微生物的胞外电子传递能力保持相对稳定。

3、Cu²⁺的毒性预警测试

图9为控制模拟废水乙酸钠浓度为384.6mg/L(BOD₅值为200mg/L)时，MFC传感器对不同浓度的Cu²⁺的预警效果。从图9中a可以看出，采集电压在2～5h时，随着水样中Cu²⁺浓度的增加(0.5～8mg/L)，电压曲线逐渐降低，并且有明显梯度区分，计算相应的库仑抑制率结果分别为1.38±0.03％，2.03±0.13％，3.05±0.03％和3.86±0.21％(如图9中b所示)，表明示差库仑法对毒性物质有比较稳定的预警效果。图9中c为不同浓度Cu²⁺测试结束后，电压的恢复曲线，从中可以看出，当Cu²⁺浓度检测范围在0.5～8mg/L时，检测结束更换为正常营养液后，MFC传感器的采集电压均可以在1.5h内快速恢复初始状态。

综上所述，示差库仑法既可以对水样中的Cu²⁺进行稳定预警，又能增强阳极生物膜的恢复能力。

4、不同浓度有机物对Cu²⁺毒性预警稳定性影响

上述实验已经证明了当水样中BOM稳定不变时，示差库仑法能够对水体中Cu²⁺的含量进行准确毒性预警。另外以乙酸钠为例，考察水样中变化的BOM浓度是否会对示差库仑法的稳定性造成影响。对比了水样中Cu²⁺的浓度在0.5mg/L和5mg/L两个数量级时，不同浓度的乙酸钠对抑制率的影响，如图10所示。当模拟废水中乙酸钠浓度为384.6mg/L、576.9mg/L、961.5mg/L和1538.4mg/L时，含有5mg/L的Cu²⁺水样毒性预警结果稳定，库仑量抑制率分别为3.04±0.03％、3.13±0.16％、3.07±0.09％和3.25±0.18％，所有检测数据汇总后的库仑量抑制率为3.12±0.15％。当模拟废水中乙酸钠浓度范围在384.6～961.5mg/L时，含有0.5mg/L的Cu²⁺水样毒性预警几乎不受影响，库仑量抑制率分别为1.38±0.03％、1.39±0.17％和1.37±0.07％，但是当乙酸钠浓度达到1538.4mg/L，即BOD₅值为800mg/L时，含有0.5mg/L的Cu²⁺水样库仑量抑制率发生明显下降，仅仅为0.67±0.06％。这说明当水样中Cu^{2 +}较低时，示差库仑法的检测灵敏度降低，容易引起误差。

造成上述结果的原因主要有两个：1)过量的有机物会与溶液中Cu²⁺发生络合反应产生沉淀，影响Cu²⁺扩散到阳极与生物膜接触；2)过量的有机物也会增加阳极生物膜胞外聚合物的含量，进而提高阳极微生物的抗毒性，造成检测库仑量抑制率降低。因此，当经过预处理的水样BOD₅值达到800mg/L时，对含有0.5mg/L的Cu²⁺水样的毒性预警灵敏度降低，但是对较含有较高浓度Cu²⁺水样仍有稳定的预警效果。

5、Cu²⁺对阳极生物膜的作用机理

在上述含有5mg/L的Cu²⁺水样测试完后，立刻拆卸MFC传感器，取出阳极生物膜进行群落分析以及CLSM表征，研究外加不同浓度的乙酸钠对生物膜毒性污染的影响。结果如图11所示，经过毒性检测后的阳极生物膜群落组成并未发生明显变化，产电菌的占比均在50～60％范围内。

图12为活细胞与死细胞的比例变化，其中a、b、c和d中乙酸钠的浓度分别为384.6mg/L、576.9mg/L、961.5mg/L和1538.4mg/L。从12可以看出，随着乙酸钠的浓度的提高活细胞与死细胞的比例未发生明显变化，与没有毒害时的阳极生物膜CLSM类似，说明采用示差库仑量检测含有5mg/L Cu²⁺的有毒废水时，阳极生物膜并未发生明显失活现象。表1为阳极阻抗信息对比表，相比维护时期的MFC阳极，经过毒性物质接触后的阳极欧姆内阻和活化内阻均有明显的升高。

综上可知，本发明采用的检测方法促使毒性物质抑制阳极生物膜的电化学活性，造成胞外电子传递能力降低，导致电信号的下降；但是阳极微生物群落组成和活细胞占比并没有发生明显变化(如图13所示)。因此，采用示差库仑法既能实现毒性预警，又不会对阳极生物膜造成不可逆伤害。

表1阳极阻抗信息对比表

6、不同种类有机物对示差库仑法稳定性影响

分别配制含有50mg/L的谷氨酸(Glutamic)、蔗糖(Sucrose)、葡萄糖(Glucose)和乙酸钠(Acetate)模拟废水，并且每种模拟废水中均含有5mg/L的Cu²⁺。研究水样中存在不同种类的有机物时，示差库仑法对毒性预警稳定性影响。研究结果如图14所示，在模拟水样中加入乙酸钠药剂，保证模拟水样中增加的乙酸钠浓度为384.6mg/L，随即采用示差库仑法进行测试。

结果表明针对含有谷氨酸、蔗糖、和乙酸钠的水样进行Cu²⁺预警时，5mg/L的Cu²⁺水样库仑量抑制率基本一致，分别为3.07±0.09％、3.11±0.22％和3.13±0.26％。但是针对含有葡萄糖的模拟废水进行毒性预警时，5mg/L的Cu²⁺水样库仑量抑制率仅为2.07±0.05％。这是因为葡萄糖容易与溶液中的Cu²⁺形成络合物，减弱了Cu²⁺的毒性，但这不影响真实离子态的Cu²⁺的检测。

除此之外，还采用市政废水(Wastewater)来验证示差库仑法的可行性。结果表明5mg/L的Cu²⁺检测库仑量抑制率为2.65±0.03％，仍具有稳定的预警效果。

7、示差库仑法对不同毒性物质的预警分析

采用上述示差库仑法分别对含有1mg/L的Hg(Ⅱ)、Cr(Ⅵ)、Zn²⁺、Cd²⁺和多聚甲醛溶液，相应的库仑量抑制率分别为9.92％、3.38％、27.99％、4.45％和20.58％(结果分别如图15中a、b、c、d和e所示)。库仑量抑制率从大到小分别为：Zn²⁺＞多聚甲醛＞Hg(Ⅱ)＞Cd²⁺＞Cr(Ⅵ)＞Cu²⁺。

除此之外，还将实验废水也作为毒性检测水样，先稀释100倍后加入到MFC传感器的阳极进行检测，库仑量抑制率为4.45％(如图15中f所示)。由此表明MFC传感器对水环境常见毒性物质均具有稳定的毒性预警效果，同时对复杂水体也具有综合毒性预警能力。

综上所述，本发明提出了一种新的水环境毒性预警方法(示差库仑法)，目的是为了增强MFC传感器对BOM波动的抗干扰能力。其原理是在水样中加入乙酸钠药剂，使阳极上微生物酶利用率能够迅速达到饱和，采用酶饱和阶段的库仑量信号进行毒性预警可以避免水样中有机物的干扰。

本发明主要具有以下优点：

(1)当乙酸钠浓度大于等于384.6mg/L时，电压采集曲线在2～5h内基本重合，此时阳极生物膜的电子传递速率不受有机物浓度波动的影响，因此选取2～5h内的库仑量作为解析信号进行分析一方面可以有效避免水样中未知浓度BOM带来的干扰，另一方面可以缩短预警响应时间；

(2)随着水样中Cu²⁺浓度的增加(0.5～8mg/L)，电压曲线逐渐降低，并且有明显梯度区分，检测结束更换营养液进行恢复维护时，输出电压均能在1.5h内恢复到初始状态。当模拟废水中乙酸钠浓度范围在384.6～1538.4mg/L时，含有5mg/L的Cu²⁺水样毒性预警不受影响，库仑量抑制率均维持在3.12±0.15％；

(3)采用示差库仑法检测时，经过毒性物质接触后的阳极欧姆内阻和活化内阻均有明显的升高，进而造成MFC传感器电信号的变化；但是阳极生物膜的产电菌占比、活体细胞比例等并未发生明显变化。

因此，采用本发明的示差库仑法既能实现毒性预警，又不会对阳极生物膜造成不可逆伤害，便于检测完成后MFC传感器的快速恢复。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。