一种利用研究型正置显微成像系统定量分析斑马鱼黑色素的方法
阅读说明：本技术 一种利用研究型正置显微成像系统定量分析斑马鱼黑色素的方法 (Method for quantitatively analyzing melanin of zebra fish by using research-type upright microscopic imaging system ) 是由 伦静雯 赵海山 苏奎 孙婷伟 吴少娟 郭清泉 于 2021-08-26 设计创作，主要内容包括：本发明属于生物测量技术领域,具体涉及一种利用研究型正置显微成像系统定量分析斑马鱼黑色素的方法；该方法主要是对斑马鱼体表进行成像,从而获得斑马鱼图像文件,然后对图像文件进行图像的相关性计算处理,即捕获清晰斑马鱼体表的黑色素分布图像,将其进行相关性计算处理来统计斑马鱼显微成像下体表黑色素的面积,即得斑马鱼黑色素的数据。本发明方法对实验对象本身不产生任何伤害,属于无接触测量,减少外界因素的影响,有效提高研究数据的可靠性。(The invention belongs to the technical field of biological measurement, and particularly relates to a method for quantitatively analyzing zebra fish melanin by using a research type upright microscopic imaging system; the method mainly comprises the steps of imaging the body surface of the zebra fish to obtain a zebra fish image file, then carrying out image correlation calculation processing on the image file, namely capturing a clear melanin distribution image of the zebra fish body surface, and carrying out correlation calculation processing on the image file to count the area of the melanin of the zebra fish body surface under microscopic imaging to obtain the data of the melanin of the zebra fish. The method does not cause any damage to the experimental object, belongs to non-contact measurement, reduces the influence of external factors, and effectively improves the reliability of research data.)
技术领域
本发明属于生物测量技术领域，一种具体涉及显微成像系统和生物活体成像的斑马鱼体表黑色素定量的方法。
背景技术
斑马鱼具有便于大规模筛选、饲养方便、传代时间短、价格低廉并且斑马鱼的体表上有黑色色素，无需复杂的实验程序即可简单观察色素沉着过程等优势，而斑马鱼体表的黑色素的改变可用作美白祛斑原料的功效评价，因此斑马鱼身体上的黑色素统计在研究以及筛选具有美白成分的原料极为重要。目前关于斑马鱼体表黑色素的定量方法通常采用吸光度光谱法或者荧光光谱法，这些方法步骤繁琐、主观因素影响大，并且很容易对实验造成干扰，引起黑色素数据不准确。
1、吸光度光谱法用于黑色素的定量：该方法是使用约100个受精后9到48h的斑马鱼胚胎，在蛋白质提取液中进行超声处理。离心后，将沉淀在100℃的1N NaOH中溶解10分钟。将获得的上清液在波长为490nm的吸收光谱处进行测量。该方法1996年由Buscà R,Bertolotto C,Ortonne JP,Ballotti R.发表在《生物杂志化学》(JOURNAL OF BIOLOGICALCHEMISTRY)上：题目为“Inhibition of the Phosphatidylinositol 3-Kinase/p70S6-Kinase Pathway Induces B16 Melanoma Cell Differentiation”.期刊号为：31763-32482DEC 1996.
2、荧光光谱法用于黑色素的定量：该方法使用十个胚胎，从48hpf到120hpf，黑色素的产量稳定增长。黑色素受到在碱性过氧化氢溶液中加热的氧化条件下发出荧光，黑色素的量在三个选定的时间点内收集。该方法2016年由Fernandes B,Matamá T,D,Gomes A,Cavaco-Paulo A.发表在《色素细胞与黑色素瘤研究》(PIGMENT CELL&MELANOMARESEARCH)上：题目为“Fluorescent quantification of melanin”期刊号为：603-714NOV2016.
但是，这些方法操作繁琐步骤多，而且对斑马鱼具有破坏性且主观因素影响大。从这几点来看本发明采取的定量斑马鱼体表黑色素的方法更加简便，给美白化妆品领域的研究带来更多的便利。
发明内容
针对上述不足，本发明为斑马鱼黑色素的定量提供一种无接触式、操作简便、数据可靠的定量分析斑马鱼黑色素的方法。
为此，本发明提供的技术方案是这样的：
一种利用研究型正置显微成像系统定量分析斑马鱼黑色素的方法，依次包括下述步骤：
1)对被测量的斑马鱼进行可视化处理，使用研究型正置显微镜捕获斑马鱼图像，得到一组斑马鱼体表明敞图像；
2)然后利用Python和open CV的程序对该组图像进行相关性计算处理，对斑马鱼原始图像进行二值化处理转换为灰度图像，再将图像划分为多个矩形；统计每一张图像上斑马鱼轮廓内的矩形面积S矩(斑马鱼)以及斑马鱼轮廓内黑色素所占的矩形面积S矩(黑色素)；按式(1)计算每一组斑马鱼的黑色素面积，得到一组数据，即为斑马鱼的黑色素面积数据，
其中S矩(斑马鱼)表示图像中斑马鱼轮廓的矩形面积，S矩(黑色素)表示图像上斑马鱼轮廓中黑色素的面积。
进一步的，上述的利用研究型正置显微成像系统定量分析斑马鱼黑色素的方法，所述的研究型正置显微成像系统为：Axio Imager.2荧光正置显微镜。
进一步的，上述的利用研究型正置显微成像系统定量分析斑马鱼黑色素的方法，所述的研究型正置显微成像系统在拍摄时，使用5×的放大镜，保持系统的参数一致，从而得到一组斑马鱼明敞图像文件。
进一步的，上述的利用研究型正置显微成像系统定量分析斑马鱼黑色素的方法，所述的相关性计算处理的方法为：使用open CV进行斑马鱼图像读入处理，将图像进行灰度化和二值化，使图像转换为黑白两个色度；然后使用Canny边缘检测器获取图像目标边框信息，该检测器是使用多阶段算法检测图像中边缘范围；然后将斑马鱼体表上的黑色素转化为黑点，根据目标边框信息裁剪图像，使图像划分为k×k的矩形框，判定每个矩形框，通过图像背景滤波规则晒出异常点，并且计算出图像黑白面积以及异常值，再对异常值进行过滤处理；对过滤后的矩形框进行编号，最后对每个矩形框统计其黑点的面积S矩(黑色素)。
进一步的，上述的利用研究型正置显微成像系统定量分析斑马鱼黑色素的方法，对被测量的斑马鱼进行可视化处理具体包括下述步骤：
1)在恒温为28.5℃的培养箱中培育斑马鱼胚胎24hpf至72hpf，使用不同浓度的药物处理斑马鱼胚胎，在48hpf至受精后第三周的时间段内观察斑马鱼体表黑色素情况；
2)控制恒定的实验环境，将研究型正置显微镜与计算机等设备连接起来，开启计算机软件；
3)将羧甲基纤维素放在盖玻片上，将待测的斑马鱼放在羧甲基纤维素上，固定好斑马鱼，然后将放有斑马鱼的盖玻片放在显微镜的载物台上，调整好需要的放大倍数进行聚焦；
4)利用计算机软件采集斑马鱼体表图像。
本发明利用研究型正置显微镜结合有关图像相关性计算处理的程序，具有非常简便而又快速且准确的定量斑马鱼体表黑色素的特点，突出一点的是这种方法提供一种非接触式测量，对生物体不带来任何伤害，提高实验数据的准确度和可信度。该方法为生物活体、显微照明、和成像领域提供重要的应用需求和潜力。
附图说明
图1是本发明提供的图像相关性计算的数据处理方法定量斑马鱼体表黑色素的流程图。
图2是利用正置显微镜拍摄的斑马鱼图像。
图3是使用矩形框裁剪的斑马鱼轮廓图像。
图4是A图为进行二值化处理的图像。B图是对斑马鱼黑斑进行编号的图像。
图5是将经过过滤获得的有效黑斑汇总图。
图6是A图为熊果苷不同给药浓度情况下的斑马鱼黑色素面积比统计图。B是空白组的斑马鱼体表图像。C组是浓度为100mM熊果苷组的斑马鱼体表图像。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不构成对本发明的任何限制，任何人在本发明的权利要求范围内所做的有限次的修改仍在本发明的权利要求范围内。
斑马鱼体表黑色素最为直观的定量方法其实是统计斑马鱼体表上的黑色素的面积，由此我们可以直接统计不同试验组的斑马鱼体表上的黑色素的面积便可以从本质上得到斑马鱼黑色素的数据。
本发明在定量黑色素时，首先需要对待测斑马鱼进行体表成像，然后使用研究型正置显微成像系统。在拍摄时，使用一定倍数的放大镜，保持系统的参数一致，从而得到一组斑马鱼明敞图像文件，然后对该文件进行图像的相关性计算处理：
使用open CV进行斑马鱼图像读入处理，将图像进行灰度化和二值化，使图像转换为黑白两个色度。然后使用Canny边缘检测器获取图像目标边框信息，该检测器是使用多阶段算法检测图像中边缘范围。然后将斑马鱼体表上的黑色素转化为黑点，根据目标边框信息裁剪图像，使图像划分为k×k的矩形框，判定每个矩形框，通过图像背景滤波规则晒出异常点，并且计算出图像黑白面积(即得S矩(斑马鱼))以及异常值，再对异常值进行过滤处理。对过滤后的矩形框进行编号，最后对每个矩形框统计其黑点的面积S矩(黑色素)。我们使用S矩(斑马鱼)的面积加和可得到斑马鱼的总面积，而使用S矩(黑色素)的加和可以得到斑马鱼上黑色素的总面积，由此定义为：
上式中S矩(斑马鱼)为图像中斑马鱼轮廓的矩形框的面积，S矩(黑色素)为图像上斑马鱼轮廓内黑色素的矩形框的面积。
操作过程中选取符合要求的图像作为目标图像，将所有要处理的图像做以上的操作处理得到一组数据，即可以很准确并且快速地反应出斑马鱼的黑色素面积。
例如我们选取一张斑马鱼图片(如图2)，提取图片中斑马鱼轮廓的矩形框(如图3)，计算斑马鱼轮廓中矩形框的面积，然后对斑马鱼轮廓中黑斑块进行编号(如图4、5)，最后计算每个编号下的黑斑的面积，即可得到黑色素的面积，按照以上公式可得黑色素的数据，这组数据即反应斑马鱼中黑色素所占的百分比，直观的定量黑色素。且此方法可以清晰获取每个编号黑斑的情况(如图5)。该方法的测量精度依赖于研究型正置显微镜的稳定成像条件，研究型正置显微镜可以采集清晰的斑马鱼图像，提供清晰的黑色素分布的拍摄条件(恒定颜色、自然光照明、高端化学器件、可配置的选项)。
因此，使用本发明提供的方法时，需要使用明敞的拍摄图像，保证捕获每张图像的参数要一致，从而提高实验结果的可信度。定量斑马鱼黑色素的具体操作步骤可归纳如下：
1、在恒温为28.5℃的培养箱中培育斑马鱼胚胎一段时间(一般为24hpf至72hpf)，使用不同条件处理斑马鱼胚胎，一般在48hpf至受精后第三周的时间段内观察斑马鱼体表黑色素情况。
2、控制恒定的实验环境，将研究型正置显微镜与计算机等设备连接起来，开启计算机软件。
3、将羧甲基纤维素放在盖玻片上，将待测的斑马鱼放在羧甲基纤维素上，固定好斑马鱼，然后将放有斑马鱼的盖玻片放在显微镜的载物台上，调整好需要的放大倍数(例如5×)进行聚焦。
4、利用计算机软件采集斑马鱼体表图像(如图2)。
5、使用事先编写好的软件对采集到的图片进行处理而得到斑马鱼黑色素数据图(如图2、3、4、5)
这里我们用的显微镜型号是蔡司的Axio Imager A2
为了更好说明本申请提供的技术方案的优点，下面给出本身提供的技术方案实际应用例子：
测量不同给药浓度的熊果苷对斑马鱼黑色素的影响：
1、在恒定为28.5℃的条件下的恒温培养箱培养野生型的斑马鱼胚胎。
2、搭建拍摄所需的实验系统，连接电源检测设备是否运作正常。
3、使用六组不同浓度的熊果苷处理24hpf胚胎至72hpf，第一组为空白组不给予药物处理，后面五组分别进行给药处理，浓度分别是6.25mM、12.5mM、25mM、50mM、100mM。
4、将某一浓度下的一条斑马鱼放置在放有4％的羧甲基纤维素的盖玻片上，将斑马鱼固定在其上，调整斑马鱼的姿态，背部朝上，整一条鱼呈直线状态，用5×放大倍数的显微镜观测到清晰的斑马鱼体表的黑色素斑块。
5、利用ZEN软件，设定曝光时间：500s，采集斑马鱼黑色素分布的俯视图。如图2所示。
6、将六组采集的图像进行命名，使用编写好的程序依次处理全部图像文件，求出每一条斑马鱼的黑色素的面积，分别为
Ctrl组：557751.5、561046.5、528218
6.25mM熊果苷：436457.5、476063、562656
12.5mM熊果苷：670607.5、412138.5、379182
25mM熊果苷：346250.5、367243.5、328673.5
50mM熊果苷：299224.5、348216.5、305681
100mM熊果苷：286122、294449.5、327264.5。
7、统计不同给药浓度下黑色素面积的平均值，Ctrl组：549005.333333333、6.25mM熊果苷组：491725.5、12.5mM熊果苷组：487309.333333333、25mM熊果苷组：347389.166666667、50mM熊果苷组：317707.333333333、100mM熊果苷组：302612，以Ctrl组为1使不同浓度的熊果苷组归一化处理，绘制斑马鱼黑色素面积比例图，如图6所示，A图中，数值越大代表黑色素含量越高，而给予熊果苷处理之后黑色素的量明显降低，而且呈浓度依赖性。而从图片直观对比，B图为空白组，C图为给药组，明显可得给予熊果苷处理之后黑色素明显降低。
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