具体实施方式

本发明涉及新型化合物及其在疗法中的用途，特别是用于治疗癌症的用途。

本文所述的化合物是从柳属植物中提取的，特别是宫柳或毛枝柳。

一般而言，柳属植物的遗传起源是未知的，尽管它们在北半球的寒带和温带(包括，例如欧洲、亚洲和北美洲)最为丰富。

关于本文提到的宫柳，该物种被认为是原产于日本和韩国。

关于本文提到的毛枝柳，该物种被认为是原产于西伯利亚。

关于本文提到的河柳，该物种被认为是原产于日本和韩国。

关于本文提到的柳枝柳，该物种被认为是原产于哈萨克斯坦。

关于本文提到的匍匐柳，该物种被认为是原产于奥地利、波罗的海国家、比利时、中欧俄罗斯、捷克斯洛伐克、丹麦、芬兰、法国、德国、英国、爱尔兰、荷兰、北欧俄罗斯、挪威、葡萄牙、西班牙、瑞典、瑞士和南斯拉夫。

关于本文提到的辣椒柳，该物种被认为是原产于中亚。

关于本文提到的Salix adhenophylla，该物种被认为是原产于北美洲。

关于本文提到的川滇柳，该物种被认为是原产于中国。

关于本文提到的伪蒿柳，该物种被认为是原产于欧洲、西亚和喜马拉雅山。

关于本文提到的Salix glaucophyloides，该物种被认为是原产于北美洲。

在本说明书中，术语“宫柳霉素”是指式X的化合物。

在本说明书中，术语“宫柳霉素B”是指式XI的化合物。

在本说明书中，术语“miyabeanol”是指式XII的化合物。

在本说明书中，术语“约”是指±20％，更优选地±10％，甚至更优选地±5％，最优选地±2％。

如本文所使用的，术语“治疗有效量”是指降低由所讨论的疾病引起的至少一种病症或症状的严重程度和/或改善所需的组合物的量。

在本说明书中，术语“治疗”是指对现有疾病的治疗和/或预防性治疗，以防止疾病的发生。因此，本发明的方法和组合物可用于治疗、预防、抑制疾病的发展或延缓疾病的发作。

在本说明书中，提到的“本文所述的化合物”优选是指式I至式XX中的任何一种化合物，或其衍生物、同系物、立体异构体、前药或药用盐。

在本说明书中，提及的“本文所述的组合物”是指包含本发明所述的化合物的组合物。优选地，所述组合物是药物组合物。

优选地，组合物包括治疗有效量的至少一种本文所述的化合物或其生理上可接纳的盐。

优选地，组合物包括生理上可接纳的载体。

在本说明书中，术语“前药”是指在生物学上无活性，但经代谢后可产生活性治疗药物的化合物。

在本说明书中，术语“衍生物”是指从本文所述的化合物衍生的分子。例如，这种衍生物可以是这些化合物的合成改变的衍生物。

在本说明书中，术语“同系物”是指与本文所述化合物具有实质结构相似性的分子。

在本说明书中，术语“立体异构体”是指具有与另一分子相同的分子式和键合原子序列，但其原子在空间的三维取向不同的分子。

本发明的化合物和组合物可以被配制成通过任何合适的途径施用的药用制剂用于临床使用。实例包括通过经口、经鼻、直肠、局部、舌下、经皮、鞘内、经粘膜或肠胃外(如皮下、肌内、静脉和皮内)施用。

药物制剂可以通过将活性物质或其药学上可接受的盐与常规药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂混合来制备。赋形剂的实例包括水、明胶、阿拉伯胶、乳糖、微晶纤维素、淀粉、羧基乙酸淀粉钠、磷酸氢钙、硬脂酸镁、滑石、胶体二氧化硅等。药学上可接受的载体包括与药物施用相容的溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等，除非使用它们与活性化合物不相容。

制剂还可含有其他药理活性剂和常规添加剂，如稳定剂、润湿剂、乳化剂、调味剂、缓冲剂等。

制剂可通过常规方法制备成如片剂、胶囊、颗粒、粉剂、糖浆、悬浮液、栓剂或注射剂等剂型。液体制剂可通过将活性物质溶解或悬浮在水或其他合适的媒介物中来制备。片剂和颗粒可按常规方式进行包衣。

用于肠胃外、皮内或皮下应用的溶液或悬浮液可包括无菌稀释剂，如注射用水、盐水、固定油(fixed oils)、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗菌剂，如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸；缓冲剂，如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐以及用于调节张力的试剂，如氯化钠或葡萄糖。可以用酸或碱来调节pH值，如盐酸或氢氧化钠。肠外制剂可以封装在玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。

对于口服施用，组合物可以是软胶囊或片剂的形式，并且通常包括惰性稀释剂或可食用载体。口服组合物也可以使用用作漱口水的液体载体来制备，其中液体载体中的化合物通过口服应用，并被荡洗(swished)、吐出或吞咽。药学上相溶的结合剂和/或佐剂材料可以作为组合物的一部分被包括在内。片剂、药丸、胶囊、锭剂等可以含有以下任何成分，或类似性质的化合物：粘合剂，如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂，如淀粉或乳糖；崩解剂，如海藻酸、初凝胶(Primogel)或玉米淀粉；润滑剂，如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂(glidant)，如胶体二氧化硅；甜味剂，如蔗糖或糖精；或调味剂，如薄荷、水杨酸甲酯或橙味剂。

旨在吸入的制剂可以以气溶胶喷雾剂的形式提供，例如装在含有适当推进剂的加压容器或分配器中。

经黏膜或经皮递送方式可用于全身施用。所讨论的适合于屏障的渗透剂可以在本领域中使用且在本领域中是公知的。实例包括洗涤剂、胆汁盐和夫西地酸衍生物。鼻腔喷雾剂和栓剂可用于经黏膜递送。乳膏、软膏、药膏和凝胶可用于经皮递送。在直肠递送的情况下，这些制剂也可以作为保留灌肠剂提供。

还可以提供旨在靶向递送本文所述组合物和化合物的的制剂，例如使用靶向剂，如抗体、抗体片段、受体结合剂、纳米颗粒、纳米载体或其组合。在这方面，已知的是癌细胞表现出癌症特异性标记，这意味着对这些标志物具有特异性的制剂可用于将本文所述的化合物和组合物以选择性的方式引导到癌细胞和组织。

在一个实例中，本文所述的化合物可以与对一种或多种癌细胞特异性标志物具有特异性的的抗体或其片段结合，或与对一种或多种癌细胞特异性标志物具有特异性的的靶向配体相连接的纳米粒子缀合。纳米粒子的实例包括脂质阳离子纳米粒子、金纳米粒子、二氧化硅纳米粒子、聚乙二醇化纳米粒子和两亲性聚合物纳米粒子。组合物可以包括具有多种功能配体的纳米粒子，这些配体除了本文所述的化合物外，还可以包括例如诊断和/或其他治疗剂。与靶向分子(如配体、抗体或抗体片段)结合的纳米载体(如脂质体和胶束)可用于将本文所述的未修饰化合物和组合物输送至癌细胞和组织。

化合物和组合物也可以以防止从体内迅速消除的制剂提供。实例包括已知的修饰释放制剂，如植入物和微囊递送系统。

含有适当配制的化合物的药物组合物可以与施用说明书一起包含在容器、包装或分配器中。

制剂的适当剂型将取决于预期的施用途径、所需的递送的药物量和化合物的潜在毒性。这可以根据本领域已知的标准程序来确定。例如，化合物的毒性和治疗效果可以通过在细胞培养物或实验动物中的标准制药程序来确定，并通过考虑LD50(对50％的人群的致死剂量)、ED50(对50％的人群治疗有效的剂量)和由此产生的治疗指数(LD50/ED50)进行评估。适当的剂型也可能取决于特定递送途径的潜在副作用，以及有效充分递送到预定需要治疗的部位所需的活性化合物量。

实例

二聚化合物宫柳霉素、宫柳霉素B和Miyabeanol的分离和表征

将宫柳的冻干嫩叶用作初步分离宫柳霉素(图1A)和Miyabeanol(图1C)的起始材料。将宫柳的冻干幼茎用作初步分离宫柳霉素B的起始材料(图1B)。在提取之前，将组织研磨成均匀的粉末。

宫柳霉素

为了初步分离宫柳霉素，将1mL的水:甲醇(80:20)溶液加入宫柳的叶组织(50mg)中。将悬浮液在室温下搅拌5分钟，然后用水浴锅加热到50℃并恒温10分钟。将所得溶液以13000rpm离心5分钟，将800μL上清液移除到干净的试管中，在90℃下加热2分钟。将溶液冷却(5℃)30分钟，并以13000rpm离心5分钟。用反相HPLC纯化含有目标化合物的上清液。使用配备有四级泵、二极管阵列检测器、柱烘箱和自动进样器的Agilent1100HPLC系统，在分析型HPLC中重复进样6次，每次100μL。使用Ascentis C18色谱柱(5um，5×250mm(Supelco，英国))分离色谱峰。操作溶剂为：溶剂A：含有0.1％甲酸的H₂O，溶剂B：含有0.1％甲酸的乙腈。峰值分离的操作梯度是从5％B(0-10min)，22％B(10-50min)到37％B(60-70min)，恒定流量为1mL/min，总色谱运行时间为72min。用254nm的波长识别和监测峰值，并将其手动收集到玻璃管中。宫柳霉素在57.93min洗脱(图2)。使用Speedvac浓缩器(Genevac，萨福克，英国)将6次运行的等量馏分进行合并和蒸发，得到1.68mg纯化的宫柳霉素。通过上述程序，还可以从以下柳属中回收产品：毛枝柳、河柳、柳枝柳、匍匐柳、辣椒柳和Salix adhenophylla及其杂交种。

表2用于分离二聚代谢物的提取和HPLC梯度条件

在分析由NWC941(宫北柳)与RR05326(Resolution×伪蒿柳)杂交产生的宫柳杂交育种系(RR10347)时，可以看到进一步的结构多样性。通过LC-MS对RR10347的分析，表明存在特里杨甙(tremulacin)(C₂₇H₂₈O₁₁)，其是柳皮苷的2'-O-苯甲酰化衍生物，柳皮苷在杨柳科植物中很有名。在30.95min也出现了一个新峰，其质量为947.2561，对应于分子式为C₄₇H₄₇O₂₁的离子。与宫柳霉素的质谱一样，较小的离子(m/z 421.1125)与牡荆苷(salicortenone)(C₂₀H₂₁O₁₀)中观察到的对应。另外的小离子(m/z 525.1465)也很明显，建议分子式为C₂₇H₂₅O₁₁。m/z 947.2561的MSMS在m/z 121(C₇H₅O₂)和m/z 123(C₇H₇O₂)处产生了两种强离子，前者对应于苯甲酸酯部分，后者对应水杨酸基部分。这些数据暗示了式XVI/XVII的化合物，即宫柳霉素的新型单苯甲酰化衍生物。通过重复进样入HPLC系统分离出该峰，并通过¹H-NMR表征其结构。通过与宫柳霉素的NMR谱图比较，该数据证实了二聚化合物的存在。δ8.06、7.70和7.54的附加峰是苯甲酸酯基的特征，但大多数峰的双倍表明异构体的1:1混合物不能进一步分离。在δ5.25出现的多重峰组证实了第一异构体中葡萄糖苷的2'-位和第二异构体的2"-位被苯甲酰基取代。这在¹H-¹H-COSY谱图中得到了进一步证实。

另一实例，在开发作为洛桑研究所的生物量改进计划的一部分的柳树育种系(RR10147)的LC-MS分析中，看到了取代的二聚化合物的扩大范围。这个杂交种系包括两个亲本[RR07187(944S.glaucophyloides×577“77056”)×RR07188(944S.glaucophyloides×577“77056”)]中的毛枝柳(NWC577)以及S.glucophyloides(NWC 944)。在负离子模式LC-MS数据的总离子色谱图中，柳皮苷、2'-O-乙酰柳皮苷和特里杨甙作为主要的峰出现。鉴于这种杂交产生了能够产生乙酰化和苯甲酰化的水杨酸(salicinoids)以及柳皮苷的杂交种，因此预计相关的二聚类似物也将通过涉及三个相应的二烯酮的交叉反应矩阵而形成。事实的确是宫柳霉素在25.03min出现，2’/2”-O-乙酰宫柳霉素(2’/2”-O-acetylmiyabeacin)(式XIII/XIV)在26.90min出现，2’/2”-O-苯甲酰宫柳霉素(2’/2”-O-benzoylmiyabeacin)(式XVI/XVII)在30.95min出现。在32.48min又观察到另一有趣的峰，其显示出m/z 989.2617的离子，对应的分子式为C₄₉H₄₉O₂₂。尽管分离不充分，但MS暗示预测的宫柳霉素类似物同时带有乙酰基和苯甲酰基的取代。

宫柳霉素的结构是通过各种形式的光谱来确定的。表3显示了光谱分析的一般测量条件。

表3光谱测量的一般条件和参数

缩写

DEPT：无畸变极化转移增强(用于确定碳类型的方法(区分CH₃、CH₂、CH和C))。

COSY：相关光谱(¹H-¹H COSY的方法)。

HSQC：异核单量子相干(Heteronuclear Single Quantum Coherence)(¹H-¹³CCOSY的方法)

HMBC：异核多键相关(Heteronuclear Multiple Bond Correlation)(长程¹H-¹³CCOSY的方法)

宫柳霉素的光谱分析

高分辨率LC-MS：LC-MS是在负离子模式下使用C18柱进行的。分析条件见表3。图3显示了纯化的宫柳霉素的总离子色谱图，其在25.31min时出现了单峰。在负离子模式下收集了高分辨率的质谱(图4)，在843.23529(C₄₀H₄₃O₂₀)显示出m/z离子，对应于宫柳霉素(分子式C₄₀H₄₄O₂₀)的[M-H]-。质谱中出现的较小的离子还有m/z 889.2396(C₄₁H₄₅O₂₂，甲酸盐加合物)、557.1300(C₂₇H₂₅O₁₃)、421.1140(C₂₀H₂₁O₁₀)、331.1034(C₁₄H₁₉O₉)和217.0507(C₁₂H₉O₄)。m/z 843.23529的MS-MS(图5)显示了各种低丰度的片段，包括m/z 123.04538(C₇H₇O₂)、201.05629(C₁₂H₉O₃)、227.03554(C₁₃H₇O₄)、245.04494(C₁₃H₉O₅)和557.13739(C₂₇H₂₅O₁₃)。m/z421.11404离子的MS-MS(图6)给出了在m/z 297.06246(C₁₃H₁₃O₈)、153.02017(C₇H₅O₄)、135.00946(C₇H₃O₃)、123.04583(C₇H₇O₂)、109.03004(C₆H₅O₂)和81.03513(C₅H₅O)的片段。

NMR光谱：在含有0.01％w/v d₄-TSP作为内标的d₄-甲醇水溶液中，在600MHz收集了宫柳霉素的¹H-NMR数据。该光谱显示了与34个耦合质子有关的峰(图7和表4)。

表4宫柳霉素的¹H-NMR分布情况，在D₂O:CD₃OD(4:1)中在600MHz下收集的数据，参 照d₄-TSP(0.01％w/v)

在δ7.34-7.10之间观察到四个信号，与在含有水杨基的化合物中获得的信号一致。这些芳烃峰的整合与8个质子相对应，表明有两个这样的水杨基环。这一点通过两对与独特的水杨基羟亚甲基(hydroxymethylene group)有关的J＝12Hz的双峰信号的存在得到证实(第1对：δ5.40和δ5.19；第2对：δ5.38和δ5.16)。类似地，该分子含有两个不同的葡糖苷分子，具有与被复制的H-1’异头质子(δ5.09和δ5.07)相关的特征双信号，与对应于葡糖基6’-亚甲基的那些信号相同。在δ6.60和5.85之间存在四个独立的烯烃信号，每个信号整合一个质子，其中两个表现为双峰，其他信号表现为简单的三重峰。¹H-¹H COSY分析(图8)表明，这两个双键是相互分离的。碳水化合物区域(δ3.96-3.40)的整合，表明总共有16个耦合质子。在这些质子中，12个可以在两个葡萄糖单位中得到解释，剩下4个没有得到解释。¹³CNMR数据(图9和表5)证实分子中存在40个碳原子，包括在δ199.6和210.0处的两个酮类羰基和δ173.6和173.2处的两个酯类羰基，而¹³C DEPT135(图10)除了葡萄糖(×2)的信号和两个烯烃信号外，还识别了四个非芳香族的次甲基信号。

表5宫柳霉素的¹³C-NMR分布情况，在D₂O:CD₃OD(4:1)中在100.61MHz下收集的数 据，参照d₄-TSP(0.01％w/v)

考虑到来自准确质量的分子式，较小的m/z 421片段与已知分子柳皮苷的碎裂模式的相似性，以及苄基和糖基相关的NMR信号的重复，我们推测宫柳霉素是通过柳皮苷的脱氢类似物的两个分子的共轭形成的不对称的二聚结构。该结构有三环十二碳二烯母核。在二聚体母核结构的所有位置周围(图11)以及H-10(δ3.60)和C-8(δ173.6)之间观察到¹H-¹³CHMBC的关键相关性(key correlations)，证实了在C-9处的羧基与母核结构的连接。H-7(δ5.19和5.40)和C-8(δ173.6)之间的相关性证实了，通过酯类羰基与水杨基部分的结合。在H-15(δ3.50)和C-21(δ173.2)之间以及H-22(δ5.16和5.38)和C-21(δ173.2)之间也观察到类似的相关性，表明在C-20处有第二羧基-水杨基实体连接到三环十二碳二烯母核。C-1(δ158.0)与H-7(δ5.19和5.40)以及H-1’(δ5.09/5.07)之间以及C-28(δ157.7)与H-22(δ5.16和5.38)和H-1”(δ5.07/5.09)之间的其他相关性与O-糖甙在C-1和C-28处的布置一致。

宫柳霉素B

为了初步分离宫柳霉素B，将2.5mL的水:甲醇(80:20)溶液加入宫柳茎组织(200mg)中。将悬浮液在室温下搅拌5分钟，然后用水浴锅加热到50℃并恒温10分钟。将所得溶液以13000rpm离心5分钟。将800μL上清液移除到干净的试管中，在90℃下加热2分钟。将溶液冷却(5℃)30分钟，并以13000rpm离心5分钟。用反相HPLC纯化含有目标化合物的上清液。使用配备有四级泵、二极管阵列检测器、柱烘箱和自动进样器的Agilent1100HPLC系统，在分析型HPLC中每次进样100μL。使用Ascentis C18色谱柱柱(5um，5×250mm(Supelco，英国))分离色谱峰。操作溶剂为：溶剂A：含有0.1％甲酸的H₂O，溶剂B：含有0.1％甲酸的乙腈。峰值分离的操作梯度是从5％B(0-10min)，29％B(10-60min)到29％B(60-70min)，恒定流量为1mL/min，总色谱运行时间为70min。用254nm的波长识别和监测峰值，并将其手动收集到玻璃管中。宫柳霉素B在52.11min洗脱(图12)。使用Speedvac浓缩器(Genevac，萨福克，英国)将多次运行的等量馏分进行合并和蒸发，得到0.67mg纯化的宫柳霉素B。通过各种形式的光谱确定宫柳霉素B的结构。

宫柳霉素B的光谱分析

高分辨率LC-MS：LC-MS是在负离子模式下使用C18柱进行的。分析条件见表3。图13显示了纯化的宫柳霉素B的总离子色谱图，其在24.34min出现了单峰。在负离子模式下收集了高分辨率的质谱(图14)，在843.23474(C₄₀H₄₃O₂₀)显示出m/z离子，对应于宫柳霉素B(分子式C₄₀H₄₄O₂₀)的[M-H]-。在m/z 889.23895(C₄₁H₄₅O₂₂)处的较小的离子对应于甲酸盐加合物。

NMR光谱：甲醇水溶液中的¹H-NMR光谱显示共有17个信号，其与34个不同的质子有关(表6)。

表6宫柳霉素B的¹H-NMR分布情况，在D₂O:CD₃OD(4:1)中在600MHz下收集的数据，参 照d₄-TSP(0.01％w/v)

与苄基和葡糖基部分有关的信号的存在与在宫柳霉素的¹H-NMR谱图中观察到的信号相比很好。之前在宫柳霉素中观察到的四个烯烃信号(δ5.91至6.59)的缺失，伴随着四个桥头质子(δ3.43-3.63)的上移，从而给出一组δ2.76、2.88、2.99和3.12处的四个信号，每个信号整合了2个质子。¹H-NMR数据表明，在宫柳霉素中烯烃单元的进一步[2+2]分子内环化，得到“笼状”结构，我们将其命名为宫柳霉素B。现在双键的环加成赋予了2倍的对称轴，导致宫柳霉素B的¹H-NMR光谱相对于宫柳霉素观察到的光谱明显简化。[¹H-¹H]相关光谱学证实了分子的三环母核周围的结合关系。表7给出了宫柳霉素B的¹³C数据。

表7宫柳霉素B的¹³C-NMR分布情况，在D₂O:CD₃OD(4:1)中在100.61MHz下收集的数 据，参照d₄-TSP(0.01％w/v)

Miyabeanol

为了初步分离Miyabeanol，将2mL水:甲醇(80:20)溶液加入宫柳的叶组织(150mg)中。将悬浮液在室温下搅拌5分钟，然后用水浴锅加热到50℃并恒温10分钟。将所得溶液以13000rpm离心5分钟。将800μL上清液移除到干净的试管中，在90℃下加热2分钟。将溶液冷却(5℃)30分钟，并以13000rpm离心5分钟。用反相HPLC纯化含有目标化合物的上清液。使用配备有四级泵、二极管阵列检测器、柱烘箱和自动进样器的Agilent 1100PLC系统，在分析型HPLC中重复进样8次，每次100μL。使用Ascentis C18柱(5um，5×250mm(Supelco，英国))分离色谱峰。操作溶剂为：溶剂A：含有0.1％甲酸的H₂O，溶剂B：含有0.1％甲酸的乙腈。峰值分离的操作梯度是从5％B(0-10min)，22％B(10-50min)到37％B(60-70min)，恒定流量为1mL/min，总色谱运行时间为72min。用254nm的波长识别和监测峰值，并将其手动收集到玻璃管中。Miyabeanol在44.87min洗脱(图1)。使用Speedvac浓缩器(Genevac，萨福克，英国)将8次运行的等量馏分进行合并和蒸发，得到1.05mg纯化的Miyabeanol。

Miyabeanol的光谱分析

高分辨率LC-MS：LC-MS是在负离子模式下使用C18柱进行的。分析条件见表3。图15显示了纯化的宫柳霉素B的总离子色谱图，其在20.11min出现了单峰。在负离子模式下收集了高分辨率的质谱(图16)，在531.15074(C₂₆H₂₇O₁₂)显示出m/z离子，对应于miyabeanol(分子式为C₂₆H₂₈O₁₂)的[M-H]-。421.11421(C₂₀H₂₁O₁₀)和467.11943(C₂₁H₂₃O₁₂)处的附加离子对应于反向Diels Alder反应的产物(牡荆苷)及其相应的甲酸盐加合物。m/z 531.15074的MSMS分析(图17)产生了245.04634(C₁₃H₉O₅)、217.05150(C₁₂H₉O₄)和123.04579(C₇H₇O₂)处的片段离子。

NMR光谱：miyabeanol的¹H NMR光谱(图18和表8)表明了与环二聚体宫柳霉素类似的结构，虽然光谱的某些区域(包括与苄基和葡糖基有关的区域)不再重复，表明每个这些单元中的一个单元已经丢失。

表8miyabeanol的¹H-NMR分布情况，在D₂O:CD₃OD(4:1)中在600 MHz下收集的数据， 参照d₄-TSP(0.01％w/v)

δ6.63和δ6.02处的¹H信号与在宫柳霉素中观察到的信号一致，与烯酮质子、H-12和H-13有关。在δ6.27和δ5.94处也出现了与分离的烯烃质子相应的信号。该数据和这些信号与另外4个次甲基质子的额外¹H-¹H COSY相关性(图19)证实了，该分子保留了Diels-Alder“核心”。¹³CNMR(图20和表9)显示了26个不同的碳信号，包括δ213.29和δ199.1处的两个酮信号。

表9miyabeanol的¹³C-NMR分布情况，在D₂O:CD₃OD(4:1)中在100.61 MHz下收集的 数据，参照d₄-TSP(0.01％w/v)

通过对COSY、HSQC和HMBC相关光谱的广泛分析，确认了侧链缺失和脱羧的位置。在H-10和C-8、H-10至C-14和H-13至C-9之间确定了关键的¹H-¹³C相关性。这使得羧基-水杨基糖苷(carboxy-salicylglycoside)部分位于C-9。从H-15和H-18到C-19处的羰基以及从H-16、H-18和H-10到C-20(δ81.4)都存在相关性。

宫柳霉素的生物测定数据

针对包括神经母细胞瘤和乳腺癌、食道癌和卵巢癌在内的一系列癌细胞系测试了宫柳霉素的活性(表10)。

表10宫柳霉素在六种癌症细胞系中的生物活性数据

MYCN扩增的神经母细胞瘤细胞系UKF-NB-3从4期神经母细胞瘤患者建立(Kotchetkov等人，2005)。还测试了耐长春新碱的UKF-NB-3亚系UKF-NB-3^rVCR(Rothwell等人，2010)(适应于在10ng/mL的长春新碱存在下生长)。在浓度为20μg/mL的宫柳霉素下，相对于未处理的细胞，120小时后的UKF-NB-3的细胞活力为0％，而耐长春新碱的UKF-NB-3^rVCR系为4.22±2.89％。食道癌细胞系COLO-680N获自ATCC(马纳萨斯，VA，美国)，卵巢癌细胞系COLO-704来自DSMZ(布伦瑞克，德国)。所有的细胞系都在增补有10％FCS、100IU/ml青霉素和100mg/ml链霉素的Iscove's modified Dulbecco's medium(IMDM)，在温度37℃下繁殖。对细胞进行常规的支原体污染检测，并通过短串联重复分析进行鉴定。如前所述(Michaelis等人，2015)，在培养120h后，通过3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑(MTT)染料还原试验测定细胞活力。简言之，将5000个细胞(悬浮在100μL增充有10％FCS，100IU/ml青霉素和100mg/ml链霉素的IMDM中)在不存在或存在不同浓度的化合物的情况下，于37℃和5％CO₂的96孔板中培养120h。然后，在4h内滴加25μL的MTT溶液(2μg/mL溶于PBS)。随后加入100μL 20％的十二烷基硫酸钠(50:50纯化水/DMF)溶液调节pH值为4.7，继续反应4h，以裂解细胞并溶解甲瓒(formazan)沉淀。然后在600nm处读取平板。相对活力被确定为相对于未处理的细胞对照(＝100％)的光密度的相对减少。在三个选定的品系(UKF-NB-3、COLO-680N和COLO-704)上测定了宫柳霉素活性的重复IC 50值，范围为17.15μM到40.18μM(表11)。

表11三种癌细胞系中重复的IC 50测定

虽然这些结果对上述所有的细胞系都很重要，但特别值得注意的是对神经母细胞瘤细胞系的活性。神经母细胞瘤的总存活率低于50％，且它代表了最常见的儿童颅外实体瘤。由于耐药性的获得是神经母细胞瘤的重要问题，因此非常需要对神经母细胞瘤有效的新化合物。

应该理解的是，本文所述的目前优选的实施方案的各种改变和修改对于本领域的技术人员来说是显而易见的。在不脱离本发明的精神和范围并且不会削弱其附带的优点的情况下，可以进行这样的改变和修改。因此，所附的权利要求书中涵盖了这些变化和修改。

参考文献

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Michaelis M，Rothweiler F，Barth S，Cinatl J，van Rikxoort M，N，Voges Y，Breitling R，von Deimling A，F，Weber K，Fehse B，Mack E，Stiewe T，Doerr HW，Speidel D，Cinatl J Jr.Adaptation of cancer cells from differententities to the MDM2inhibitor nutlin-3 results in the emergence of p53-mutated multi-drug-resistant cancer cells.Cell Death Dis.2011Dec 15；2：e243.

Michaelis M，Agha B，Rothweiler F，N，Voges Y，Mittelbronn M，Starzetz T，Harter PN，Abhari BA，Fulda S，Westermann F，Riecken K，Spek S，LangerK，Wiese M，Dirks WG，Zehner R，Cinatl J，Wass MN，Cinatl J Jr.Identification offlubendazole as potential anti-neuroblastoma compound in a large cell linescreen.Sci Rep.2015a Feb3；5：8202.

Rothwell，P.M.，et al.Long-term effect of aspirin on colorectal cancerincidence and mortality：20-year follow-up of five randomised trials.Lancet376：1741-50(2010).

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