具体实施方式

以下通过具体实施例详细说明本发明的实施过程和产生的有益效果，旨在帮助阅读者更好地理解本发明的实质和特点，不作为对本案可实施范围的限定。

实施例1

步骤1：

在三口瓶中加入四乙酰葡萄糖醛酸(15.0g，39.9mmol)，DMF(150mL)，冰浴氮气保护下加入醋酸肼(4.4g，47.9mmol)，自然回温至室温搅拌4小时，TLC显示反应完全，将体系倒入水(500mL)中，EA(丙烯酸乙酯)(300mL)萃取，有机相用水洗三次，饱和食盐水洗一次，无水硫酸钠干燥，旋干得化合物2(11g，收率83％)。

¹HNMR CDCl₃δ:5.61-5.55(m,2H),5.23-5.16(m,1H),4.93-4.90(m,1H),4.61-4.58(d,1H,J＝10.0Hz),3.74(s,3H),2.05-2.04(m,9H)。

步骤2：

在三口瓶中加入化合物2(12.0g，35.9mmol)，二氯甲烷(150mL)，冰浴氮气保护下加入三氯乙腈(25.8g，180mmol)，DBU(2.18g，14.4mmol)，溶液变为褐色，自然回温至室温搅拌6小时，TLC显示反应完全，加入三乙胺终止反应。直接湿法硅胶柱层析(硅胶柱先用0.5％三乙胺/石油醚洗脱液润湿)纯化(石油醚/乙酸乙酯＝5：1-3：1-1：1)，快速过柱得化合物3粗品(12g，收率70％)。

¹HNMR CDCl₃δ:8.75(s,1H),6.66-6.65(d,1H,J＝2.8Hz),5.67-5.62(m,1H),5.29-5.26(m,1H),5.18-5.15(m,1H),4.53-4.51(d,1H,J＝10.4Hz),3.77(s,3H),2.10-2.03(m,9H)。

步骤3：

在单口瓶中加入化合物4(20.0g，102mmol)，化合物4A(15.5g，102mmol)，乙醋酐(47.8g，469mmol)，三乙胺(6.9g，68.4mmol)，130-140℃加热回流15小时，停止反应，降温至90℃，加入水(26mL)回流1小时，减压蒸除溶剂，残留物加二氯甲烷(100mL)稀释，1N盐酸洗(50mL)，用二氯甲烷(100mL)萃取水层，合并有机相，1N盐酸(50mL)洗有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，蒸除溶剂，加甲苯回流溶解，冰箱内冷藏一夜，过滤，乙醚洗滤饼，得浅黄色化合物5(30g，收率79％)。

¹HNMR d6-DMSOδ:12.50-12.46(m,1H),7.71(s,1H),7.10-6.92(m,3H),6.90-6.66(m,2H),6.62-6.61(d,1H,J＝2.8Hz),3.84-3.73(m,6H),3.53(s,3H,),3.77(s,3H),2..27(s,3H)。

步骤4：

在三口瓶中加入化合物5(10.0g，26.9mmol)，DCM(二氯甲烷)(200mL)，化合物5A(3.70g，26.9mmol)，HOBT(1-羟基苯并三唑)(4.40g，32.3mmol)，EDCI(1-乙基-3(3-二甲基丙胺)碳二亚胺)(7.70g，40.3mmol)，三乙胺(6.80g，67.2mmol)，然后在10℃搅拌7小时，TLC显示反应完全。反应体系用水洗(50mL×3)，饱和氯化钠(50mL)洗，无水硫酸钠干燥，过滤蒸除溶剂得粗品，粗品用硅胶柱层析纯化(石油醚：乙酸乙酯＝5:1)得化合物6(6.00g，收率45％)。

¹HNMR CDCl₃δ:7.81(s,1H),6.93-6.87(m,5H),6.79-6.72(m,3H),6.63-6.59(m,1H),5.80-5.66(m,2H),3.71(s,3H),3.62(s,3H),3.54-3.31(m,2H),3.45(s,3H),2.73-2.69(m,2H),2..28(s,3H)。

步骤5：

在三口瓶中加入化合物6(5.00g，10.2mmol)，化合物3(9.70g，20.4mmol)，4A分子筛(24.0g)，无水二氯甲烷(1500mL)，-20℃氮气保护下滴入BF₃.Et₂O(2.89g，20.4mmol)，-20℃搅拌2小时后，TLC显示反应完全，加入1滴三乙胺终止反应。过滤，二氯甲烷洗滤饼，有机相依次水洗(30mL)，饱和氯化钠洗(30mL)，无水硫酸钠干燥，过滤，蒸除溶剂，硅胶柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝6:1)，得化合物7(6g，收率73％)。

¹HNMR CDCl₃δ:7.78(s,1H),6.99-6.97(m,2H),6.93-6.85(m,5H),6.76-6.71(m,1H),6.60-6.57(m,2H),5.60-5.57(m,1H),5.35-5.25(m,3H),5.10-5.08(d,1H,J＝7.6Hz),4.19-4.09(m,1H),3.78-3.69(m,6H),3.59(s,3H),3.54-3.46(m,2H),3.43(s,3H),2.74-2.67(m,2H),2..25(s,3H),2.07-2.05(m,9H)。

步骤6：

化合物7(6.00g，7.44mmol)溶于甲醇/水(135mL，v/v＝2:1)，加入Na₂CO₃(12.3g，119mmol)，室温搅拌过夜。LCMS监测反应完成。将反应液旋干，将用水溶解，反应液用1N盐酸调节pH＝5-6，过滤，滤饼为粗品，粗品用prep-HPLC纯化得化合物I(Target 1，T1)(1.1g，收率23％)。

¹HNMR CD₃ODδ:7.56(s,1H),7.03-7.05(m,4H),6.96-6.98(m,2H),6.70-6.73(m,1H),6.62-6.67(m,2H),6.44-6.48(m,2H),4.93-4.95(m,1H),3.99-4.01(d,1H),3.73(s,3H),3.61-3.67(m,4H),3.46-3.53(m,4H),3.43(s,3H),2.72-2.75(t,2H).

LC-MS:m/z＝626(M+1)。

试验例1

本试验例评价并比较芬乐胺(FLZ)及其本发明的芬乐胺21位代谢物的体外抗氧化、抗神经炎症和神经保护活性。

1、实验方法

1.1、脂质过氧化产物丙二醛(MDA)含量的测定

制备肝微粒体：大鼠肝组织称重后，用Tris-HC1缓冲液制备10％匀浆，以差数离心法分离出肝脏微粒体。

实验设空白组、模型组、FLZ组和FLZ 21位代谢物组，每组设置3个复孔。每管加入PBS缓冲液、肝微粒体、半胱氨酸及受试药溶液。受试药组每管加FLZ或FLZ21位代谢物，终浓度分别为1×10^-4、1×10^-5和1×10^-6M，空白组、模型组每管加同体积的DMSO。于37℃水浴震荡15min，模型组和加药组每管加1×10^-2M FeSO₄溶液，空白组加同体积PBS缓冲液，继续于37℃水浴震荡15min。后每管加入TCA溶液、TBA溶液，100℃水浴10min。于8000rpm离心10min。取上清液于532nm处测吸光度(OD)。

1.2、抗神经炎症给药及一氧化氮(NO)含量的检测

BV₂细胞于含10％胎牛血清的DMEM培养基中，置于37℃，5％CO₂的培养箱中培养。选取对数生长期细胞分为空白组、模型组、FLZ组和FLZ 21位代谢物组，每组设置3个复孔。加入不同浓度的FLZ或FLZ 21位代谢物(终浓度1×10^-5，1×10^-6，1×10^-7M)，空白组、模型组加同体积的DMSO，1h后模型组和加药组加入500ng/mL LPS孵育24h，空白组加同体积PBS缓冲液。每孔吸取100μL培养基，加入配置好的Griess试剂，室温静置20min。各组于540nm处测其吸光度值(OD值)。利用标准曲线将吸光度转换成NO浓度值带入公式计算。

NO抑制率＝[1-(C_{待测化合物}-C_空白)/(C_模型-C_空白]×100％

1.3、神经保护给药及细胞存活率的测定

SH-SY5Y神经细胞培养于含10％胎牛血清的DMEM培养基中，置于37℃，含5％CO₂的培养箱中培养。选取对数生长期细胞进行实验。将SH-SY5Y细胞分为空白组、模型组、FLZ组和FLZ 21位代谢物组，各组设3个复孔。加入不同浓度的FLZ或FLZ 21位代谢物(终浓度1×10^-5，1×10^-6，1×10^-7M)，1h后模型组和加药组加入8mM MPP⁺孵育24h，空白组加同体积PBS缓冲液。吸弃上清液，每孔加MTT(0.5mg/mL)100μL，继续孵育4h，于570nm波长，在酶标仪上测定吸光度值(OD值)。

有效率％＝(OD_{待测化合物}-OD_模型)/(OD_空白-OD_模型)×100％

2、实验结果

2.1、FLZ 21位代谢物对脂质过氧化的影响

在体外肝微粒体脂质抗氧化实验中，FLZ 21位代谢物T1对MDA的生成有一定的抑制作用，并具有一定的剂量效应关系(表1)。

表1.FLZ 21位代谢物体外抗氧化活性结果

2.2、FLZ及其FLZ 21位代谢物对NO释放的影响

LPS刺激BV2小胶质细胞后，培养基中NO的水平明显升高，FLZ及其FLZ 21位代谢物T1对BV2细胞释放NO有一定的抑制作用，且T1对NO的释放抑制作用强于FLZ(表2)。

表2.FLZ及FLZ 21位代谢物体外抗神经炎活性结果

2.3、FLZ及其FLZ 21位代谢物对细胞存活率的影响

SH-SY5Y细胞加入MPP⁺后细胞存活率明显降低，FLZ对细胞损伤表现出一定的保护作用，且具有剂量效应关系。T1也表现出一定保护作用，且T1效果优于FLZ(表3)。

表3.FLZ及FLZ 21位代谢物体外神经保护活性结果

3、结论

FLZ 21位代谢物具有一定的抗氧化、抗神经炎症及神经保护活性，其中高浓度效果较好，并且具有剂量依赖性。FLZ 21位代谢物在抗神经炎症及神经保护活性药效高于FLZ。