具有人源化cd19 scfv的car-t细胞
阅读说明：本技术 具有人源化cd19 scfv的car-t细胞 (CAR-T cells with humanized CD19SCFV ) 是由 吴力军 维塔·格鲁博斯卡娅 于 2020-02-26 设计创作，主要内容包括：本发明涉及人源化CD19单链可变片段(scFv),其包括SEQ ID NO:8的氨基酸序列。本发明还涉及CD19嵌合抗原受体融合蛋白,其从N末端到C末端包括：(i)本发明的单链可变片段(scFv)、(ii)跨膜结构域、(iii)至少一个共刺激结构域,和(iv)激活结构域。本发明的人源化抗CD19scFv显示出对CD19的选择性和高亲和力结合。基于本发明的人源化scFv的CD19-CART细胞可用于治疗患有包括白血病和淋巴瘤的B细胞恶性肿瘤患者。(The present invention relates to a humanized CD19 single chain variable fragment (scFv) comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8. The present invention also relates to a CD19 chimeric antigen receptor fusion protein comprising, from N-terminus to C-terminus: (i) a single chain variable fragment (scFv) of the invention, (ii) a transmembrane domain, (iii) at least one costimulatory domain, and (iv) an activation domain. The humanized anti-CD 19scFv of the invention showed selective and high affinity binding to CD 19. CD19-CART cells based on the humanized scFv of the present invention can be used to treat patients with B cell malignancies including leukemia and lymphoma.)
具体实施方式
定义
如本文所用，“嵌合抗原受体(CAR)”是一种受体蛋白，其已进行改造以赋予T细胞靶向特定蛋白的新能力。该受体是嵌合的，因为它们将抗原结合和T细胞激活功能组合到单个受体内。CAR是一种融合蛋白，其包括能够与抗原结合的胞外结构域、跨膜结构域和至少一个胞内结构域。“嵌合抗原受体(CAR)”有时被称为“嵌合受体”、“T体(T-body)”或“嵌合免疫受体(CIR)”。“能够与抗原结合的胞外结构域”意指可以与某种抗原结合的任何寡肽或多肽。“细胞内结构域”意指已知充当结构域的任何寡肽或多肽，其传递信号以激活或抑制细胞中的生物过程。
如本文所用，“CDR”是抗体的VH或VL链的互补决定区，其对于与抗原结合是至关重要的。
如本文所用，“人源化抗体”是来自非人物种的抗体，其蛋白质序列已进行修饰，以增加其与人体内天然产生的抗体变体的相似性。
如本文所用，“结构域”意指多肽中的一个区域，其独立于其它区域而折叠成特定结构。
如本文所用，“单链可变片段(scFv)”意指衍生自保留抗原结合能力的抗体的单链多肽。scFv的实例包括如下所述的抗体多肽，其通过重组DNA技术形成，并且其中免疫球蛋白重链(H链)和轻链(L链)片段的Fv区经由间隔区序列相连接。用于改造scFv的各种方法是本领域技术人员已知的。
如本文所用，“肿瘤抗原”意指具有抗原性的生物分子，其表达导致癌症。
本发明人已从源自杂交瘤细胞系FMC63的小鼠单克隆抗体的重链和轻链可变区开始设计人源化CD19 scFv[6]。本发明人已制备了人源化CD19-CAR-T 细胞，以靶向过表达CD19抗原的癌细胞。本发明的人源化CD19-CAR-T细胞分泌高水平的针对白血病癌细胞的IFN-γ。本发明的人源化CD19-CAR-T细胞杀伤Hela-CD19阳性靶细胞，但并不杀伤对照Hela细胞。
本发明涉及人源化抗人CD19抗体，其分别包括具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的人源化VL、以及具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的人源化VH。
在一个实施方案中，人源化抗人CD19抗体是单链可变片段(scFv)。ScFv 可以是VH-接头-VL或VL-接头-VH。优选的scFv是VL-接头-VH。
本发明还涉及嵌合抗原受体融合蛋白，其从N末端到C末端包括：(i) 针对CD19的单链可变片段(scFv)(本发明)，(ii)跨膜结构域，(iii)至少一个共刺激结构域，和(iv)激活结构域。
在一个实施方案中，CAR结构如图2所示。
在一个实施方案中，共刺激结构域选自由CD28、4-1BB、GITR、ICOS-1、 CD27、OX-40和DAP10组成的组。优选的共刺激结构域是CD28。
优选的激活结构域是CD3ζ(CD3 Z或CD3 zeta)。
跨膜结构域可以源自天然多肽，或者可以是人工设计的。源自天然多肽的跨膜结构域可以从任何膜结合蛋白或跨膜蛋白获得。例如，可以使用T细胞受体α或β链、CD3ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、 CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、ICOS、CD154 或GITR的跨膜结构域。人工设计的跨膜结构域是主要包括亮氨酸和缬氨酸等疏水性残基的多肽。优选在合成跨膜结构域的每一端处发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。可选地，在跨膜结构域和细胞内结构域之间可以设置短的寡肽接头或多肽接头(例如长度为2-10个氨基酸的接头)。在一个实施例中，可以使用具有甘氨酸-丝氨酸连续序列的接头序列。
本发明提供了编码CD19-CAR的核酸。编码CAR的核酸可以通过常规方法由特定CAR的氨基酸序列进行制备。编码氨基酸序列的碱基序列可以从关于每个结构域的氨基酸序列的上述NCBI RefSeq ID或GenBank登录号获得，本发明的核酸可以使用标准分子生物学和/或化学程序进行制备。例如，可以基于碱基序列合成核酸，并且通过使用聚合酶链反应(PCR)将从cDNA文库获得的DNA片段组合，以制备本发明的核酸。
可以将编码本发明的CAR的核酸插入载体内，并将该载体引入细胞内。例如，可以使用病毒载体，例如逆转录病毒载体(包括肿瘤逆转录病毒载体、慢病毒载体和假型载体)、腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、猿猴病毒载体、牛痘病毒载体、或仙台病毒载体、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)载体和HSV 载体。优选使用缺乏复制能力从而不在受感染细胞中自我复制的病毒载体。
例如，当使用逆转录病毒载体时，可以基于由载体具有的LTR序列和包装信号序列选择合适的包装细胞，并使用该包装细胞制备逆转录病毒颗粒。包装细胞的实例包括PG13(ATCC CRL-10686)、PA317(ATCC CRL-9078)、GP+E-86 和GP+envAm-12和Psi-Crip。还可以使用具有高转染效率的293细胞或293T 细胞来制备逆转录病毒颗粒。基于逆转录病毒和可以用于包装逆转录病毒载体的包装细胞生产的多种逆转录病毒载体，可以从许多公司广泛地商购。
CAR-T细胞经由CAR与特异性抗原结合，将信号传递到细胞内，由此激活细胞。表达CAR的细胞的激活根据宿主细胞的种类和CAR的胞内结构域而变化，并且可以基于例如细胞因子的释放、细胞增殖率的改善、细胞表面分子的变化等等作为指标进行确认。例如，从激活细胞中释放细胞毒性细胞因子(肿瘤坏死因子、淋巴毒素等)会破坏表达抗原的靶细胞。另外，细胞因子的释放或细胞表面分子的变化刺激其它免疫细胞，例如B细胞、树突状细胞、NK细胞和巨噬细胞。
表达CAR的细胞可以用作用于疾病的治疗剂。治疗剂包括表达CAR的细胞作为活性成分，并且它可以进一步包括合适的赋形剂。
本发明的人源化CD19-ScFv(克隆6抗体)相对于小鼠CD19-ScFv(FMC63) 的优点在于人源化CD19 scFv对人的免疫原性较低。本发明的人源化 CD19-CAR-T细胞比小鼠CD19-CAR-T细胞更好地延长了Raji异种移植瘤小鼠模型的存活。
本文的人源化CD19 ScFv可以用于免疫治疗应用：毒素/药物偶联的抗体、单克隆治疗性抗体和CAR-T细胞免疫疗法。
使用本文的人源化CD19 ScFv的人源化CD19-CAR-T细胞有效靶向CD19 阳性癌细胞系中的CD19抗原。
人源化CD19-CAR-T细胞可以与不同的化学疗法组合使用：检查点抑制剂、靶向疗法、小分子抑制剂和抗体。
人源化CD19-CAR-T细胞可以在临床上用于CD19阳性癌细胞。
对诸如CD28、4-1BB等共刺激结构域的修饰可以用于增加CAR-T细胞的功效。标签偶联的人源化CD19 scFv可以用于CAR生成。
人源化CD19-CAR-T细胞可以与不同的安全开关(例如t-EGFR、RQR(利妥昔单抗-CD34-利妥昔单抗)、诱导型半胱天冬酶-9等)一起使用。
第三代CAR-T或其它共刺激信号传导结构域可以用于相同的人源化 CD19-scFv，以制备CD19-CAR-T。
人源化CD19 CAR可以与靶向其它肿瘤抗原或肿瘤微环境的CAR(例如 VEGFR-1-3、PDL-1)组合，生成具有CD19和CD3或者其它抗原的双特异性抗体用于治疗。
人源化CD19-CAR可以用于制备其它类型的细胞，诸如CAR-天然杀伤 (NK)细胞、CD19-CAR-巨噬细胞和其它CD19-CAR造血细胞，其可以靶向 CD19阳性癌症。本发明提供了被修饰以表达CD19-CAR的T细胞、NK细胞、巨噬细胞或造血细胞。
人源化CD19-CAR-T细胞可以针对癌症干细胞或肿瘤起始细胞使用，所述癌症干细胞或肿瘤起始细胞针对化学疗法最具抗性并形成侵袭性肿瘤。
下述实施例进一步说明了本发明。这些实施例仅用于说明本发明，而不应被解释为限制性的。
实施例
本发明人在慢病毒载体内部制备了人源化CD19-ScFv-CAR构建体，克隆到慢病毒载体的Xba I和Eco R I位点内。慢病毒CAR构建体含有插入在Xba I 和Eco RI克隆位点之间的人源化CD19 ScFv(克隆6)-41BB-CD3ζ片段。
慢病毒在293T细胞中制备，并且通过RT-PCR确定滴度。然后使用等剂量的慢病毒用于T细胞的转导。
实施例1.人源化CD19 VH和VL以及scFv序列
本发明人已将源自小鼠CD19 FMC63 scFv克隆的CD19 scFv人源化[6]，并且基于体内数据的功效选择了克隆6。人源化CD19 scFv的结构是：VL-接头 -VH。
SEQ ID NO:2是人源化CD19 VL的核苷酸序列。SEQ ID NO:4是VH的核苷酸序列。SEQID NO:3是编码接头的核苷酸序列。
SEQ ID NO:5是人源化CD19 VL的氨基酸序列。SEQ ID NO:7是人源化 CD19 VH的氨基酸序列。SEQ ID NO:6是接头的氨基酸序列。CDR区是加下划线的。
SEQ ID NO:8显示了克隆6的人源化CD19 scFV的氨基酸序列(VL-接头 -VH)
实施例2.人源化CD19-CAR序列
人源化CD19-CAR构建体的方案如图2所示。使用具有EF1a启动子的慢病毒载体用于人源化scFv CAR序列的克隆。
下述核苷酸序列和氨基酸序列显示了本发明的CD8前导区-人源化CD19 ScFv-CD8铰链-TM8-41BB-CD3ζ。CAR结构包括人CD8信号肽、人源化CD19 scFv(VL-接头-VH)、CD8铰链、CD8跨膜(TM)、41BB共刺激和CD3ζ激活结构域(图2)。
<CD8前导区>
核苷酸
氨基酸
<人源化CD19 scFV，VL-接头-VH>
参见实施例1
<CD8铰链>
核苷酸
氨基酸
<CD8跨膜>
核苷酸
氨基酸
<41-BB-共刺激结构域>
核苷酸
氨基酸
<CD3ζ>
核苷酸
氨基酸：
<EcoRI限制性酶切位点>
gaattc
人源化CD19-4-1BB-CD3-CAR蛋白的氨基酸序列如下所示：信号肽为斜体，接头为加下划线的；CD8铰链为粗体；CD8 TM为斜体加下划线的；41BB 为粗斜体；CD3为加下划线且粗体的。
实施例3.CAR慢病毒的制备
合成了编码CAR的DNA，并且将其亚克隆到具有EF1a启动子的第三代慢病毒载体内。所有CAR慢病毒构建体都在两个方向上进行测序，以确认CAR 序列，并且用于慢病毒制备。将1×107个HEK293FT细胞(Thermo Fisher)接种到T75烧瓶内并培养过夜，然后使用CalPhos转染试剂盒(Takara，Mountain View，CA)，加入pPACKH1 Lentivector包装混合液(System Biosciences，Palo Alto，CA)，以及10μg的每种慢病毒载体进行转染。第二天用新鲜培养基替换培养基，48小时后收集含有慢病毒的培养基。通过以2100g离心30分钟清除培养基中的细胞碎片。病毒颗粒通过以112,000g离心100分钟进行收集，悬浮于AIM V培养基中，等分并且在-80℃下冷冻。根据制造商的方案和7900HT 热循环仪(Thermo Fisher)，使用Lenti-X qRT-PCR试剂盒(Takara)，通过定量RT-PCR确定病毒制剂的滴度。慢病毒滴度为>1×108pfu/ml。
实施例4.CAR-T细胞的制备和扩增
PBMC以1×106个细胞/ml悬浮于含有10％FBS和300U/ml IL-2(Thermo Fisher)的AIM V-AlbuMAX培养基(Thermo Fisher)中，与相等数目(1:1比率)的CD3/CD28磁珠(ThermoFisher)混合，并且在未处理的24孔板(0.5ml/ 孔)中进行培养。在24和48小时，连同1μlTransPlus转导增强剂(AlStem) 一起，将慢病毒以感染复数(MOI)5加入培养物中。随着T细胞在接下来的两周内增殖，每2-3天对细胞进行计数，并且向培养物中加入具有300U/mlIL-2 的新鲜培养基，以将细胞密度维持在1-3×106个细胞/ml。
实施例5.流式细胞术
为了测量CAR表达，将0.5×106个细胞悬浮于100μl缓冲液(含有0.5％ BSA的PBS)中，并且在冰上与1μl人血清(Jackson Immunoresearch，West Grove，PA)一起孵育10分钟。然后加入1μl别藻蓝蛋白(APC)标记的抗 CD3(eBioscience，SanDiego，CA)和2μl藻红蛋白(PE)标记的山羊抗小鼠或抗人F(ab)2或者同种型对照抗体，并且使细胞在冰上孵育30分钟。细胞用3ml缓冲液冲洗，然后悬浮于缓冲液中，用FACSCalibur(BD Biosciences) 测定。对比F(ab)2染色或同种型对照染色，对CD3染色细胞进行分析。
实施例6.表达CAR的人源化CD19-CAR-T细胞。
我们设计了具有实施例2所示的人源化CD19-CAR构建体的人源化 CD19-CAR-T细胞。我们使用具有无关ScFv的模拟ScFv，并且制备模拟-CAR-T 细胞作为阴性对照。
在利用慢病毒将人源化CD19 CAR转导到T细胞内之后，如[4]中所述，利用山羊抗人F(ab)2抗体通过FACS分析，检测人源化CD19-CAR构建体。约60％的CAR-T细胞使用抗人F(ab)2抗体通过FACS分析呈阳性，表明CAR 被表达且可检测。
实施例7.人源化CD19-CAR-T细胞杀伤Hela-CD19细胞而不是Hela细胞。
我们将本发明的人源化效应CD19-CAR-T细胞与靶Hela-CD19靶细胞以及 Hela(CD19阴性)对照细胞一起孵育，并且如[4]中所述进行实时细胞毒性测定(RTCA)。
人源化CD19-CAR-T细胞特异性杀伤Hela-CD19细胞，因为靶细胞的数目 (细胞指数)在CAR-T细胞作用下显著降低，但没有在T细胞或模拟CAR-T 细胞作用下显著降低(图3)。
在单独的实验中，人源化CD19-CAR-T细胞未杀伤CD19阴性Hela细胞，并且在杀伤CD19阴性Hela细胞方面，T细胞、模拟CAR-T细胞和CAR-T细胞之间不存在显著差异。这证实了人源化CD19-CAR-T细胞对靶向CD19抗原具有高特异性，仅杀伤CD19阳性细胞而不是CD19阴性Hela细胞(数据未显示)。
实施例8.人源化CAR-T细胞靶向Hela-CD19细胞分泌IFN-γ。
我们在人源化CD19-CAR-T细胞与靶Hela-CD19共孵育后收集上清液，并如[5]所述，进行IFN-γ测定。人源化CD19-CAR-T细胞对于Hela-CD19分泌的 IFN-γ明显高于通过T细胞和模拟CAR-T细胞分泌的IFN-γ(图4)。人源化 CD19-CAR-T细胞分泌的IFN-γ水平与小鼠CD19-CAR-T细胞相当，表明它们在分泌IFN-γ方面的相似活性(图4)。
实施例9.人源化CD19-CAR-T细胞在体内降低Raji异种移植瘤生长。
我们将Raji-荧光素酶阳性细胞静脉注射到NSG-小鼠内，然后第二天注射了1×107个人源化CD19-CAR-T细胞，如[4]所述。我们使用IVIS系统通过成像检测Raji异种移植瘤细胞的生长。与对照PBS和模拟-CAR-T细胞相比，人源化CD19-CAR-T细胞显著降低了Raji异种移植瘤的生长(图5)。与小鼠CD19-CAR-T细胞相比，用人源化CD19-CAR-T细胞对于Raji肿瘤生长降低地更明显(图5)。
在第14天的定量成像如图6所示，其表明小鼠和人源化CD19-CAR-T细胞两者均显著降低了成像信号总通量(以光子/秒计)。
实施例10.与用小鼠CD19-CAR-T细胞治疗的小鼠相比，人源化 CD19-CAR-T细胞延长了Raji异种移植瘤模型小鼠存活时间。
实施例9的结果的卡普兰-迈耶存活曲线表明：与对照模拟治疗的小鼠相比，在注射人源化CD19-CAR-T细胞(克隆6)后小鼠存活显著增加。相对于模拟 CAR-T细胞(7，上图)，人源化CD19-CAR-T细胞(p＝0.0072)(图7，下图) 相比小鼠CD19-CAR-T细胞(p＝0.0294)的存活更显著地增加。这证实了与小鼠CD19-CAR-T细胞相比，人源化CD19-CAR-T细胞具有更高功效的优点。
实施例11.CD19-CAR-T细胞在体内注射到小鼠后，用CD19或FAB抗体进行FACS检测
在将人源化CD19-CAR-T细胞或小鼠CD19-CAR-T细胞注射到具有Raji 异种移植瘤细胞的小鼠体内7天后，收集小鼠血液以测试CD19-CAR-T细胞的存在。兔抗FMC63抗体用于检测小鼠CD19-CAR-T细胞。山羊抗人(Fab'2) 抗体(Promab Biotechnologies，Inc.)用于检测人源化CD19-CAR-T细胞。
结果显示于图8中。人源化CD19-CAR-T细胞和小鼠CD19-CAR-T细胞两者在注射到小鼠体内7天后均容易检测到。人源化CD19-CAR-T的持久性优于小鼠-CAR-T细胞。CAR-T细胞在体内的持久性与显著降低Raji异种移植瘤生长一致。
参考文献
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序列表
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湖南远泰生物技术有限公司
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<160> 19
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 556
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
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Leu Gly Gly Leu Gly Cys Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 7
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr
20 25 30
Gly Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 8
<211> 245
<212> PRT
<213> 智人
<400> 8
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly
100 105 110
Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Gln
115 120 125
Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser
145 150 155 160
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Val Ile
165 170 175
Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Phe
180 185 190
Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn
195 200 205
Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr
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Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
225 230 235 240
Val Thr Val Ser Ser
245
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<211> 63
<212> DNA
<213> 智人
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atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccg 63
<210> 10
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<212> PRT
<213> 智人
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Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
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His Ala Ala Arg Pro
20
<210> 11
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 11
accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60
tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120
gacttcgcct gtgat 135
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 12
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
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<212> DNA
<213> 智人
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atctacatct gggcgcccct ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 60
accctttact gc 72
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 14
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
20
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<212> DNA
<213> 智人
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aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60
actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120
gaactg 126
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 16
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1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
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Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
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<212> DNA
<213> 智人
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agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc 60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgctaat ag 342
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<212> PRT
<213> 智人
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Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
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Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
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<213> 智人
<400> 19
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20 25 30
Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln
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50 55 60
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65 70 75 80
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485