阅读说明：本技术 一种罗布麻无菌苗茎段高效诱导试管苗的培育方法 (Cultivation method for apocynum aseptic seedling stem section high-efficiency induction test-tube seedling ) 是由 梁美霞 张洪霞 宋志忠 李建召 刘晓华 贺奥 李权龙 岳红丽 孟凡雅 于 2021-08-17 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种罗布麻无菌苗茎段高效诱导试管苗的培育方法,包括罗布麻初始无菌苗的获得、罗布麻初始无菌苗的茎段进行愈伤组织和芽的诱导、愈伤组织上产生的新芽进行茎尖增殖培养获得大量的二代芽、二代芽同时进行下一轮的增殖培养和生根培养获得试管苗等步骤。本发明对于罗布麻的繁殖不受季节时间限制,一年四季均可进行,平均一代繁殖系数≥34,分化出大量的新芽可用于继代循环,实现了试管苗数目呈几何级数增长,有利于罗布麻优质种苗的大量快速繁殖,简化了罗布麻的育苗程序,大大节约了人力和生产成本,为罗布麻种苗工程和基因工程提供了强有利的技术支持和保障。(The invention discloses a cultivation method of apocynum aseptic seedling stem section high-efficiency induction test-tube plantlet, which comprises the steps of obtaining apocynum aseptic seedling, inducing callus and buds of the stem section of the apocynum aseptic seedling, performing stem tip enrichment culture on new buds generated on the callus to obtain a large number of second-generation buds, simultaneously performing the next round of enrichment culture and rooting culture on the second-generation buds to obtain the test-tube plantlet and the like. The method is not limited by season time for the apocynum venetum breeding, can be carried out all the year round, has the average generation breeding coefficient of more than or equal to 34, differentiates a large number of new buds for subculture circulation, realizes the increase of the number of test-tube seedlings in geometric progression, is favorable for the rapid breeding of a large number of apocynum venetum high-quality seedlings, simplifies the seedling raising procedure of the apocynum venetum, greatly saves labor and production cost, and provides strong and favorable technical support and guarantee for apocynum venetum seedling engineering and genetic engineering.)

一种罗布麻无菌苗茎段高效诱导试管苗的培育方法

技术领域

本发明涉及一种罗布麻无菌苗茎段高效诱导试管苗的培育方法。

背景技术

罗布麻(Apocynumvenetum L.)是夹竹桃科罗布麻属，是我国珍贵的植物资源，因产于罗布泊而得名。

罗布麻具有极高的药用价值，具有提高免疫力、安神助眠、降压降脂、解酒保肝、镇咳平喘、软化血管等功效。罗布麻具有“纤维之王”之称，纤维柔韧细长，其具备棉的柔软，麻的爽滑，丝的光泽，纺织品对皮肤病和妇科疾病有很好的防治作用。由于罗布麻在药用、纺织等方面具有重要的价值，在经济利益的驱动下，人们对野生罗布麻进行掠夺式采挖，导致野生罗布麻种质资源越来越匮乏。因此，通过人工种植驯化罗布麻是解决野生资源短缺的有效途径。人工种植罗布麻短时间内需要获得大量优质的罗布麻种苗，传统的罗布麻种苗繁殖方法有种子繁殖、切根和分株繁殖。传统的繁殖方法具有种苗质量差、苗木不一致、参差不齐、周期长、繁殖系数低、成本高等缺点。另外，为了提高罗布麻的药效成分和纤维产量，可以通过现代生物技术也就是基因编辑技术短时间内实现罗布麻重要经济性状的改良。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可加快优质罗布麻野生资源的繁殖速度，提高繁殖系数，缩短繁殖周期的罗布麻无菌苗茎段高效诱导试管苗的培育方法。

本发明的技术解决方案是：

一种罗布麻无菌苗茎段高效诱导试管苗的培育方法，其特征是：包括下列步骤：

（1）罗布麻初始无菌苗的获得

取大田或温室生长条件下的罗布麻茎段，茎段大小为1.5~2cm，于超净工作台上用70-75%乙醇消毒30 ~ 40 s，再用0.1 %的HgCl₂消毒7~ 10 min，然后用无菌水冲洗3～5次，最后将其接种在1号培养基上，培养条件为：光照时间是16h/d，光照强度是1500~2000lx，温度是25±1℃，培养20d后茎段腋芽萌发出新芽；剪取萌发的新芽茎尖，将其接种在2号培养基上继续培养，20d后获得罗布麻初始无菌苗；

（2）罗布麻初始无菌苗的茎段进行愈伤组织和芽的诱导

剪取上述罗布麻初始无菌苗的茎段，茎段大小为1cm-1.5cm，将其接种在3号培养基上，培养条件为：光照时间是12h/d，光照强度是1500 ~ 2000lx，培养温度是25±1℃，一周以后茎段两端切口处产生少量红色的愈伤组织，继续培养10d后，茎段两端切口处产生大量的红色愈伤组织，并从愈伤组织上诱导产生新芽；

（3）愈伤组织上产生的新芽进行茎尖增殖培养获得大量的二代芽；

剪取愈伤组织上诱导萌发的新芽，将其接种在4号增殖培养基上进行培养，培养20d后，新芽基部产生少量的愈伤组织，并从基部产生大量的不同高度的二代芽，新芽高度从1cm-10cm不等，平均每个新芽能增殖达到34个以上的新芽，也就是说增殖系数≥34；

（4）二代芽同时进行下一轮的增殖培养和生根培养获得试管苗

对于获得的大量二代芽根据芽的高度大小进行不同的培养；对于高度小于2cm的所有二代芽，可以分别将其切下接种在4号增殖培养基上继续培养增殖，备用；高度≥3cm的二代芽直接剪取无菌苗茎段，茎段大小仍为1cm-1.5cm，将其接种在3号培养基上，进行下一轮的循环培养；高度在2-3cm的二代芽，可以直接切下放在5号培养基上进行生根培养，培养15-20d即可获得大量生根的试管苗。

1号培养基组成为：MS + 6-BA 0.6mg/L + NAA 0.1mg/L+蔗糖30g/L + 琼脂7.5g/L，pH值为5.8；2号培养基组成为：MS + 6-BA 3mg/L + TDZ0.1mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖30g/L + 琼脂7.5g/L，pH值为5.8；3号培养基组成为：MS + 6-BA 3mg/L + IBA 0.4mg/L+TDZ0.6mg mg/L+蔗糖20g/L + 琼脂7.5g/L，pH值为5.8；4号增殖培养基组成为：MS + 6-BA2mg/L + IBA 0.2mg/L+TDZ0.4mg mg/L+蔗糖20g/L + 琼脂7.5g/L，pH值为5.8；5号培养基组成为：1/2MS+NAA0.5mg/L +蔗糖30g/L + 琼脂7.5g/L，pH值为5.8。

本发明利用罗布麻无菌苗茎段离体培养诱导产生愈伤组织，通过愈伤组织再生产生新芽，然后通过新芽的茎尖进行增殖培养产生大量的新芽，对不同高度的新芽进行增殖、扩繁、生根等处理，最终可以获得进行批量生产试管苗的方法。本发明对于罗布麻的繁殖不受季节时间限制，一年四季均可进行，平均一代繁殖系数≥34，分化出大量的新芽可用于继代循环，实现了试管苗数目呈几何级数增长，有利于罗布麻优质种苗的大量快速繁殖，简化了罗布麻的育苗程序，大大节约了人力和生产成本，为罗布麻种苗工程和基因工程提供了强有利的技术支持和保障。

本发明克服了以往罗布麻通过种子、分株、切根和茎尖繁殖的所有缺点，比如种苗质量不一致、繁殖周期长、繁殖系数低等。另外，也为将来通过农杆菌介导的罗布麻茎段遗传转化进行性状改良提供了很好的技术支持。该发明的培育工艺一年四季均可进行，既可以达到短时间内获得大量性状一致的罗布麻优良种苗，也可为通过基因工程手段获得遗传性状改良的转基因株系奠定基础，为通过基因编辑技术提高罗布麻药用成分、高质量纤维植物提供技术保障。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

图1是大田茎段于培养基上培养20d后萌发出新芽的示意图。

图2是剪取萌发的新芽培养20d后获得的初始无菌苗示意图。

图3是剪取初始无菌苗茎段于培养基上生长15-18d后示意图。

图4是从愈伤组织上剪取的茎尖培养20d后获得的二代芽示意图。

图5是生根的试管苗示意图。

具体实施方式

一种罗布麻无菌苗茎段高效诱导试管苗的培育方法，其特征是：包括下列步骤：

（1）罗布麻初始无菌苗的获得

取大田或温室生长条件下的罗布麻茎段，茎段大小为1.5~2cm，于超净工作台上用70-75%乙醇消毒30 ~ 40 s，再用0.1 %的HgCl₂消毒7~ 10 min，然后用无菌水冲洗3～5次，最后将其接种在1号培养基上，培养条件为：光照时间是16h/d，光照强度是1500~2000lx，温度是25±1℃，培养20d后茎段腋芽萌发出新芽（图1）；剪取萌发的新芽茎尖，将其接种在2号培养基上继续培养，20d后获得罗布麻初始无菌苗（图2）；

（2）罗布麻初始无菌苗的茎段进行愈伤组织和芽的诱导

剪取上述罗布麻初始无菌苗的茎段，茎段大小为1cm-1.5cm，将其接种在3号培养基上，培养条件为：光照时间是12h/d，光照强度是1500 ~ 2000lx，培养温度是25±1℃，一周以后茎段两端切口处产生少量红色的愈伤组织，继续培养10d后，茎段两端切口处产生大量的红色愈伤组织，并从愈伤组织上诱导产生新芽（图3）；

（3）愈伤组织上产生的新芽进行茎尖增殖培养获得大量的二代芽；

剪取愈伤组织上诱导萌发的新芽，将其接种在4号增殖培养基上进行培养，培养20d后，新芽基部产生少量的愈伤组织，并从基部产生大量的不同高度的二代芽，新芽高度从1cm-10cm不等，平均每个新芽能增殖达到34个以上的新芽（图4），也就是说增殖系数≥34；

（4）二代芽同时进行下一轮的增殖培养和生根培养获得试管苗

对于获得的大量二代芽根据芽的高度大小进行不同的培养；对于高度小于2cm的所有二代芽，可以分别将其切下接种在4号增殖培养基上继续培养增殖，备用；高度≥3cm的二代芽直接剪取无菌苗茎段，茎段大小仍为1cm-1.5cm，将其接种在3号培养基上，进行下一轮的循环培养；高度在2-3cm的二代芽，可以直接切下放在5号培养基上进行生根培养，培养15-20d即可获得大量生根的试管苗（图5）。

1号培养基组成为：MS + 6-BA 0.6mg/L + NAA 0.1mg/L+蔗糖30g/L + 琼脂7.5g/L，pH值为5.8；2号培养基组成为：MS + 6-BA 3mg/L + TDZ0.1mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖30g/L + 琼脂7.5g/L，pH值为5.8；3号培养基组成为：MS + 6-BA 3mg/L + IBA 0.4mg/L+TDZ0.6mg mg/L+蔗糖20g/L + 琼脂7.5g/L，pH值为5.8；4号增殖培养基组成为：MS + 6-BA2mg/L + IBA 0.2mg/L+TDZ0.4mg mg/L+蔗糖20g/L + 琼脂7.5g/L，pH值为5.8；5号培养基组成为：1/2MS+NAA0.5mg/L +蔗糖30g/L + 琼脂7.5g/L，pH值为5.8。