一种多肽异二聚体的制备方法
阅读说明：本技术 一种多肽异二聚体的制备方法 (Preparation method of polypeptide heterodimer ) 是由 王玺玫 于 2021-08-05 设计创作，主要内容包括：本申请公开了一种多肽异二聚体的制备方法,包括：以式(I)化合物或其盐类制备式(II)化合物或其盐类；以式(III)化合物或其盐类制备式(IV)化合物或其盐类；以式(IV)化合物或其盐类制备式(V)化合物或其盐类；以式(V)化合物或其盐类制备式(VI)化合物或其盐类；以式(VI)化合物或其盐类制备式(VII)化合物或其盐类；以式(VII)化合物或其盐类制备式(VIII)化合物或其盐类；以式(VIII)化合物或其盐类制备式(IX)化合物或其盐类；以及以式(II)化合物或其盐类及式(IX)化合物或其盐类制备式(X)化合物或其盐类。(The application discloses a preparation method of polypeptide heterodimer, which comprises the following steps: preparing a compound of formula (II) or a salt thereof from a compound of formula (I) or a salt thereof; preparing a compound of formula (IV) or a salt thereof from a compound of formula (III) or a salt thereof; preparing a compound of formula (V) or a salt thereof from a compound of formula (IV) or a salt thereof; preparing a compound of formula (VI) or a salt thereof from a compound of formula (V) or a salt thereof; preparing a compound of formula (VII) or a salt thereof from a compound of formula (VI) or a salt thereof; preparing a compound of formula (VIII) or a salt thereof from a compound of formula (VII) or a salt thereof; preparing a compound of formula (IX) or a salt thereof from a compound of formula (VIII) or a salt thereof; and preparing a compound of formula (X) or a salt thereof from a compound of formula (II) or a salt thereof and a compound of formula (IX) or a salt thereof.)
技术领域
本申请涉及多肽合成领域，更具体涉及一种多肽异二聚体的制备方法。
背景技术
作为一种体内非侵入性的分子生物学过程的可视化、表征和量化技术，分子成像在广泛的诊断和治疗应用领域中获得了重要的地位。分子成像的一个重要问题是开发具有高亲和力和特异性、低非特异性摄取、足够的滞留和有效渗透性的特异性成像示踪剂。在过去的几十年中，由于放射性标记的肽具有良好的特性，包括非凡的组织渗透性、快速清除、低免疫原性、易于合成和低成本，因此在用于诊断和治疗的放射性标记的肽方面进行了大量的研究。
然而，肽类也有一些不可忽视的主要缺点，如肿瘤亲和力相对较低和保留时间较短。为了克服这些缺点，已经开发了多种方法，其中异二聚肽已经成为一种非常有前途的靶向策略。通常，异二聚肽由两个共价连接的肽组成，能够同时结合两个不同的受体。与单体肽相比，双特异性异二聚肽具有多种优越的性质，包括增强的功效、亲和力，以及相对较长的血液循环时间，保证了它们的成像和治疗方面的应用。
发明内容
在一些实施例中，本申请提供了一种多肽异二聚体的制备方法，该多肽异二聚体是式(X)化合物或其盐类。
在一些实施例中，提供了一种化合物的制备方法，包括：制备式(I)化合物或其盐类；以式(I)化合物或其盐类制备式(II)化合物或其盐类；制备式(III)化合物或其盐类；以式(III)化合物或其盐类制备式(IV)化合物或其盐类；以式(IV)化合物或其盐类制备式(V)化合物或其盐类；以式(V)化合物或其盐类制备式(VI)化合物或其盐类；以式(VI)化合物或其盐类制备式(VII)化合物或其盐类；以式(VII)化合物或其盐类制备式(VIII)化合物或其盐类；以式(VIII)化合物或其盐类制备式(IX)化合物或其盐类；以及以式(II)化合物或其盐类及式(IX)化合物或其盐类制备式(X)化合物或其盐类。
在一些实施例中，以式(I)化合物或其盐类制备式(II)化合物或其盐类，包括在乙腈中，pH值为7–8的环境下，将式(I)化合物或其盐类与BCN-PEG4-NHS接触。在一些实施例中，以式(III)化合物或其盐类制备式(IV)化合物或其盐类，包括在二氯甲烷中，将式(III)化合物或其盐类与1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺或其盐类接触。在一些实施例中，以式(IV)化合物或其盐类制备式(V)化合物或其盐类，包括在N,N-二甲基甲酰胺中，将式(IV)化合物或其盐类与水合肼接触。在一些实施例中，以式(V)化合物或其盐类制备式(VI)化合物或其盐类，包括在N,N-二甲基甲酰胺中，将式(V)化合物或其盐类与Fmoc-PEG4-丙酸、PyBop及N,N-二异丙基乙胺接触。在一些实施例中，以式(VI)化合物或其盐类制备式(VII)化合物或其盐类，包括在N,N-二甲基甲酰胺中，将式(VI)化合物或其盐类与哌啶接触。在一些实施例中，以式(VII)化合物或其盐类制备式(VIII)化合物或其盐类，包括在N,N-二甲基甲酰胺中，将式(VII)化合物或其盐类与NOTA(tBu)2-N3及PyBop接触。在一些实施例中，以式(VIII)化合物或其盐类制备式(IX)化合物或其盐类，包括在三氟乙酸中，将式(VIII)化合物或其盐类、水与三异丙基硅烷接触。
在一些实施例中，将式(III)化合物或其盐类与1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺或其盐类接触，是将90.3±10％重量份的式(III)化合物或其盐类与21.0±10％重量份的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺或其盐类室温反应24小时。在一些实施例中，将式(IV)化合物或其盐类与水合肼接触，是将80.2±10％重量份的式(IV)化合物或其盐类与8±10％重量份的水合肼在10–30℃下反应5小时。在一些实施例中，将式(V)化合物或其盐类与Fmoc-PEG4-丙酸、PyBop及N,N-二异丙基乙胺接触，是将64.7±10％重量份的式(V)化合物或其盐类与32.0±10％重量份的Fmoc-PEG4-丙酸、34.2±10％重量份的PyBop混合并滴加17.02±10％重量份的N,N-二异丙基乙胺在10–30℃下反应2小时。在一些实施例中，将式(VI)化合物或其盐类与哌啶接触，是将84.1±10％重量份的式(VI)化合物或其盐类与41.88±10％重量份的哌啶在10–30℃下反应2小时。在一些实施例中，将式(VII)化合物或其盐类与NOTA(tBu)2-N3及PyBop接触，是将60.0±10％重量份的式(VII)化合物或其盐类与25.2±10％重量份的NOTA(tBu)2-N3、27.3±10％重量份的PyBop在10–30℃下反应2小时。在一些实施例中，将式(VIII)化合物或其盐类、水与三异丙基硅烷接触，是将66.0±10％重量份的式(VIII)化合物或其盐类、16.5±10％重量份的水与12.75±10％重量份的三异丙基硅烷室温反应2–3小时。
在一些实施例中，制备式(I)化合物或其盐类，包括：将第一树脂与Fmoc-氨基酸、1-羟基苯并三唑及N,N′-二异丙基碳二亚胺接触，得到缩合后的第一树脂；将缩合后的第一树脂与哌啶接触，得到脱保护后的第一树脂；将脱保护后的第一树脂与三氟乙酸接触，得到式(I)化合物或其盐类的线性肽；及将式(I)化合物或其盐类的线性肽与DMSO接触，得到式(I)化合物或其盐类。在一些实施例中，制备式(III)化合物或其盐类，包括：将第二树脂与Fmoc-氨基酸、1-羟基苯并三唑及N,N′-二异丙基碳二亚胺接触，得到缩合后的第二树脂；将缩合后的第二树脂与哌啶接触，得到脱保护后的第二树脂；及将脱保护后的第二树脂与三氟乙酸接触，得到式(III)化合物或其盐类。
在一些实施例中，制备式(I)化合物或其盐类，包括：将第一树脂与Fmoc-Cys(Trt)-OH、1-羟基苯并三唑及N,N′-二异丙基碳二亚胺接触，得到第一缩合后的第一树脂；将第一缩合后的第一树脂与哌啶接触，得到第一脱保护后的第一树脂；将第一脱保护后的第一树脂与Fmoc-Arg(Pbf)-OH、1-羟基苯并三唑及N,N′-二异丙基碳二亚胺接触，得到第二缩合后的第一树脂；将第二缩合后的第一树脂与哌啶接触，得到第二脱保护后的第一树脂；将第二脱保护后的第一树脂与Fmoc-Gly-OH、1-羟基苯并三唑及N,N′-二异丙基碳二亚胺接触，得到第三缩合后的第一树脂；将第三缩合后的第一树脂与哌啶接触，得到第三脱保护后的第一树脂；将第三脱保护后的第一树脂与Fmoc-Asn(Trt)-OH、1-羟基苯并三唑及N,N′-二异丙基碳二亚胺接触，得到第四缩合后的第一树脂；将第四缩合后的第一树脂与哌啶接触，得到第四脱保护后的第一树脂；将第四脱保护后的第一树脂与Fmoc-Cys(Trt)-OH、1-羟基苯并三唑及N,N′-二异丙基碳二亚胺接触，得到第五缩合后的第一树脂；将第五缩合后的第一树脂与哌啶接触，得到第五脱保护后的第一树脂；将第五脱保护后的第一树脂与Fmoc-Gly-OH、1-羟基苯并三唑及N,N′-二异丙基碳二亚胺接触，得到第六缩合后的第一树脂；将第六缩合后的第一树脂与哌啶接触，得到第六脱保护后的第一树脂；第六脱保护后的第一树脂与三氟乙酸接触，得到式(I)化合物或其盐类的线性肽；及将式(I)化合物或其盐类的线性肽与DMSO接触，得到式(I)化合物或其盐类。在一些实施例中，制备式(III)化合物或其盐类，包括：将第二树脂与Fmoc-Gly-OH、N,N-二异丙基乙胺接触，再与甲醇接触，得到第一缩合后的第二树脂；将第一缩合后的第二树脂与哌啶接触，得到第一脱保护后的第二树脂；将第一脱保护后的第二树脂与Fmoc-Arg(Pbf)-OH、1-羟基苯并三唑及N,N′-二异丙基碳二亚胺接触，得到第二缩合后的第二树脂；将第二缩合后的第二树脂与哌啶接触，得到第二脱保护后的第二树脂；将第二脱保护后的第二树脂与Fmoc-Lys(ivDde)-OH、1-羟基苯并三唑及N,N′-二异丙基碳二亚胺接触，得到第三缩合后的第二树脂；将第三缩合后的第二树脂与哌啶接触，得到第三脱保护后的第二树脂；将第三脱保护后的第二树脂与Fmoc-D-Tyr(tBu)-OH、1-羟基苯并三唑及N,N′-二异丙基碳二亚胺接触，得到第四缩合后的第二树脂；将第四缩合后的第二树脂与哌啶接触，得到第四脱保护后的第二树脂；将第四脱保护后的第二树脂与Fmoc-Asp(OtBu)-OH、1-羟基苯并三唑及N,N′-二异丙基碳二亚胺接触，得到第五缩合后的第二树脂；将第五缩合后的第二树脂与哌啶接触，得到第五脱保护后的第二树脂；及将第五脱保护后的第二树脂与三氟乙酸接触，得到式(III)化合物或其盐类。在一些实施例中，第一树脂是Rink Amide AM树脂。在一些实施例中，第二树脂是二氯三苯甲基氯树脂。在一些实施例中，所述第一树脂是未保护或脱保护的Rink Amide AM树脂。在一些实施例中，所述第二树脂是未保护或脱保护的二氯三苯甲基氯树脂。
在一些实施例中，制备式(X)化合物或其盐类，还包括：对式(X)化合物或其盐类的粗品进行液相色谱梯度洗脱，其流动相包括：0分钟：0.3％乙酸水溶液95％、乙腈5％，5分钟：0.3％乙酸水溶液88％、乙腈12％，85分钟：0.3％乙酸水溶液68％、乙腈32％，及100分钟：0.3％乙酸水溶液50％、乙腈50％。在一些实施例中，制备式(I)化合物或其盐类还包括液相色谱纯化。在一些实施例中，制备式(I)化合物或其盐类，还包括对式(I)化合物或其盐类的粗品进行液相色谱梯度洗脱，其流动相包括：0分钟：0.05％三氟乙酸水溶液98％、乙腈2％，60分钟：0.05％三氟乙酸水溶液78％、乙腈22％，及80分钟：乙腈100％。在一些实施例中，制备式(II)化合物或其盐类，还包括对式(II)化合物或其盐类的粗品进行液相色谱梯度洗脱，其流动相包括：0分钟：0.1％三氟乙酸水溶液95％、乙腈5％，5分钟：0.1％三氟乙酸水溶液85％、乙腈15％，及75分钟：0.1％三氟乙酸水溶液50％、乙腈75％。在一些实施例中，制备式(IX)化合物或其盐类，还包括对式(IX)化合物或其盐类的粗品进行液相色谱梯度洗脱，其流动相包括：0分钟：0.1％三氟乙酸水溶液95％、乙腈5％，5分钟：0.1％三氟乙酸水溶液90％、乙腈15％，及60分钟：0.1％三氟乙酸水溶液70％、乙腈50％。在一些实施例中，制备式(X)化合物或其盐类，还包括对式(X)化合物的三氟乙酸盐进行液相色谱梯度洗脱转盐，包括：以100mmol/L乙酸铵水溶液作为流动相30分钟；以0.1％乙酸水溶液作为流动相20分钟；以及以50％的0.1％乙酸水溶液与50％的乙腈作为流动相。
在一些实施例中，本申请提供了式(I)化合物或其盐类在制备式(X)化合物或其盐类中的用途。在一些实施例中，本申请提供了式(II)化合物或其盐类在制备式(X)化合物或其盐类中的用途。在一些实施例中，本申请提供了式(III)化合物或其盐类在制备式(X)化合物或其盐类中的用途。在一些实施例中，本申请提供了式(IV)化合物或其盐类在制备式(X)化合物或其盐类中的用途。在一些实施例中，本申请提供了式(V)化合物或其盐类在制备式(X)化合物或其盐类中的用途。在一些实施例中，本申请提供了式(VI)化合物或其盐类在制备式(X)化合物或其盐类中的用途。在一些实施例中，本申请提供了式(VII)化合物或其盐类在制备式(X)化合物或其盐类中的用途。在一些实施例中，本申请提供了式(VIII)化合物或其盐类。在一些实施例中，本申请提供了式(IX)化合物或其盐类在制备式(X)化合物或其盐类中的用途。在一些实施例中，制备式(X)化合物是通过本申请公开的制备方法制备的。
在一些实施例中，本申请提供了本申请公开的制备方法在制备用于诊断和治疗的放射性标记的化合物中的用途。
本申请的制备方法，提供了一种产率高且有效的制备方法，此外所选用的纯化也提供了收率高且纯度高的纯化方法。
附图说明
图1为本申请的一些实施例中，制备NGR(式(I)化合物)的反应流程图。
图2为本申请的一些实施例中，反应得到NGR-PEG4-BCN(式(II)化合物)的反应式。
图3为本申请的一些实施例中，制备FP-(ivDde)-RGD(式(III)化合物)的反应流程图。
图4为本申请的一些实施例中，制备N3-NOTA-PEG4-c-RGD(式(IX)化合物)的反应流程图。
图5为本申请的一些实施例中，反应得到NGR-PEG4-click-NOTA-PEG4-c-RGD(式(X)化合物)的反应式。
具体实施方式
为更进一步阐述本申请为了达成预定目的所采取的技术手段及功效，以下结合附图及较佳实施例，对依据本申请的具体实施方式、结构、特征及其功效，详细说明如下。
实施例1
(一)NGR的制备
请参照图1，为本申请的一些实施例中，制备NGR(式(I)化合物)的反应流程图。
1.树脂预处理
(1)溶胀、洗涤：称取334.5g的Fmoc-Rink Amide AM树脂加入反应釜中，加入二氯甲烷作为溶剂，搅拌30分钟。排出反应釜中的液体。再用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)洗涤2次，排出液体。
(2)脱Fmoc保护：向反应釜中加入20％哌啶/DMF溶液，搅拌30分钟之后排出液体。用DMF洗涤6次，排出液体。
2.第一至六次C端氨基酸偶联
(1)缩合：称取适量的Fmoc-氨基酸与1-羟基苯并三唑于5L反应瓶或烧杯中，加入DMF搅拌使分散，降温至-5–5℃，搅拌下加入90mL的N,N′-二异丙基碳二亚胺(DIC)活化5–10min。加入到装有前一步骤产物(预处理树脂或肽树脂)的反应釜中，控温20–30℃搅拌反应4h。反应完全后停止搅拌，排出液体。用DMF洗涤6次，排出液体。
(2)脱Fmoc保护：向反应釜中加入20％哌啶/DMF溶液，在20–30℃下搅拌30分钟，之后排出液体。用DMF洗涤6次，排出液体。
上述缩合及脱Fmoc保护循环进行六次(第一至第六次缩合)。第一至第六次缩合所加入的Fmoc-氨基酸分别可以是Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH，最终获得H-Gly-Cys(Trt)-Asn(Trt)-Gly-Arg(Pbf)-Cys(Trt)-Rink Amide AM树脂。
具体来说，在第一次缩合中，可以称取351.4g的Fmoc-Cys(Trt)-OH与82.1g的1-羟基苯并三唑至反应瓶或烧杯中进行反应缩合Cys；在第二次缩合中，可以称取44.1g的Fmoc-Arg(Pbf)-OH与9.2g的1-羟基苯并三唑至反应瓶或烧杯中进行反应。
在上述的缩合及脱保护步骤之后，可以通过茚三酮检测来检测反应是否完全；反应完全后，可进行下一步工序。取出少量产物于试管中，加入检测试剂A(80g苯酚溶于100mL无水乙醇中)、检测试剂B(5g茚三酮加100mL无水乙醇溶解)、检测试剂C(吡啶)各2滴，100℃加热5min，取出观察。在缩合反应之后的检测，如树脂无色，进行下一步工序；在脱保护反应之后的检测，如树脂显色，进行下一步工序。
(3)获得肽树脂：在进行上述循环完成缩合及脱保护后，向反应釜中加入二氯甲烷洗涤树脂3次，排出液体。用MeOH洗涤3次，排出液体。树脂在反应釜中抽至半干后取出，室温晾干至恒重收料。得肽树脂(H-Gly-Cys(Trt)-Asn(Trt)-Gly-Arg(Pbf)-Cys(Trt)-RinkAmide AM树脂)755.5g。
3.裂解以合成NGR线性粗肽(H-Gly-Cys-Asn-Gly-Arg-Cys-NH2)
称取300.0g肽树脂置于5L反应瓶中，按照10ml/g肽树脂加入裂解试剂(三氟乙酸：1,2-乙二硫醇：水：TIPS＝90:2.5:5:2.5)，在20–30℃下搅拌反应3h。过滤，将滤液加入到8倍约24L甲基叔丁基醚(甲基叔丁基醚放置于-20±5℃中2-4h备用)中搅拌约0.5–1h。过滤，并用甲基叔丁基醚(2L)洗涤滤饼，抽滤至干后于室温晾干15–24h，得疏松的类白色固体粉末，即NGR线性粗肽，99.20g，纯度：70.3％。
4.NGR线性粗肽纯化
以进行液相色谱收集纯化液的方式进行纯化。
设备：成都格莱制备液相色谱仪(型号：GL6000-300mL/min)。色谱柱：ID 100mm*450mm；填料：Unsil-10-100C18 UItra 1200g；填装柱长：250mm，产品编号：GL20190215001A；流速：200mL/min；波长：210nm
样品进样前处理：NGR线性粗肽加水搅拌溶解后使用0.45μm滤膜过滤，作为样品液。样品液浓度为0.04g/mL。
以2％的B相进行色谱柱平衡至基线稳定，平衡15分钟。上样使用C泵上样，上样流速200mL/min。上样结束后，加入纯水冲洗进样管路2min。上样完毕后，运行梯度洗脱：0分钟：A相98％、B相2％，60分钟：A相78％、B相22％，80分钟：A相0％、B相100％。其中A相为0.05％三氟乙酸水溶液(可以通过量取三氟乙酸0.5mL加至1L水中获得)，B相为乙腈。
共进样5针，每针上样约20g。
分段收集目标峰，HPLC检测收集得馏分，收集纯度≥98.0％的纯化液，得NGR线肽纯化液6.34L(含NGR线肽31.9g)。纯度：99.0％；收率：33.2％。
5.形成双硫键，获得NGR(式(I)化合物)
向NGR线肽纯化液中加入1.27L的DMSO，搅拌条件下反应36–72小时。
取样进行HPLC确认是否反应完毕。反应完毕后经标定得27.54g的式(I)化合物。
纯度：92.9％；收率：86.6％。质谱606.2(理论值605.2)。
(二)NGR-PEG4-BCN的制备
请参照图2，为本申请的一些实施例中，将NGR与BCN-PEG4-NHS反应，得到NGR-PEG4-BCN(式(II)化合物)的反应式。
1.NGR-PEG4-BCN(式(II)化合物)的合成
(1)搅拌条件下，加入NGR(式(I)化合物)以及乙腈(3.58L)；
(2)使用NaHCO3调节反应液pH＝7–8；
(3)称双环[6.1.0]壬炔—PEG4—N-羟基琥珀酰亚胺(BCN-PEG4-NHS)(25.7g)，加入乙腈稀释溶解后滴加至反应液中，体系无色澄清，室温下搅拌反应；
(4)反应5h后，取样送检HPLC。反应液纯度：82.4％
2.NGR-PEG4-BCN(式(II)化合物)的纯化
以进行液相色谱收集纯化液的方式进行纯化。
设备：成都格莱制备液相色谱仪(型号：GL6000-300mL/min)。色谱柱：ID 100mm*450mm；填料：Unsil-10-100C18 UItra 1200g；填装柱长：250mm，产品编号：GL20190215001A；流速：200mL/min；波长：210nm
样品进样前处理：35℃条件下浓缩约10.8L反应液至7.2L，使用0.45μm滤膜过滤后分4次上样，每次1.8L(约含12.0g的NGR-PEG4-BCN)。
以2％的B相进行色谱柱平衡至基线稳定，平衡15分钟。上样使用C泵上样，上样流速200mL/min。共进样5针，每针上样约20g。上样结束后，加入纯水冲洗进样管路2min。接着运行梯度洗脱：0分钟：A相95％、B相5％，5分钟：A相85％、B相15％，75分钟：A相50％、B相50％。其中A相为0.1％三氟乙酸水溶液(可以通过量取三氟乙酸1mL加至1L水中获得)，B相为乙腈。
(4)分段收集目标峰，HPLC检测收集得馏分，收集纯度≥97.0％的纯化液备用，共得纯化液5.2L，使用对照品标定含量后，经标定含INT2 26.0g。纯度：97.8％；收率：59.0％；质谱1028.5(理论值1028.4)。
(三)FP-(ivDde)-RGD的制备
请参照图3，为本申请的一些实施例中，制备FP-(ivDde)-RGD(式(III)化合物)的反应流程图。
1.树脂预处理
称取285.9g二氯三苯甲基氯树脂，加入反应釜中，加入二氯甲烷作为溶剂，搅拌30分钟，排出反应釜中的液体。
2.第一次C端氨基酸偶联
(1)缩合：称取269.9g的Fmoc-Gly-OH至5L反应瓶中，加入二氯甲烷搅拌使原料分散，加入到装有预处理树脂的反应釜中，加入315mL的N,N-二异丙基乙胺，控温20–30℃搅拌反应4小时后加入0.2L的甲醇封闭树脂，反应0.5小时后排出反应液，DMF洗涤6次，排出液体，即得Fmoc-Gly-CTC树脂。
(2)脱Fmoc保护：向装有前一步骤产物(预处理树脂或肽树脂)的反应釜中加入20％哌啶/DMF溶液，在20–30°下搅拌30分钟，之后排出液体。用DMF洗涤6次，排出液体。
3.第二至第五次C端氨基酸偶联
(1)缩合：称取适量的Fmoc-氨基酸与1-羟基苯并三唑于5L反应瓶或烧杯中，加入DMF搅拌使分散，降温至-5–5℃，搅拌下加入90mL的DIC活化5–10min。加入到有前一步骤产物(预处理树脂或肽树脂)的反应釜中，控温20–30℃搅拌反应4h。反应完全后停止搅拌，排出液体。用DMF洗涤6次，排出液体。
(2)脱Fmoc保护：向反应釜中加入20％哌啶/DMF溶液，在20–30°下搅拌30分钟，之后排出液体。用DMF洗涤6次，排出液体。
上述缩合及脱Fmoc保护循环进行四次(第二至第五次缩合)，其中第二至第五次缩合所加入的Fmoc-氨基酸分别可以是Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Lys(ivDde)-OH、Fmoc-D-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH，最终获得Fmoc-Asp(OtBu)-D-Tyr(tBu)-Lys(ivDde)-Arg(Pbf)-Gly-CTC树脂。
具体来说，在第二次缩合中，可以称取333.8g的Fmoc-Arg(Pbf)-OH与69.7g的1-羟基苯并三唑至反应瓶或烧杯中进行反应。
在上述的缩合及脱保护步骤之后，可以通过茚三酮检测来检测反应是否完全；反应完全后，可进行下一步工序。取出少量产物于试管中，加入检测试剂A(80g苯酚溶于100mL无水乙醇中)、检测试剂B(5g茚三酮加100mL无水乙醇溶解)、检测试剂C(吡啶)各2滴，100℃加热5min，取出观察。在缩合反应之后的检测，如树脂无色，进行下一步工序；在脱保护反应之后的检测，如树脂显色，进行下一步工序。
(3)获得肽树脂：在进行上述循环完成缩合及脱保护后，向反应釜中加入二氯甲烷洗涤树脂3次，排出液体。用MeOH洗涤3次，排出液体。树脂在反应釜中抽至半干后取出，室温晾干至恒重收料。得肽树脂(H-Asp(OtBu)-D-Tyr(tBu)-Lys(ivDde)-Arg(Pbf)-Gly-CTC树脂)476.0g。
4.裂解以合成FP-(ivDde)-RGD(H-Asp(OtBu)-D-Tyr(tBu)-Lys(ivDde)-Arg (Pbf)-Gly-OH)
(1)搅拌下，反应瓶中加4000mL二氯甲烷、20mL三氟乙酸；
(2)搅拌条件下，加入400.0g肽树脂后室温反应3小时，反应完毕后使用砂芯漏斗滤除树脂，树脂使用二氯甲烷洗涤后合并滤液；
(3)滴加N,N-二异丙基乙胺调节pH＝7–8，于35–40℃条件下减压浓缩至无馏份流出；
(4)加入1200mL乙酸乙酯搅拌溶解，使用饱和食盐水1000mL洗涤后分液，有机相中再次加入1000mL饱和食盐水洗涤后分液，有机相中加入120.0g无水硫酸钠干燥1小时，有机相于35–40℃浓缩至无馏份流出后，加入800mL乙酸乙酯溶解，滴加至8000mL正庚烷中搅拌析晶10–20h；
(5)过滤，滤饼使用400mL正庚烷淋洗三次，继续抽干5–8小时后，于35℃条件下真空干燥至恒重收料得类白色固体181.7g。纯度：91.6％，收率：59.7％，质谱1027.6(理论值1027.6)。
(四)N3-NOTA-PEG4-c-RGD的制备
请参照图4，为本申请的一些实施例中，使用FP-(ivDde)-RGD(式(III)化合物)制备N3-NOTA-PEG4-c-RGD(式(IX)化合物)的反应流程图。
合成FP-(ivDde)-c-RGD(式(IV)化合物)
(1)将二氯甲烷、90.3g的FP-(ivDde)-RGD(式(III)化合物)加入到反应瓶中，搅拌溶解，加21.0g的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI·HCl)室温反应24h；
(2)TLC或HPLC监测反应，反应完毕后，体系缩至无馏份流出，所得浓缩物加450mL的DMF溶解，滴加至纯水中析出白色固体后，继续搅拌析晶15–20h；
(3)过滤，滤饼使用纯化水淋洗三次，于40℃条件下放入鼓风干燥箱干燥20h，收料得类白色固体85.2g。纯度：85.9％，收率：96.7％，质谱1189.6(理论值为1189.6)。
合成FP-c-RGD(式(V)化合物)
(1)搅拌下，反应瓶中加入400mL的DMF与8mL的水合肼；
(2)将80.2g的FP-(ivDde)-c-RGD(式(IV)化合物)加至反应瓶中，搅拌溶解，10–30℃反应5h；
(3)HPLC监测反应，反应完毕后将反应液滴加至甲基叔丁基醚/正庚烷(7:3/v:v)(8400mL)中析晶5h；
(4)过滤，滤饼使用正庚烷搅拌洗涤三次后抽干，滤饼放入鼓风干燥箱，于35℃干燥15–24h，得类白色固体65.3g。纯度:85.3％，收率:99.2％，质谱983.5(理论值为983.5)。
合成Fmoc-NH-PEG4-FP-c-RGD(式(VI)化合物)
(1)向反应瓶中加入DMF(325mL)，再加入64.7g的FP-c-RGD(式(V)化合物)，32.0g的Fmoc-PEG4-丙酸(PA)，34.2g的PyBop，搅拌溶解；
(2)滴加N,N-二异丙基乙胺(23mL)后，10–30℃搅拌反应2h；
(3)HPLC或TLC监测反应，反应完毕后，将反应液滴加至甲基叔丁基醚(9750mL)中搅拌析晶2–5h；
(4)过滤，滤饼使用甲基叔丁基醚搅洗6次后抽干，滤饼放入鼓风干燥箱中于35℃鼓风干燥15–24h后收料，得类白色固体粉末84.7g。纯度：83.0％，收率：88.3％，质谱1453.7(理论值为1452.7)。
合成NH2-PEG4-FP-c-RGD(式(VII)化合物)
(1)向反应瓶中加201.6mL的DMF、50.4mL哌啶，搅拌条件下将84.1g的Fmoc-NH-PEG4-FP-c-RGD加至反应瓶中，搅拌溶解，10–30℃反应2h；
(2)TLC或HPLC监测反应液，反应完毕后，将反应液滴加至7560mL的甲基叔丁基醚中，析出白色固体后继续搅拌1–2h；
(3)过滤，滤饼使用甲基叔丁基醚洗涤三次后抽干，滤饼放入鼓风干燥箱中于35℃干燥15–24h后收料得类白色固体粉末61.2g。纯度：85.4％，收率：86.1％，质谱1231.7(理论值为1230.7)。
合成N3-NOTA(tBu)2-PEG4-FP-c-RGD(式(VIII)化合物)
(1)向反应瓶中加入300mL的DMF，再加入60.0g的NH2-PEG4-FP-c-RGD、25.2g的NOTA(tBu)2-N3、27.3g的PyBop，搅拌溶解。
(2)滴加19.2mL的N,N-二异丙基乙胺，10–30℃搅拌反应5h；
(3)HPLC监测反应，反应完毕后，将反应液滴加到9000mL的甲基叔丁基醚中搅拌析晶2–5h；
(4)过滤，滤饼使用300mL的甲基叔丁基醚洗涤三次后抽干后放入鼓风干燥箱中于35℃条件下鼓风干燥15–24h收料，得类白色固体粉末67.5g。纯度：78.8％，收率：81.6％，质谱1697.9(理论值为1696.9)。
合成N3-NOTA-PEG4-c-RGD(式(IX)化合物)
(1)搅拌条件下，反应瓶中加入627mL三氟乙酸、16.5mL水、16.5mL三异丙基硅烷；
(2)加入66.0g的N3-NOTA(tBu)2-PEG4-FP-c-RGD，室温搅拌反应2–3h；
(3)反应完毕后，将反应液滴加至6600mL甲基叔丁基醚中析晶2–5h；
(4)过滤，滤饼使用甲基叔丁基醚洗涤三次后抽干，滤饼室温晾干15–24h后收料得类白色固体粉末48.9g。
纯度：80.4％，收率：102.9％。
纯化N3-NOTA-PEG4-c-RGD(式(IX)化合物)
以进行液相色谱收集纯化液的方式进行纯化。
设备：成都格莱制备液相色谱仪(型号：GL6000-300mL/min)
制备色谱柱：ID 100mm*450mm；填料：Unsil-10-100 C18 UItra 1200g；填装柱长：250mm；产品编号：GL20190215001A；流速：200mL/min；波长：210nm
样品进样前处理：45.2g的N3-NOTA-PEG4-c-RGD(式(IX)化合物)加2250mL水溶解后经0.45μm滤膜过滤后进样。
以5％的B相进行色谱柱平衡至基线稳定，平衡15分钟。上样使用C泵上样，上样流速200mL/min。共进样5针，每针上样约9.0g。上样结束后，运行梯度洗脱：0分钟：A相95％、B相5％，5分钟：A相90％、B相10％，60分钟：A相70％、B相30％。其中A相为0.1％三氟乙酸水溶液(可以通过量取三氟乙酸1mL加至1L水中获得)，B相为乙腈。
分段收集目标峰，HPLC检测，合并纯度大于等于98.0％，单杂小于0.5％的纯化液，最终得纯化液11.70L，经标定含N3-NOTA-PEG4-c-RGD(式(IX)化合物)16.86g。纯度：99.0％，收率：37.3％，质谱1220.6(理论值为1220.6)。
(五)NGR-PEG4-click-NOTA-PEG4-c-RGD的制备
请参照图5，为本申请的一些实施例中，通过NGR-PEG4-BCN(式(II)化合物)与N3-NOTA-PEG4-c-RGD(式(IX)化合物)反应得到NGR-PEG4-click-NOTA-PEG4-c-RGD(式(X)化合物)的反应式。
合成NGR-PEG4-click-NOTA-PEG4-c-RGD(式(X)化合物)
(1)将16.00g的NGR-PEG4-BCN(式(II)化合物)的三氟乙酸/乙腈混合液(式(II)化合物的HPLC梯度洗脱纯化液)与16.20g的N3-NOTA-PEG4-c-RGD(式(IX)化合物)混合，10–30℃反应15–20h。
(2)HPLC监测反应，最终产物经0.45μm滤膜过滤后进行纯化。
纯化NGR-PEG4-click-NOTA-PEG4-c-RGD(式(X)化合物)
以进行液相色谱收集纯化液的方式进行纯化。
设备：成都格莱制备液相色谱仪(型号：GL6000-300mL/min)
制备色谱柱：ID 100mm*450mm；填料：Unsil-10-100 C18 UItra 1200g；填装柱长：250mm；产品编号：GL20190215001A；流速：200mL/min；波长：210nm
以5％的B相进行色谱柱平衡至基线稳定，平衡15分钟。上样使用C泵上样，上样流速200mL/min。共进样4针，每针上样2.9L(约含NGR-PEG4-click-NOTA-PEG4-c-RGD(式(X)化合物)8.0g)。上样结束后，加入纯水冲洗进样管路2分钟，接着运行梯度洗脱：0分钟：A相95％、B相5％，5分钟：A相88％、B相12％，85分钟：A相68％、B相32％，100分钟：A相50％、B相50％。其中A相为0.3％乙酸水溶液(可以通过量取冰醋酸3mL加至1L水中获得)，B相为乙腈。
分段收集目标馏分，送检HPLC，收集合并纯度大于等于98％，共得合格纯化液8.20L。纯度：99.8％。
NGR-PEG4-click-NOTA-PEG4-c-RGD(式(X)化合物)转盐
以进行液相色谱的方式进行转盐。
制备色谱柱：ID 100mm*450mm；填料：Unsil-10-100 C18 UItra 1200g；填装柱长：250mm；产品编号：GL20190215001A；流速：200mL/min；波长：210nm。
样品前处理：NGR-PEG4-click-NOTA-PEG4-c-RGD(式(X)化合物)纯化液8.2L于30℃下减压浓缩至6.85L后上样。
流动相：A1相：0.1％乙酸水溶液，A2相：100mmol/L乙酸铵水溶液，B相：乙腈。
以5％的B相与95％的A1相平衡色谱柱15min。上样使用C泵上样，上样流速200mL/min。上样完毕后，以A2相作为流动相30分钟以转盐，以A1相作为流动相20分钟以冲洗，最后以50％的A1相与50％的B相作为流动相至主峰接收完毕后停止，以洗脱。
收集全部目标峰，得转盐液3.2L。于30℃减压浓缩后上样，冻干得类白色固体蓬松固体粉末23.0g。纯度：99.7％，收率：78.0％，质谱2250.1(理论值为2249.1)。
实施例2
式(I)至(X)化合物的合成与实施例1相同，差异在于纯化式(X)化合物时A相为0.3％三氟乙酸水溶液。
分段收集目标馏分，送检HPLC，收集合并纯度大于等于98％，共得纯化液纯度99.3％。
可以看到，实施例1所得到的纯化液纯度较高。
上述实施方式仅为本申请的优选实施方式，不能以此来限定本申请保护的范围，本领域的技术人员在本申请的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本申请所要求保护的范围。
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