一种铁筷子组培繁殖方法
阅读说明：本技术 一种铁筷子组培繁殖方法 (Tissue culture propagation method for Chimonanthus praecox ) 是由 段青 王继华 王祥宁 杨晓 杜文文 马璐琳 田敏 于 2021-08-10 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种铁筷子组培繁殖方法,包括以下步骤：(1)外植体的获取与处理；(2)不定芽诱导培养；(3)不定芽继代增殖培养；(4)生根培养；(5)炼苗和移栽,得铁筷子种苗。本发明通过对激素、培养环境的综合调节,使铁筷子不定芽增殖倍数达到3.5以上,生根率达到90%以上,解决了铁筷子繁殖系数低、生根难、生产周期长的难题。另外,通过将优良株系的优良性状保持下来,可以生产优良性状稳定的种苗,易于标准化、工厂化操作,为市场提供统一标准的优良种苗。(The invention provides a tissue culture propagation method of Chimonanthus praecox, which comprises the following steps: (1) obtaining and processing an explant; (2) adventitious bud induction culture; (3) subculturing and proliferating the adventitious bud; (4) rooting culture; (5) hardening and transplanting to obtain the chopsticks seedling. The method comprehensively adjusts hormone and culture environment, so that the multiplication factor of adventitious buds of the chopsticks reaches more than 3.5, the rooting rate reaches more than 90%, and the problems of low propagation coefficient, difficult rooting and long production period of the chopsticks are solved. In addition, by maintaining the excellent properties of the excellent strains, seedlings with stable excellent properties can be produced, the standardization and the industrial operation are easy, and the uniform and standard excellent seedlings are provided for the market.)
技术领域
本发明涉及一种组培繁殖方法，特别是一种铁筷子组培繁殖方法，属于植物繁育技术领域。
背景技术
铁筷子（Helleborus）是毛茛科多年生植物，该属大约有22种，主要分布在欧洲和西亚，我国只有铁筷子（Helleborus thibetanus）一种。铁筷子株型低矮、叶色墨绿、花叶奇特，用作盆栽植物，冬春或早春开花，被称为“圣诞玫瑰”，具有极高的观赏价值。铁筷子主要以种子繁殖为主，但因种子具有休眠特性，且受环境条件的限制，受精后的种子需要10~12周才会成熟，成熟种子播种到萌发需要26~34周的时间，造成生产周期过长，严重制约了铁筷子的规模化生产和商业应用。现有的铁筷子组织培养，因为褐变、内生菌等导致离体培养启动困难、增殖率低、生根和驯化困难等问题。因此有必要对现有技术加以改进。
发明内容
为解决现有铁筷子因种子具有休眠特性，造成生长周期过长，且离体培养启动困难、污染率高、增值率低、生根和驯化困难等问题，本发明提供一种铁筷子组培繁殖方法。
本发明通过下列技术方案完成：一种铁筷子组培繁殖方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）外植体的获取与处理：在8月份切取叶片尚未展开的小腋芽，用质量浓度为15-30%的洗衣粉水浸泡3-6min后，流水冲洗30min以上，用质量浓度为70%酒精浸泡20-35s，再用质量浓度为0.2%的Fungicide浸泡15min，最后用质量浓度为0.15%的升汞浸泡20-30min，用无菌水冲洗3次，滤除水分，得处理后的小腋芽；
（2）不定芽诱导培养：将步骤（1）处理后的小腋芽接种于下列不定芽诱导培养基上：MS+2iP 2mg/L+6-BA 1~2mg/L+NAA 0.1~0.3mg/L，琼脂6.5g/L，蔗糖30g/L蔗糖，pH5.8；
于温度为15±2℃，光照强度为2000～3000lx，光照时间为8-12h/d的条件下，诱导培养40~60d，直至外植体分化出不定芽；
（3）不定芽继代增殖培养：将步骤（2）诱导出的不定芽切下，转接至下列增殖培养基中：
MS+2iP 2mg/L+6-BA 1mg/L+NAA 0.1~0.3mg/L，琼脂6.5g/L，蔗糖30g/L蔗糖，pH5.8；
在温度为15~23℃，光照强度为2000～3000lx，光照时间为8-12h/d的条件下进行继代培养，每30d继代一次，直至得到1~2cm长的不定芽；
（4）生根培养：将步骤（3）继代增殖培养的不定芽转接至下列生根培养基中：
MS+IBA 0.5~1.0mg/L，琼脂6.50g/L琼脂，蔗糖30g/L蔗糖，pH5.8；
在温度为15±2℃，光照强度为2000～3000lx，光照时间为8-12h/d的条件下进行诱导生根培养25~35d，得植株基部长出5~8根须根的无菌苗；
（5）炼苗和移栽：将步骤（4）生根培养的无菌苗取出，洗净根部琼脂，放入质量浓度为0.1～0.2%的多菌灵溶液中消毒1～2min后，移栽至下列质量比的基质中：腐植土∶红土∶珍珠岩=1∶1∶1，按常规在温室中驯化炼苗40~60d后即可移栽至大田中，移栽成活率达95%以上。
本发明具有下列优点及效果：采用上述方案，通过对激素、培养环境的综合调节，使铁筷子不定芽增殖率达到3.5以上，生根率达到90%以上，解决了铁筷子繁殖系数低、生根难、生产周期长的难题。另外，通过将优良株系的优良性状保持下来，可以生产优良性状稳定的种苗，易于标准化、工厂化操作，为市场提供统一标准的优良种苗。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述。
实施例1
一种铁筷子组培繁殖的方法，包括以下步骤：
（1）外植体的选择与灭菌：在秋季8月份，切取叶片尚未展开的小腋芽，用质量浓度为15%的洗衣粉水浸泡6min后，用流水冲洗30min以上，置于超净工作台上，先用质量浓度为70%酒精浸泡30s，再用质量浓度为0.2%Fungicide浸泡15min，最后用质量浓度为0.15%升汞浸泡20min，无菌水冲洗3次，滤除多余水分，得处理后的小腋芽；
（2）不定芽诱导培养：将步骤（1）处理的小腋芽接种于下列不定芽诱导培养基上：
MS+2iP 2mg/L+6-BA 1mg/L+NAA 0.1mg/L，琼脂6.5g/L，蔗糖30g/L蔗糖，pH5.8；
于温度为15℃，光照强度为2000lx，光照时间为10h/d的条件下，诱导培养60d，直至外植体分化出不定芽；
（3）不定芽继代增殖培养：将步骤（2）诱导出的不定芽切下，转接至下列增殖培养基中：
MS+2iP 2mg/L+6-BA 1mg/L+NAA 0.1mg/L，琼脂6.5g/L，蔗糖30g/L蔗糖，pH5.8；
在温度为15℃，光照强度为2000lx，光照时间为10h/d的条件下进行继代培养，每30d继代一次，直至得到2cm长的不定芽；
（4）生根培养：将步骤（3）继代增殖培养的不定芽转接至下列生根培养基中：
MS+IBA 0.5mg/L，琼脂6.50g/L琼脂，蔗糖30g/L蔗糖，pH5.8；
在温度为15℃，光照强度为2000lx，光照时间为10h/d的条件下培养35d，得植株基部长出5根须根的无菌苗；
（5）炼苗和移栽：将步骤（4）诱导生根培养的具有5根须根的无菌苗取出，洗净根部琼脂，放入质量浓度为0.1%的多菌灵溶液中消毒2min后，移栽至比例为腐植土：红土：珍珠岩=1：1：1的基质中，按常规方式在温室中驯化炼苗60d后，移栽至大田中。
本实施例的铁筷子不定芽增殖倍数达到4.1，生根率达到96%，移栽成活率为98%。
实施例2
一种铁筷子组培繁殖的方法，包括以下步骤：
（1）外植体的选择与灭菌：在秋季8月份，切取叶片尚未展开的小腋芽，用质量浓度为30%的洗衣粉水浸泡3min后用流水冲洗30min以上，置于超净工作台上，先用质量浓度为70%酒精浸泡30s，再用质量浓度为0.2%的Fungicide浸泡15min，最后用质量浓度为0.15%的升汞浸泡20min，无菌水冲洗3次，滤除多余水分，得处理后的小腋芽；
（2）不定芽诱导培养：将步骤（1）处理的小腋芽接种于不定芽诱导培养基中，于温度为13℃，光照强度为3000lx，光照时间为8h/d的条件下，诱导培养40d直至外植体分化出不定芽；
所述不定芽诱导培养基为：MS+2iP 2mg/L+6-BA 1.5mg/L+NAA 0.2mg/L，琼脂6.5g/L，蔗糖30g/L蔗糖，pH5.8；
（3）不定芽继代增殖培养：将步骤（2）中诱导出的不定芽切下转接至增殖培养基中，在温度为20℃，光照强度为3000lx，光照时间为8h/d的条件下进行继代培养，每30d继代一次，直至得到1cm长的不定芽；
所述增殖培养基为：MS+2iP 2mg/L+6-BA 1mg/L+NAA 0.2mg/L，琼脂6.5g/L，蔗糖30g/L蔗糖，pH5.8；
（4）生根培养：将步骤（3）继代增殖培养的不定芽转接至生根培养基中诱导生根，在温度为13℃，光照强度为3000lx，光照时间为8h/d的条件下培养25d，得植株基部长出6根须根的无菌苗；
所述生根培养基为：MS+IBA 0.8mg/L，琼脂6.50g/L琼脂，蔗糖30g/L蔗糖，pH5.8；
（5）炼苗和移栽：将步骤（4）诱导生根培养的无菌苗取出，洗净根部琼脂，放入质量浓度为0.1～0.2%的多菌灵溶液中消毒1～2min后，移栽至比例为腐植土：红土：珍珠岩=1：1：1的基质中，按常规方式在温室中驯化炼苗50d后移栽至大田中。
本实施例的铁筷子不定芽增殖倍数达到3.6，生根率达到92%，成活率为96%。
实施例3
一种铁筷子组培繁殖的方法，包括以下步骤：
（1）外植体的选择与灭菌：在秋季8月份切取叶片尚未展开的小腋芽，用质量浓度为20%的洗衣粉水浸泡5min后用流水冲洗30min以上，置于超净工作台上，先用质量浓度为70%酒精浸泡30s，再用质量浓度为0.2%的Fungicide浸泡15min，最后用质量浓度为0.15%的升汞浸泡20min，无菌水冲洗3次，滤除多余水分，得处理后的小腋芽；
（2）不定芽诱导培养：将步骤（1）处理的小腋芽接种于诱导培养基中，于温度为17℃，光照强度为2500lx，光照时间为12h/d的条件下，诱导培养50d，直至外植体分化出不定芽；
所述不定芽诱导培养基为：MS+2iP 2mg/L+6-BA 2mg/L+NAA 0.3mg/L，琼脂6.5g/L，蔗糖30g/L蔗糖，pH5.8；
（3）不定芽继代增殖培养：将步骤（2）中诱导出的不定芽切下转接至增殖培养基中，在温度为23℃，光照强度为2500lx，光照时间为12h/d的条件下进行继代培养，每30d继代一次，直至得到1.5cm长的不定芽；
所述增殖培养基为：MS+2iP 2mg/L+6-BA 1mg/L+NAA 0.3mg/L，琼脂6.5g/L，蔗糖30g/L蔗糖，pH5.8；
（4）生根培养：将步骤（3）继代增殖培养的不定芽转接至生根培养基中诱导生根，在温度为16℃，光照强度为2500lx，光照时间为12h/d的条件下培养25d，得到植株基部长出7根须根的无菌苗；
所述生根培养基为：MS+IBA 0.5~1.0mg/L，琼脂6.50g/L琼脂，蔗糖30g/L蔗糖，pH5.8；
（5）炼苗和移栽：将步骤（4）诱导生根培养的无菌苗取出，洗净根部琼脂，放入质量浓度为0.1～0.2%的多菌灵溶液中消毒1～2min后，移栽至比例为腐植土：红土：珍珠岩=1：1：1的基质中，按常规方式在温室中驯化炼苗40d后移栽到大田中。
本实施例的铁筷子不定芽增殖倍数达到3.5，生根率达到90%，成活率为95%。
对照例1
一种铁筷子组培繁殖的方法，包括以下步骤：
（1）外植体的选择与灭菌：在秋季4月份切取叶片已经展开的腋芽，用洗衣粉水浸泡5min后用流水冲洗30min以上，置于超净工作台上用质量浓度为70%酒精浸泡30s，0.15%升汞浸泡20min，无菌水冲洗3次，滤除多余水分；
（2）不定芽诱导培养：将步骤（1）处理的腋芽接种于下列不定芽诱导培养基上：MS+6-BA 2mg/L+NAA 0.2mg/L，琼脂6.5g/L，蔗糖30g/L，pH5.8；于温度为22℃，光照强度为2000～3000lx，光照时间为10h/d的条件下培养30d后因真菌污染而死亡。
对照例2
一种铁筷子组培繁殖的方法，包括以下步骤：
（1）外植体的选择与灭菌：在秋季4月份切取叶片已经展开的腋芽，用洗衣粉水浸泡5min后用流水冲洗30min以上，置于超净工作台上依次用70%酒精浸泡30s，0.2%Fungicide浸泡15min，0.15%升汞浸泡20min，无菌水冲洗3次，滤除多余水分；
（2）不定芽诱导培养：将步骤（1）处理的腋芽接种于不定芽诱导培养基中，于温度为22℃，光照强度为2000～3000lx，光照时间为10h/d的条件下，诱导培养60d直至外植体分化出不定芽；
所述不定芽诱导培养基为：MS+6-BA 2mg/L+NAA 0.2mg/L，琼脂6.5g/L，蔗糖30g/L蔗糖，pH5.8；
（3）不定芽继代增殖培养：将步骤（2）中诱导出的不定芽切下转接至增殖培养基中，在温度为22℃，光照强度为2000～3000lx，光照时间为10h/d的条件下进行继代培养，每30d继代一次；
所述增殖培养基为：MS+6-BA 1mg/L+NAA 0.2mg/L，琼脂6.5g/L，蔗糖30g/L蔗糖，pH5.8。
（4）生根培养：将步骤（3）继代增殖培养的1~2cm长的不定芽转接至生根培养基中诱导生根，在温度为22℃，光照强度为2000～3000lx，光照时间为10h/d的条件下培养30d，直至植株基部长2~3根须根；
所述生根培养基为：MS+IBA 0.5mg/L，琼脂6.50g/L琼脂，蔗糖30g/L蔗糖，pH5.8；
（5）炼苗和移栽：将步骤（4）诱导生根培养的具有2~3根须根的无菌苗取出，洗净根部琼脂，放入质量浓度为0.1～0.2%的多菌灵溶液中消毒1～2min后，移栽至比例为腐植土：红土：珍珠岩=1：1：1的基质中，按常规方式在温室中驯化炼苗50d后移栽，成活率为85%。
本对照例的铁筷子不定芽增殖慢，增值倍数为1.8，生根率低为65%，生根数少。
对照例3
一种铁筷子组培繁殖的方法，包括以下步骤：
（1）外植体的选择与灭菌：在秋季4月份切取叶片已经展开的腋芽，用洗衣粉水浸泡5min后用流水冲洗30min以上，置于超净工作台上依次用70%酒精浸泡30s，0.2%Fungicide浸泡15min，0.15%升汞浸泡20min，无菌水冲洗3次，滤除多余水分；
（2）不定芽诱导培养：将步骤（1）处理的小腋芽接种于诱导培养基中，于温度为22℃，光照强度为2000～3000lx，光照时间为10h/d的条件下，诱导培养60d直至外植体分化出不定芽；
所述不定芽诱导培养基为：MS+2iP 2mg/L+6-BA 2mg/L+NAA 0.3mg/L，琼脂6.5g/L，蔗糖30g/L蔗糖，pH5.8；
（3）不定芽继代增殖培养：将步骤（2）中诱导出的不定芽切下转接至增殖培养基中，在温度为22℃，光照强度为2000～3000lx，光照时间为10h/d的条件下进行继代培养，每30d继代一次；
所述增殖培养基为：MS+2iP 2mg/L+6-BA 1mg/L+NAA 0.3mg/L，琼脂6.5g/L，蔗糖30g/L蔗糖，pH5.8；
（4）生根培养：将步骤（3）继代增殖培养的1~2cm长的不定芽转接至生根培养基中诱导生根，在温度为22℃，光照强度为2000～3000lx，光照时间为10h/d的条件下培养25d，直至植株基部长出3~5根须根；
所述生根培养基为：MS+IBA 0.5mg/L，琼脂6.50g/L琼脂，蔗糖30g/L蔗糖，pH5.8；
（5）炼苗和移栽：将步骤（4）诱导生根培养的具有3~5根须根的无菌苗取出，洗净根部琼脂，放入质量浓度为0.1～0.2%的多菌灵溶液中消毒1～2min后，移栽至比例为腐植土：红土：珍珠岩=1：1：1的基质中，按常规方式在温室中驯化炼苗60d后移栽，成活率为90%。
本对照例的铁筷子不定芽增殖较慢，增值倍数2.4，生根率为80%。
对比分析
表1对比了常规组培方法对照例2和采用本发明实施例1对铁筷子繁殖的差别，包括：外植体污染率、不定芽诱导数量、增殖倍数、生根率、须根数量、和移栽成活率。结果显示，除本发明的外植体污染率低于常规组培方法外，不定芽诱导数量、增殖倍数、生根率和须根数量都明显高于常规组培方法。
表1
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