一种人轮状病毒vp8重组蛋白以及利用该vp8重组蛋白的人用轮状病毒疫苗
阅读说明：本技术 一种人轮状病毒vp8重组蛋白以及利用该vp8重组蛋白的人用轮状病毒疫苗 (Human rotavirus VP8 recombinant protein and human rotavirus vaccine using VP8 recombinant protein ) 是由 陈德祥 董丽春 于 2018-04-13 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种人轮状病毒VP8重组蛋白,所述VP8重组蛋白的氨基酸序列包括人轮状病毒VP8蛋白(以下简称为VP8蛋白)氨基酸序列和外源多肽氨基酸序列,所述外源多肽的等电点小于等于5。本发明还提供了基于该VP8重组蛋白制备的人轮状病毒疫苗。(The invention provides a human rotavirus VP8 recombinant protein, wherein the amino acid sequence of the VP8 recombinant protein comprises an amino acid sequence of a human rotavirus VP8 protein (hereinafter referred to as VP8 protein) and an amino acid sequence of exogenous polypeptide, and the isoelectric point of the exogenous polypeptide is less than or equal to 5. The invention also provides a human rotavirus vaccine prepared based on the VP8 recombinant protein.)
技术领域
本发明涉及疫苗领域，尤其涉及一种人轮状病毒疫苗以及该疫苗中所涉及的轮状病毒重组蛋白。
发明背景
轮状病毒是严重的脱水性腹泻的最常见原因，造成巨大的经济损失。几乎每个孩子在5岁之前便已感染了轮状病毒。目前全世界每年有近二十万小于5岁的儿童死于轮状病毒腹泻，包括中国的约两万儿童。疫苗是预防轮状病毒腹泻的最经济也是最有效的方法。
早在1998年，惠氏(Wyeth)推出了口服的轮状病毒疫苗-Rotashield。使用一年期间，发现接种的儿童发生肠套叠的风险增高，因此、产品不得不撤市。后来Merck和GSK分别推出了口服轮状病毒活疫苗，这两个产品在全球80多个国家广泛应用，对控制轮状病毒造成的严重的脱水性腹泻，以及其引起的住院和儿童死亡起到非常好的保护作用。但是这些疫苗在发达国家的保护效果有比较好。对发展中和落后国家的人群的疗效不如发达国家的高，平均有效性在50％左右。其保护性的地区差异的原因并不清楚，可能的因素包括母乳中的抗体对疫苗病毒的生长抑制作用，儿童营养不良造成的肠道发育不完善，和不同的肠道微生物菌群等综合因素对疫苗保护性的干扰。其它口服减毒活疫苗，肠如霍乱和脊髓灰质炎，也有相似的问题。这两个口服轮状病毒活疫苗分别在6-7万的儿童开展了3期临床试验，没有发现有引起肠套叠的风险。但是在大批的人群使用后也发现不同程度增加了肠套叠的风险。中国有一个口服的轮状病毒疫苗产品在市场销售。是否与国外的产品有共同的弊病有待进一步研究。
由于口服的轮状病毒疫苗产品的上述缺陷，人们希望研制可以注射的状病毒疫苗其它疫苗的经验证明注射的疫苗的保护性无地区差异，也不会引起无肠套叠。
开发注射的轮状病毒疫苗可选的保护性抗原主要是外壳蛋白VP7和VP4蛋白质。因为这两个蛋白分别能够诱导中和抗体。VP7作为疫苗开发比较复杂，因为在人的致病轮状病毒毒株中，有至少8-10个不同的VP7型，即G-型(G1-6，8，9等)。不同的地区流行的毒株G-型不同，而且同一个地区每年流行的毒株的G型也往往不同。不同G-型之间相互之间没有交叉保护作用。意味着基于VP7蛋白的疫苗是一个成本昂贵的多成份的产品。相对而言，基于VP4蛋白的疫苗的可行性更高。因为人致病的轮状病毒几乎只有三个不同的VP4型别，即P[4],P[6],和P[8]型。同一个P-型的不同毒株之间VP4蛋白之间的氨基酸顺序也有差别，但差异不会超过5％。不过针对任何一个P-型的VP8的抗血清能够中和同一个P-型的不同毒株。另外P[4]和P[8]之间的蛋白的氨基酸顺序非常相似，有一定的交叉保护作用。所以一个两价或三价的基于VP4蛋白的疫苗是全球通用的轮状病毒疫苗，可以预防几乎所有的毒株。
VP4蛋白作为病毒表面突出的蛋白可以作为疫苗用的另外一个原因是VP4在病毒感染人的细胞过程中是一个非常重要的毒性因子。起毒性作用非常类似于流感病毒的血凝素。轮状病毒通过VP4蛋白结合到宿主细胞表面的受体，然后VP4被胰酶切成VP5和VP8两个片段。VP5连同病毒颗粒侵入到细胞内，VP8作被留在细胞外。针对VP4的中和抗体能够阻止病毒与人体细胞表面受体的结合和病毒向细胞内侵入，以及细胞之间的扩散。其保护机理非常类似于流感疫苗的保护机理。总之流感病毒的血凝素作为有效的疫苗的先例是支持开发基于VP4蛋白的轮状病毒疫苗有力证据。
研究用VP4作为疫苗有很长的历史，但进展缓慢。化学或高温灭火病毒往往破坏VP4的结构和破坏其免疫原性和诱导中和抗体的能力。基因表达整个VP4蛋白，或其VP5片段非常困难，主要表现在所表达的蛋白质水溶性很低，往往形成包涵体，而且产量非常低。例如，Kovacs-Nolan J报道的大肠杆菌表达量仅为每升1.8毫克(Kovacs-Nolan J,Sasaki E,Yoo D,Mine Y.Cloning and expression of human rotavirus spike protein,VP8*,inEscherichia coli.BiochemBiophys Res Commun.2001 Apr 20；282(5):1183-8.)。
目前轮状病毒的亚单位疫苗开发主要集中在开发VP8蛋白(VP4蛋白的一部分)。其措施包括开发病毒类颗粒，可溶性蛋白等。基因工程表达VP8同样有蛋白的水溶性低和产量低的缺陷。一个解决办法是表达含主要中和抗体表位的VP8蛋白片段(氨基酸序列64-223)。其产量可以达到每升40-70毫克(Wen X,Cao D,Jones RW,Li J,Szu S,HoshinoY.Construction and characterization of human rotavirus recombinant VP8*subunit parenteral vaccine candidates.Vaccine.2012 Sep 21；30(43):6121-6)，但其所得到的VP8蛋白片段的免疫原性比较低，需要增加一个破伤风毒素的多肽来提高其免疫原性(Wen X,Wen K,Cao D,Li G,Jones RW,Li J,Szu S,Hoshino Y,Yuan L.Inclusion ofa universal tetanus toxoid CD4(+)T cell epitope P2 significantly enhanced theimmunogenicity of recombinant rotavirusΔVP8*subunit parenteralvaccines.Vaccine.2014 Jul 31；32(35):4420-7.)。中国专利CN103319604B，也公开了通过增加一个破伤风毒素的多肽来提高VP8蛋白片段免疫原性的方法。尽管如此，利用上述表达方法得到的产量仅在每升10-46毫克的范围。基于P2-VP8[P8]的蛋白已经进入到人的临床试验，能够在够诱导VP8P[8]型的特异性中和抗体，但对其它的P型的病毒没有中和性(Fix AD,Harro C,McNeal M,Dally L,Flores J,Robertson G,Boslego JW,CryzS.Safety and immunogenicity of a parenterally administered rotavirus VP8subunit vaccine in healthy adults.Vaccine.2015 Jul 17；33(31):3766-72.和GroomeMJ,Koen A,Fix A,Page N,Jose L,Madhi SA,McNeal M,Dally L,Cho I,Power M,FloresJ,Cryz S.Safety and immunogenicity of a parenteral P2-VP8-P[8]subunitrotavirus vaccine in toddlers and infants in South Africa:a randomised,double-blind,placebo-controlled trial.Lancet Infect Dis.2017 Aug；17(8):843-853.)。
发明内容
本发明为了克服了现有技术中的上述缺陷，开发得到了基于人轮状病毒VP8的亚单位疫苗，三个P型的VP8融合蛋白具有高产量和高水溶性。
本发明提供了一种人轮状病毒VP8重组蛋白，所述VP8重组蛋白的氨基酸序列包括人轮状病毒VP8蛋白(以下简称为VP8蛋白)氨基酸序列和外源多肽氨基酸序列，所述外源多肽的等电点小于等于5。
优选的是，所述外源多肽为破伤风毒素和/或白喉毒素的带负电荷氨基酸的外源多肽。
上述任一项优选的是，所述外源多肽的序列是如下a)或b)所述的氨基酸序列：a)由序列表中Seq ID NO:1所示的氨基酸序列；b)将序列表中Seq ID NO:1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且等电点小于等于5的由a)衍生的氨基酸序列。
上述任一项优选的是，所述外源多肽的序列是如下a)或b)所述的氨基酸序列：a)由序列表中Seq ID NO:2所示的氨基酸序列；b)将序列表中Seq ID NO:2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且等电点小于等于5的由a)衍生的氨基酸序列；
上述任一项优选的是，所述外源多肽的序列是如下a)或b)所述的氨基酸序列：a)由序列表中Seq ID NO:3所示的氨基酸序列；b)将序列表中Seq ID NO:3的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且等电点小于等于5的由a)衍生的氨基酸序列；
上述任一项优选的是，所述外源多肽的序列是如下a)或b)所述的氨基酸序列：a)由序列表中Seq ID NO:4所示的氨基酸序列；b)将序列表中Seq ID NO:4的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且等电点小于等于5的由a)衍生的氨基酸序列。
上述任一项优选的是，所述VP8蛋白氨基酸序列包括以下a)和/或b)的氨基酸序列：a)野生型VP8蛋白序列的64-223氨基酸基团；b)野生型VP8蛋白序列的64-223氨基酸序列经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加所形成的衍生序列。
上述任一项优选的是，VP8蛋白氨基酸序列是具有如下a)或b)或c)的氨基酸序列：a)由序列表中Seq ID NO:5所示的氨基酸序列；b)将序列表中Seq ID NO:5的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与VP8P型免疫原性相关的由a)衍生的氨基酸序列；c)与a)所述的序列具有92％以上同源性的氨基酸序列。
上述任一项优选的是，VP8蛋白氨基酸序列是具有如下a)或b)或c)的氨基酸序列：a)由序列表中Seq ID NO:6所示的氨基酸序列；b)将序列表中Seq ID NO:6的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与VP8P型免疫原性相关的由a)衍生的氨基酸序列；c)与a)所述的序列具有92％以上同源性的氨基酸序列。
上述任一项优选的是，VP8蛋白氨基酸序列是具有如下a)或b)或c)的氨基酸序列：a)由序列表中Seq ID NO:7所示的氨基酸序列；b)将序列表中Seq ID NO:7的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与VP8P型免疫原性相关的由a)衍生的氨基酸序列；c)与a)所述的序列具有92％以上同源性的氨基酸序列。
上述任一项优选的是，所述VP8蛋白氨基酸序列包括以下a)或b)的氨基酸片段：a)野生型VP8蛋白序列的1-63和/或224-248氨基酸集团中的1个氨基酸或2个及以上连续氨基酸构成的氨基酸片段；b)将a)经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加的衍生序列。
上述任一项优选的是，所述VP8蛋白氨基酸序列由野生型VP8蛋白序列的64-223氨基酸基团，或者由野生型VP8蛋白序列的1-223、2-223、3-223、4-223、5-223、6-223、7-223、8-223、9-223、10-223、11-223、12-223、13-223、14-223、15-223、16-223、17-223、18-223、19-223、20-223、21-223、22-223、23-223、24-223、25-223、26-223、27-223、28-223、29-223、30-223、31-223、32-223、33-223、34-223、35-223、36-223、37-223、38-223、39-223、40-223、41-223、42-223、43-223、44-223、45-223、46-223、47-223、48-223、49-223、50-223、51-223、52-223、53-223、54-223、55-223、56-223、57-223、58-223、59-223、60-223、61-223、62-223、63-223氨基酸基团；或者由以上序列连接有野生型VP8蛋白序列的224，224-225，224-226、224-227、224-228、224-229、224-230、224-231、224-232、224-233、224-234、224-235、224-236、224-237、224-238、224-239、224-240、224-241、224-242、224-243、224-244、224-245、224-246、224-247、224-248氨基酸；或者以上序列经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加所得到的衍生序列。
本发明还提供了一种人用轮状病毒疫苗，含有人轮状病毒VP8重组蛋白，其所述人轮状病毒VP8重组蛋白包括上述的人轮状病毒VP8重组蛋白，所述疫苗为外源多肽与轮状病毒的VP8蛋白的融合蛋白人用轮状病毒疫苗。
优选的是，所述融合蛋白的氨基酸序列包括VP8蛋白氨基酸序列，所述VP8蛋白氨基酸序列包括第一VP8蛋白氨基酸序列、第二VP8蛋白氨基酸序列和第三VP8蛋白氨基酸序列中的至少两种。
上述任一项优选的是，所述第一VP8蛋白氨基酸序列为P[8]型VP8蛋白的氨基酸序列。
上述任一项优选的是，所述第一VP8蛋白氨基酸序列是具有如下a)或b)或c)的氨基酸序列：a)由序列表中Seq ID NO:7所示的氨基酸序列；b)将序列表中Seq ID NO:7的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与VP8P型免疫原性相关的由a)衍生的氨基酸序列；c)与a)所述的序列具有92％以上同源性的氨基酸序列。
上述任一项优选的是，所述第二VP8蛋白氨基酸序列为P[6]型VP8蛋白的氨基酸序列。
上述任一项优选的是，所述第二VP8蛋白氨基酸序列是具有如下a)或b)或c)的氨基酸序列：a)由序列表中Seq ID NO:6所示的氨基酸序列；b)将序列表中Seq ID NO:6的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与VP8P型免疫原性相关的由a)衍生的氨基酸序列；c)与a)所述的序列具有92％以上同源性的氨基酸序列。
上述任一项优选的是，所述第三VP8蛋白氨基酸序列为P[4]型VP8蛋白的氨基酸序列。
上述任一项优选的是，所述第三VP8蛋白氨基酸序列是具有如下a)或b)或c)的氨基酸序列：a)由序列表中Seq ID NO:5所示的氨基酸序列；b)将序列表中Seq ID NO:5的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与VP8P型免疫原性相关的由a)衍生的氨基酸序列；c)与a)所述的序列具有92％以上同源性的氨基酸序列。上述任一项优选的是，所述疫苗是为三价轮状病毒疫苗，包括P[4]型VP8蛋白的氨基酸序列、P[6]型VP8蛋白的氨基酸序列和P[8]型VP8蛋白的氨基酸序列；优选的是，所述疫苗是为二价轮状病毒疫苗，包括P[4]型VP8蛋白的氨基酸序列和P[6]型VP8蛋白的氨基酸序列；优选的是，所述疫苗是为二价轮状病毒疫苗，包括P[4]型VP8蛋白的氨基酸序列和P[8]型VP8蛋白的氨基酸序列；优选的是，所述疫苗是为二价轮状病毒疫苗，包括P[6]型VP8蛋白的氨基酸序列和P[8]型VP8蛋白的氨基酸序列，所述三价的疫苗(即P[6]、P[8]和P[4]蛋白形成的三价疫苗)，或者P[6]与P[8]的VP8蛋白形成的两价疫苗具有广泛的保护作用，其中P[8]蛋白的免疫作用对P[4]蛋白所引起的疾病也具有保护作用。
上述任一项优选的是，所述外源多肽的等电点小于等于5。
上述任一项优选的是，所述外源多肽为破伤风毒素和/或白喉毒素的带负电荷氨基酸的外源多肽。
上述任一项优选的是，所述外源多肽的序列是如下a)或b)所述的氨基酸序列：a)由序列表中Seq ID NO:1所示的氨基酸序列；b)将序列表中Seq ID NO:1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且等电点小于等于5的由a)衍生的氨基酸序列。
上述任一项优选的是，所述外源多肽的序列是如下a)或b)所述的氨基酸序列：a)由序列表中Seq ID NO:2所示的氨基酸序列；b)将序列表中Seq ID NO:2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且等电点小于等于5的由a)衍生的氨基酸序列。
上述任一项优选的是，所述外源多肽的序列是如下a)或b)所述的氨基酸序列：a)由序列表中Seq ID NO:3所示的氨基酸序列；b)将序列表中Seq ID NO:3的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且等电点小于等于5的由a)衍生的氨基酸序列。
上述任一项优选的是，所述外源多肽的序列是如下a)或b)所述的氨基酸序列：a)由序列表中Seq ID NO:4所示的氨基酸序列；b)将序列表中Seq ID NO:4的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且等电点小于等于5的由a)衍生的氨基酸序列。
上述任一项优选的是，所述疫苗还包括佐剂。
上述任一项优选的是，所述佐剂为铝佐剂。
上述任一项优选的是，所述佐剂包括氢氧化铝。
上述任一项优选的是，所述佐剂不包括磷酸铝。
上述任一项优选的是，所述融合蛋白的剂量为1-100微克。
上述任一项优选的是，所述融合蛋白的剂量为5-50微克。
说明：本申请所述的VP8蛋白或VP8融合蛋白如无特别说明均为人轮状病毒VP8蛋白或人轮状病毒VP8融合蛋白。
附图说明
图1大肠杆菌表达的人轮状病毒VP8P[8]-破伤风毒素多肽1(TT 1)的融合蛋白。
图2大肠杆菌表达的人轮状病毒VP8P[8]蛋白。
图3大肠杆菌表达的轮状病毒VP8P[8]-白喉毒素多肽4(DT4)的融合蛋白。
图4大肠杆菌表达的轮状病毒VP8P[8]-破伤风毒素多肽1(TT 1)的融合蛋白。
图5大肠杆菌表达的轮状病毒VP8P[8]-白喉毒素多肽3(DT3)的融合蛋白。
图6 10只豚鼠的平均血清中和抗体滴度。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1
筛选外源多肽和融合蛋白
破伤风毒素和白喉毒素作为人用疫苗有近100年的历史。选用其片段多肽用作轮状病毒疫苗有安全的保障。通过对破伤风毒素和白喉毒素蛋白一级结构用SwissInstitute Bioinformatics软件(http://web.expasy.org/compute_pi/)分析,筛选出4个多肽片段(如表一所示)。其中一个来自破伤风毒素，三个来自白喉毒素。这些多肽片段含有1到3个带负电荷的氨基酸(天冬氨酸或谷氨酸)，而带正电荷的(精氨酸和赖氨酸)极少甚至没有，所以这些多肽的等电点都非常低。本实施例中，以DT4多肽作为对照，DT4多肽顺序为GlyValLeuLeuProThrIleProGlyLysLeuAspValAsnLysSerLysThrHisIle，其等电点为9.7，其中含有三个正电荷的赖氨酸。TT1、DT1、DT2、DT3中带负电荷的氨基酸为天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)(TT：破伤风毒素；DT：白喉毒素；AA：氨基酸)。
表一外源多肽及其等电点(http://web.expasy.org/compute_pi/)
多肽
Amino acid Sequence
pI
TT1(AA632-651)
Seq ID NO:1 IDKISDVSTIVPYIGPALNI
4.21
DT1(AA331–350)
Seq ID NO:2 QSIALSSLMVAQAIPLVGEL
4.0
DT2(AA351–370)
Seq ID NO:3 VDIGFAAYNFVESIINLFQV
3.67
DT3(AA411–430)
Seq ID NO:4 QGESGHDIKITAENTPLPIA
4.65
在本实施例中，将TT1、DT1、DT2、DT3、DT4多肽与轮状病毒的VP8蛋白进行融合表达，得到如下融合蛋白(不含外源多肽的VP8P[8]本身作为对照)。其中VP8蛋白如表二所示。
1)VP8P[8]本身
2)DT4-VP8P[8]融合蛋白
3)TT1-VP8P[8]融合蛋白
4)DT2-VP8P[8]融合蛋白
5)TT1-VP8P[4]融合蛋白
6)TT1-VP8P[6]融合蛋白
表二：轮状病毒VP8蛋白的氨基酸序列
轮状病毒毒株(基因库号)
VP8P型
VP8蛋白氨基酸顺列
DS1 strain(EF672577)
VP8P[4]
Seq ID NO:5
1076株(M88480)
VP8P[6]
Seq ID NO:6
Wa株(JX406750)
VP8P[8]
Seq ID NO:7
其中VP8P[8]的序列来源于Rotavirus A strain Human-tc/USA/Wa/1974/G1P[8]segment 4(Gene Bank号：JX406750)的蛋白序列的氨基酸集团64-223，不含氨基酸集团1-63的顺序。也不含脯氨酸比较多的氨基酸序列224-248。
其中VP8P[4]的序列来源于Rotavirus A strain RVA/Human-tc/USA/DS-1/1976/G2P1B[4]outer capsid(Gene Bank号：EF672577)。蛋白序列的氨基酸集团64-223，不含氨基酸集团1-63的顺序。也不含脯氨酸比较多的氨基酸序列224-248。
其中VP8P[6]的序列来源于Human rotavirus outer capsid protein(VP4)mRNA(segment 4)Gene Bank号：M88480)的蛋白序列的氨基酸集团64-223，不含氨基酸集团1-63的顺序。也不含脯氨酸比较多的氨基酸序列224-248。
为了防止外源性多肽影响VP8蛋白的2级和3级结构，在外源多肽和VP8蛋白之间增加了一个链接肽(GSGSG)。链接肽由不带正电或负电荷的氨基酸组成，所以不影响融合蛋白的等电点。
如表三所示，为融合蛋白的等电点。计算结果表明，用TT1-VP8融合蛋白比VP8蛋白自身的等电点下降了0.2-0.3。DT2-VP8融合蛋白比VP8蛋白自身的等电点下降了0.3-0.5pH单位。而对照组DT4-VP8融合蛋白比VP8蛋白自身的等电点提升了0.7到1。
表三：融和蛋白的等电点(http://web.expasy.org/compute_pi/)
实施例2
构建表达系统和蛋白纯化
VP8蛋白是一个非糖基化的蛋白，因此，选择了购自Merck Mllipore大肠杆菌表达系统。所用的质粒为pET30a；宿主细胞E.coli BL21(DE3)。首先对上述六个蛋白的DNA序列进行了密码子优化，然后将其人工合成核苷酸序列(http://www.blueheronbio.com/)，并克隆到pET30a质粒表达系统。然后将有目标基因的质粒转化入BL21(DE3)感受态菌体内，进行抗生素筛选。确认挑取生长好的菌落在摇瓶中37℃培养至浊度为1-1.5(OD600)，然后把培养的温度降低到20℃，加入2mM的IPTG诱导表达4-6个小时。然后将菌体收集，高压裂解(ATS裂解仪)，和离心。在离心前后分别取样(离心前的为样品1，离心后的为样品2。所有样品用SDS-PAGE分析检验目标蛋白的表达总量(离心前的样品1)，和可溶的上清液中蛋白量样品2。表达总量减去上清液中蛋白量即为包涵体表达的蛋白量。
如图1所示(样品1：大肠杆菌全菌的裂解物；样品2：大肠杆菌全菌的裂解物离心后的上清液；MW：分子量标记)，在IPTG诱导以前，没有表达融合蛋白。在IPTG诱导以后，VP8P[8]本身的表达量只有约四分之一为可溶性蛋白(如图2中样品2所示，图2中大肠杆菌表达的人轮状病毒VP8P[8]蛋白自身多为包涵体(样品1-全菌的裂解物)；样品2-裂解物离心后的上清液含少量的水溶行蛋白)。DT4-VP8P[8]融合蛋白几乎全部为不溶性的包涵体，因为上清中几乎没有目标蛋白(如图3中样品2所示，图3中大肠杆菌表达的轮状病毒VP8P[8]-白喉毒素多肽4(DT4)的融合蛋白几乎全在包涵体(样品1-全菌的裂解物)；离心后的上清液(样品2)几乎没有目标蛋白)。TT1-VP8P[8]融合蛋白可溶性非常高，至少有70％的是可溶性蛋白(如图4中样品2所示，图4中大肠杆菌表达的轮状病毒VP8P[8]-破伤风毒素多肽1(TT1)的融合蛋白几乎全是可溶性蛋白，即全菌的裂解物(样品1)；离心后的上清液(样品2)含有等量的目标蛋白)。同样，DT3-VP8P[8]融合蛋白几乎全部为可溶性蛋白(如图5中样品2所示，图5中大肠杆菌表达的轮状病毒VP8P[8]-白喉毒素多肽3(DT3)的融合蛋白几乎全是可溶性蛋白(样品1：全菌的裂解物)；离心后的上清液(样品2)中含有等量的目标蛋白)。表达试验的结果证明等电点低的外源性多肽与VP8的融合蛋白可溶性高。
将表达TT1-VP8P[8]融合蛋白的菌株进行了3升的发酵可溶性的蛋白约为70％-100％
在表达TT1-VP8P[4],TT1-VP8P[6],TT1-VP8P[8]融合蛋白的分别挑选一个克隆，在摇瓶中培养，并扩大到10升的发酵罐中在37℃发酵。当细菌的密度达到1-1.2(OD600)时，添加2mM的Isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside(IPTG)，把培养温度降低到20℃继续培养12个小时。然后通过离心(1.2万×g)收获菌体。把菌体悬浮在磷酸盐缓冲液中，用ATS破碎仪处理两遍，离心去除细菌碎片。收集的上清通过Q琼脂糖和Butyl-650M疏水层析获得融合蛋白(方法参见：Fix AD,Harro C,McNeal M,Dally L,Flores J,Robertson G,Boslego JW,Cryz S.Safety and immunogenicity of a parenterally administeredrotavirus VP8 subunit vaccine in healthy adults.Vaccine.2015 Jul 17；33(31):3766-72.)。
SDS-PAGE检测分析证明菌体表达的蛋白基本都是可溶性蛋白，融合蛋白约为95-98％。纯化后三个融合蛋白的产量分别为每升0.82克(TT1-VP8P[4]),0.67克(TT1-VP8P[6]),0.95克(TT1-VP8P[8])。这个产量是文献报道的产量(专利号CN103319604B)20倍以上。
实施例3
单克隆抗体的生产。本实施例中，利用VP8P[8]蛋白免疫小白鼠(BALB/c)生产单克隆抗体。用20微克的VP8P[8]吸附到100微克的氢氧化铝上用来皮下注射小白鼠3次，每次间隔7天。第21天采血，通过酶联免疫反应测试发现血清中有很高滴度的抗VP8P[8]蛋白的抗体(1：105稀释阳性)。一只小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合培养，用VP8P[8]蛋白包被的酶联免疫反应筛选得到22个单克隆抗体。然后利用荧光标记的方法进一步检测这些单克隆抗体是否能够结合到病毒表面的VP8蛋白。在6孔细胞培养盘，生长100％MA104细胞单层上面，加入约100x CC ID50的JX406750病毒。在37度培养18小时后，加入单克隆抗体培养液(1：10稀释)，然后在37度下放置2小时。然后洗涤3次，加入FITC荧光标记的兔抗小鼠的抗血清(1:1000稀释)。在37度放置1小时，洗涤后在荧光显微镜下观察。VP8P[8]蛋白生产的22个单克隆抗体没有一个与病毒反应。
通过上述同样的方法，用TT1-VP8P[8]免疫小鼠生产了23个单克隆抗体，其中13抗体与病毒反应。
同样，通过上述方法，用DT4-VP8P[8]免疫小鼠生产了29个单克隆抗体，其中1抗体与病毒反应。
本实施例的实验结果证明TT1-VP8P[8]的构象与病毒表面的VP8蛋白更相近。带负电的多肽的另一个功能是能够提高目标蛋白的3级结构质量即保护抗原表位，使其接近于病毒表面的结构。这个优势也许与带负电的多肽提到目标蛋白的可溶性高有关。
实施例4
疫苗的配制。在本实施例中，在疫苗的配置中加入了铝盐佐剂。铝盐佐剂是预防幼儿传染病的疫苗中所使用的唯一佐剂。在现有技术中，有非常有效和安全的数据。常用的铝盐佐剂有氢氧化铝和磷酸铝两种。专利号CN103319604B公开了利用磷酸铝佐剂配制VP8蛋白的轮状病毒疫苗。有关报道也公开了利用氢氧化铝配制VP8蛋白的轮状病毒疫苗。(FixAD,Harro C,McNeal M,Dally L,Flores J,Robertson G,Boslego JW,Cryz S.Safety andimmunogenicity of a parenterally administered rotavirus VP8subunit vaccine inhealthy adults.Vaccine.2015 Jul 17；33(31):3766-72.和Groome MJ,Koen A,Fix A,Page N,Jose L,Madhi SA,McNeal M,Dally L,Cho I,Power M,Flores J,Cryz S.Safetyand immunogenicity of a parenteral P2-VP8-P[8]subunit rotavirus vaccine intoddlers and infants in South Africa:a randomised,double-blind,placebo-controlled trial.Lancet Infect Dis.2017 Aug；17(8):843-853.)
但是对于本申请全新的VP8融合蛋白，由于其蛋白特性与单独的VP8存在本质区别，在疫苗制备中，是否可以将氢氧化铝和磷酸铝作为TT1-VP8P[4],TT1-VP8P[6],TT1-VP8P[8]的佐剂并不能推断出。因此本实施例对佐剂的选择进行了试验，将TT1-VP8P[4],TT1-VP8P[6],TT1-VP8P[8]三个融合蛋白与磷酸铝和氢氧化铝分别进行了配制,测定蛋白是否吸附到佐剂。只有吸附抗原的铝盐才能作为适用于本申请的佐剂。
配制的方法是用1毫升的融合蛋白(含0.1毫克蛋白)与1毫升的铝盐佐剂混合在4℃下混合16-18小时，然后离心。在离心前后分别取样，用BCA试剂盒测定样品中的蛋白含量。上清液中的蛋白代表没有吸附到铝盐颗粒的表面。离心前的样品按100％可以算出蛋白吸附的百分率(如表四所示)。结果表明，磷酸铝不能吸附任何融合蛋白，也不能用来配制作为轮状病毒疫苗。氢氧化铝吸附融合蛋白的量达到95％以上，可用于本申请疫苗的制备。
表四：铝盐佐剂的筛选
实施例5
VP8蛋白的序列分析。通过分析基因库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)中VP8蛋白的氨基酸序列,发现在同一个P-型的不同毒株之间VP8蛋白的序列非常相似(如表五所示)。11个P[4]型的毒株的VP8蛋白和EF672577毒株的VP8蛋白至少有95％相同；11个P[6]型的毒株的VP8蛋白与M88480毒株的VP8蛋白至少92％相同；16个P[8]型的毒株的VP8蛋白和JX406750毒株的VP8蛋白至少92％相同；不过不同P型之间，VP8蛋白的差异比价大。P[6]型的VP8蛋白与其它两个型有65％的序列相同，P[4]和P[8]之间约85％相同。本申请提供的轮状病毒疫苗为三价轮状病毒疫苗，包括P[4]型VP8融合蛋白、P[6]型VP8融合蛋白、P[8]型VP8融合蛋白。所述P[4]型VP8融合蛋白的VP8序列选择于表五中12株P[4]型毒株，所形成的融合蛋白均具有高表达量，高水溶性，抗体滴度高的特点。所述P[6]型VP8融合蛋白的VP8序列选择于表五中12株P[6]型毒株，所形成的融合蛋白均具有高表达量，高水溶性，抗体滴度高的特点。所述P[8]型VP8融合蛋白的VP8序列选择于表五中17株P[8]型毒株，所形成的三价轮状病毒疫苗均具有高表达量，高水溶性，抗体滴度高的特点。利用上述融合蛋白所形成的三价轮状病毒疫苗均具有较高效价。
表五:同一个P-型VP8蛋白的氨基酸顺序序列相同的百分比
实施例6
VP8融合蛋白的免疫原性和病毒中和效价。
将上述配制的氢氧化铝疫苗用PBS进行1：5稀释。每0.5毫升的配液含10微克的蛋白(TT1-VP8P[4],TT1-VP8P[6],或者TT1-VP8P[8])和100微克的铝。在第一天和第14天分别免疫5只豚鼠。注射部位为右侧后退上部。第28天抽血检测中和抗体的滴度。中和实验选用的病毒包括目标蛋白来源的病毒毒株(EF672577，M88480和JX406750)和与目标蛋白来源的病毒毒株的VP8蛋白顺序差异最大的两个毒株。所选毒株及VP8的序列见表六。每组5只豚鼠的血清各区100微升混合，然后用现有技术中报道的方法测定对9个不同毒株的中和抗体的滴度。
表七的结果表明，抗TT1-VP8P[4]蛋白的血清对三个P[4]型的毒株都有较高的中和抗体滴度。尽管他们之间的VP8蛋白顺序有5％的差异，但中和抗体的滴度差异不大。但该血清对是P[6]型的三个毒株没有任何的中和能力。对P[8]型的三个毒株有中和能力，但滴度比对P[4]型的低约3倍。
抗TT1-VP8P[6]蛋白的血清对三个P[6]型的毒株都有较高的中和抗体滴度。但对P[4]和P[8]的任何一个毒株都没有中和能力。
抗TT1-VP8P[8]蛋白的血清对三个P[8]型的毒株都有较高的中和抗体滴度。尽管他们之间的VP8蛋白顺序有8％的差异，但中和抗体的滴度差异不大。但该血清对是P[6]型的三个毒株没有任何的中和能力。对P[4]型的三个毒株有中和能力，但滴度比对P[8]型的低约5倍。
上述结果表明，3个P型中各取任何一个毒株的VP8蛋白形成的一个3价的疫苗(即P[6]、P[8]和P[4]蛋白形成的三价疫苗)，或者P[6]与P[8]的VP8蛋白形成的两价疫苗具有广泛的保护作用，其中P[8]蛋白的免疫作用对P[4]蛋白所引起的疾病也具有保护作用。
表六：代表性不同P-型的VP8蛋白的氨基酸序列
表七：中和抗体滴度
实施例7
三价轮状病毒疫苗的动物免疫实验。
按照上述的配制方法，我们把3个融合蛋白首先混合在一起，然后与氢氧化铝混合并搅拌16个小时，配制了1升3价的轮状病毒疫苗，每毫升的疫苗含有400微克的氢氧化铝和150维克的融合蛋白(每个融合蛋白各50微克)。
轮状病毒疫苗的免疫原性用豚鼠实验测定。5只雄性和5只雌性豚鼠在分别在第1，14和28天注射一针疫苗。注射部位为右侧大腿的肌肉。每只每次注射量为0.2毫升，含3个融合蛋白各10微克和氢氧化铝80微克。第42天收集血液，分离血清。使用先前文献中报道的方法针把血清中对三个轮状病毒毒株(Wa,DS-1,1076)的中和抗体滴度进行测定(方法参见：Knowlton DR,Spector DM,Ward RL.Development of an improved method formeasuring neutralizing antibody to rotavirus.J Virol Methods.1991 Jun；33(1-2):127-34.)。中和抗体的滴度为病毒噬斑减少60％的血清稀释度。
全部10个豚鼠的血清中都有针对每一个P-型轮状病毒的中和抗体。平均水平达到800-1200的范围(如图6所示)。证明3价的轮状病毒疫苗有广泛的保护作用。
本发明所附需列表中分别为以下序列：
Seq ID NO:1破伤风毒素多肽氨基酸顺序,tetanus toxin peptide sequence(TT1)
Seq ID NO:2白喉毒素多肽氨基酸顺序,Diphtheria toxin peptide sequence(DT1)
Seq ID NO:3白喉毒素多肽氨基酸顺序，diphtheria toxin peptide sequence(DT2)
Seq ID NO:4白喉毒素多肽氨基酸顺序，diphtheria toxin peptide sequence(DT3)
Seq ID NO:5轮状病毒DS1菌株(G2[P4])VP8蛋白氨基酸顺序，human rotavirus ADS1 strain VP8 protein sequence(GenBank:EF672577.1)
Seq ID NO:6轮状病毒1076毒株(G2[P6])VP8蛋白氨基酸顺序，human rotavirusA 1076 strain VP8 protein sequence(Genbank access:KP883122)
Seq ID NO:7轮状病毒Wa毒株(G1[P8])VP8蛋白氨基酸顺序，human rotavirus AWa strain VP8 protein sequence(GenBank:JX406750.2)
Seq ID NO:8轮状病毒G2P[4]VP8顺序,human rotavirus A G2P[4]VP8 sequnece(GenBank:AIS93125)
Seq ID NO:9轮状病毒G2P[4]VP8蛋白氨基酸顺序,human rotavirus A strainVP8 protein aninal ancid sequence(GenBank:AIS93107)
Seq ID NO:10轮状病毒VP8蛋白氨基酸顺序,human rotavirus A VP8 proteinaminoa acid sequencce(GenBank:AIY25972)
Seq ID NO:11轮状病毒VP8[P6]蛋白氨基酸顺序.human rotavirus A VP8[P6]sequencce(GenBank:ADE44939)
Seq ID NO:12轮状病毒VP8[P6]蛋白氨基酸顺序.Human rotavirus A VP8protein sequence(GenBank:A72618)
Seq ID NO:13轮状病毒VP8 G12P[8]蛋白氨基酸顺序.human rotavirus A VP8protein sequencce(GenBank:ALU63988)
序列表
<110> 成都迈科康生物科技有限公司
<120> 一种人轮状病毒VP8重组蛋白以及利用该VP8重组蛋白的轮状病毒疫苗
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<213> 破伤风梭菌(Clostridium tetani)
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<213> 白喉杆菌(Corynebacterium diphtheriae)
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<212> PRT
<213> 白喉杆菌(Corynebacterium diphtheriae)
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<213> 人轮状病毒(human rotavirus A)
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<213> 人轮状病毒(human rotavirus A)
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<213> 人轮状病毒(human rotavirus A)
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<213> 人轮状病毒(human rotavirus A)
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180 185 190
Leu Asn Gly Ile Ser Ile Thr Ile His Ser Glu Phe Tyr Ile Ile Pro
195 200 205
Arg Ser Gln Glu Ser Lys Cys Asn Glu Tyr Ile Asn Asn Gly Leu Pro
210 215 220
Pro Ile Gln Asn Thr Arg Asn Val Val Pro Leu Ser Leu Ser Ser Arg
225 230 235 240
Ser Ile Gln Tyr Lys Arg Ala Gln
245