一种牛轮状病毒重组vp8蛋白与应用
阅读说明：本技术 一种牛轮状病毒重组vp8蛋白与应用 (Bovine rotavirus recombinant VP8 protein and application thereof ) 是由 汤承 岳华 王远微 姜晓明 于 2021-09-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种牛轮状病毒重组VP8蛋白与应用。本发明的牛源轮状病毒重组VP8蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明重组VP8蛋白具有良好的抗原性和免疫原性,能够在原核系统中高效表达,本发明的亚单位疫苗可以产生较高水平的中和抗体,适用于作为轮状病毒亚单位疫苗。(The invention discloses a bovine rotavirus recombinant VP8 protein and application thereof. The amino acid sequence of the bovine rotavirus recombinant VP8 protein is shown in SEQ ID NO. 1. The recombinant VP8 protein has good antigenicity and immunogenicity, can be efficiently expressed in a prokaryotic system, can generate a high-level neutralizing antibody, and is suitable for being used as a rotavirus subunit vaccine.)
技术领域
本发明涉及分子生物学和基因工程领域，具体涉及一种牛轮状病毒重组VP8蛋白与应用。
背景技术
A群轮状病毒(Group A rotavirus,RVA)是一种人畜共患病毒，是导致全世界儿童与幼畜急性腹泻的重要病原体。牛轮状病毒(Bovine Rotavirus，BRV)可通过粪口途径和呼吸道途径传播，给全世界养牛业带来巨大的经济损失，在中国，根据多个学者的研究表明BRVA在我国腹泻犊牛中的检出率为21.4％～90.91％。RV VP4决定轮状病毒的P基因型。迄今为止，51个P型已经被发现，在BRVA中证实了14个P型的存在，P[1]、P[5]、P[11]基因型在BRVA中最为常见。在我国牛群中检测出的P型有P[1]、P[5]、P[7]、P[11]，其中G6P[1]型BRVA在我国牛群中广泛流行。2019～2020年也有学者研究证实了我国青藏高原地区牦牛源BRV与我国部分省奶牛源BRV优势基因型为G6P[1]型，且牦牛源与奶牛源BRV遗传关系最近，表明了G6P[1]型BRV在我国牦牛与奶牛中广泛传播。
BRV的VP4蛋白由第4节段基因编码，全长约为2356bp，完整ORF为2331bp，共编码776个氨基酸。VP4蛋白能诱导机体产生中和抗原，是BRV的重要保护性抗原之一。在胰蛋白酶的作用下，VP4蛋白可裂解为VP8亚基(氨基酸位置：1～231)和VP5亚基(氨基酸位置：248～776)，VP8蛋白具有VP4蛋白的主要抗原表位，且决定着VP4蛋白的特异性血清中和反应。目前，已经鉴定出VP8亚基中的4个中和表位(8-1，8-2，8-3和8-4)，其特异性中和抗体在轮状病毒株之间显示出有限的交叉中和作用。因此VP8基因为牛轮状病毒亚单位疫苗重要靶基因。有研究发现人源RV VP8蛋白可诱导病毒中和抗体和小鼠相关保护，细菌表达的VP8蛋白可诱导高水平的病毒中和抗体，具有可观的疫苗潜力。
目前治疗轮状病毒尚无特效药物，一般通过提高环境卫生、提供清洁的水源来进行预防，但仅仅依靠上述方法并不能降低发病率和阻止病毒的传播。且现已经上市的轮状病毒疫苗均为减毒活疫苗，有较高的肠套叠风险，因此，开发出一种更加安全有效、能够避免毒力复壮和散毒的风险的牛轮状病毒亚单位疫苗具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种牛轮状病毒G6P[1]型重组VP8蛋白及其应用，该重组蛋白特异性高，可溶性表达易纯化制备、成本低，可作为抗原能够刺激机体产生中和抗体抗体，适用于制备治疗和/或预防轮状病毒的亚单位疫苗。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一目的在于提供一种牛轮状病毒VP8重组蛋白，所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的第二目的在于提供一种编码权利要求1所述重组蛋白的基因。
进一步地，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明的第三目的在于提供一种重组表达载体，是采用上述基因优化得到。
进一步地，所述优化得到的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
进一步地，所述核苷酸序列中在5’端有酶切位点Nde I，3’端有酶切位点Xho I，N端有His标签。
本发明在构建表达载体时，在已知基因序列的情况下，利用生物软件对基因序列进行了大肠杆菌偏爱密码子优化，将改造后的序列全序列合成，无需单独设计完全扩增目的基因的引物，避免了直接从临床样本或实验室培养物中扩增的对实验进程的影响，同时也便于对序列进行表达系统相应偏爱密码子优化和改造，有利于提高重组蛋白在表达系统中的产量和表达效率。
进一步地，所述重组表达载体为原核表达载体，用于原核重组表达系统。
所述原核表达载体包括但不限于pJLA50X系列、pET系列、pQE系列、pMAL系列、pGEX系列、pBAD系列载体中的一种，在本发明的
具体实施方式
中，所述原核表达载体为pET系列，进一步为pET30a表达载体。
进一步地，所述原核重组表达系统的制备方法，包括如下步骤：用上述的重组表达载体转化至大肠杆菌细胞，在LB液体培养基中培养，IPTG诱导表达获得重组蛋白。
本发明的表达菌株培养方式简单，培养周期短，可在几天时间内合成大量重组蛋白。
本发明通过原核表达系统可以在短期内获得大量优良的重组蛋白，抗原蛋白通过原核表达系统表达成可溶性表达，可溶蛋白无需在变性条件下纯化，弥补了原核表达系统缺少像真核系统重组蛋白表达后的修饰能力、不能产生正确的二硫键的缺点，以及减少了复性步骤，同时缩短了重组蛋白的表达时间、提高了重组蛋白的生产效率。
本发明的第四目的在于提供一种上述重组蛋白、上述基因、上述重组表达载体在制备预防和/或治疗轮状病毒引起的动物腹泻的疫苗中的应用。
进一步地，所述疫苗为亚单位疫苗。
进一步地，所述疫苗还包括药学上可接受的佐剂，进一步为201佐剂。
本发明具有如下有益效果：
(1)本发明优化后的重组蛋白特异性高，易纯化制备、成本低，可作为抗原能够刺激机体产生高水平的中和抗体，适用于制备轮状病毒疫苗。
(2)本发明将优化后的G6P[1]型重组VP8蛋白引入轮状病毒亚单位疫苗中，大大的提高了疫苗的免疫效力，得到的疫苗中和效价高，可实现规模化生产，具有很好的商品化开发前景。
(3)本发明优化后的蛋白是非复制型的，在机体内不增殖，不存在散毒危险，安全性高。
附图说明
图1是本发明牛轮状病毒优化重组VP8基因的重组表达质粒pET-30a-VP8鉴定图；
图2是本发明优化后的牛轮状病毒优化重组VP8基因蛋白表达分析图；
图3是本发明纯化的牛轮状病毒优化重组VP8基因蛋白SDS-PAGE电泳结果图；
图4是本发明牛轮状病毒优化重组VP8基因蛋白的Western blot检测图；
图5是间接ELISA方法检测兔血清抗体消长曲线图。
图1中，其中M表示DNA标准DL2000，1表示基因扩增产物；图2中，M表示蛋白分子质量标准，1表示诱导前总蛋白，2表示20℃上清，3表示20℃沉淀，4表示37℃上清，5表示37℃沉淀；图3中，M表示蛋白分子质量标准，1表示上样液，2表示流出液，3表示20mmol/LImidazole洗脱组分，4表示50mmol/L Imidazole洗脱组分，5表示500mmol/L Imidazole洗脱组分；图4中，M表示蛋白分子质量标准，1表示VP8蛋白。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例中使用的病毒液为西南民族大学动物医学实验室保存的BRV G6P[1]毒株，TCID50：10-5.76。
需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。实施例中的数值均为平均值。
实施例1
一种制备奶牛轮状病毒重组VP8基因蛋白的方法，包括以下步骤：
(1)BRV G6P[1]VP8基因的扩增：经前期对我国部分地区奶牛以及我国青藏高原地区牦牛轮状病毒分子流行病学调查显示，SDA2株轮状病毒为牛轮状病毒优势基因型。取适量由西南民族大学动物医学实验室保存的牛轮状P[1]型株病毒核酸阳性的粪便样本，按常规方法提取总RNA并反转录合成cDNA，进行RT-PCR扩增，特异性引物：F:GATGACACCATATGGAGCCTATCCTGGACG；R：GACACCTCGAGCTGGATCGGCGGCAGGCC。利用生物软件将基因片段拼接，获得一个完整的VP8基因的ORF序列，大小为501bp，其氨基酸序列由SEQ IDNO：1所示，编码170个的氨基酸，其核酸序列如SEQ ID NO：2所示。
(2)将获得的VP8基因序列进行优化，在不改变任何氨基酸情况下，使其密码子偏好性接近大肠杆菌，优化后的VP8编码基因如SEQ ID No：3所示，在其5’增加酶切位点NdeI，3’增加酶切位点Xho I，N端添加His标签，然后将序列送至引物合成公司合成，Nde I和Xho I位点序列分别为CATATG、CTCGAG。将合成的序列作为模板Nde I和Xho I双酶切后，与同样经过Nde I和Xho I双酶切的pET-30a载体连接转化TOP10感受态，挑单克隆菌落，菌落PCR鉴定阳性克隆送测序。优化后的VP8编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，符合预期，证明成功获得了pET-30a-VP8表达质粒，大小为5923bp。(如图1)。
(3)将步骤(2)中获得的pET-30a-VP8表达质粒转化BL21(DE3)，涂布LB固体培养基(含卡那霉素30ug/ml)，于恒温培养箱中37℃过夜培养。次日，挑单克隆菌落接入10mL LB液体培养基(含卡那霉素30ug/ml)中，37℃振摇培养10h。
(4)次日，菌种以1:100接入200mL LB液体培养基(含卡那霉素30ug/ml)，37℃振摇培养至OD约为0.6～0.8时，加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG，一组20℃诱导过夜，另一组37℃诱导6h，同时以不添加IPTG组作为阴性对照。离心收集菌体，以PBS 1:100(W/V)重悬，超声破碎、离心后分别收集上清和沉淀，沉淀用包涵体溶解液(8mol/L Urea，50mmol/L Tris-HCl，300mmol/L NaCl，pH8.0)1:20(W/V)溶解，以12％的分离胶进行SDS-PAGE分析，结果显示VP8融合蛋白以可溶形式表达(如图2)。
(5)大量诱导表达牛轮状病毒VP8重组蛋白，制备溶解液，按照镍琼脂糖亲和层析蛋白纯化说明书使用方法以5mL HisCap 6FF镍离子纯化柱进行纯化，以12％分离胶进行SDS-PAGE电泳(如图3)。收集到的组分进行SDS-PAGE检测后，纯度最好的几组分透析至50mmol/L Tris，300mmol/L NaCl，pH8.0溶液中，经过PEG20000浓缩，0.45μm滤膜过滤后分装1mL/管，-80℃冻存，按照BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书使用方法进行复性后重组蛋白的浓度测定。
(6)取纯化后的重组蛋白样品，以12％的分离胶进行SDS-PAGE，然后将重组蛋白转移至硝酸纤维素膜，用5％脱脂牛奶进行封闭过夜处理；分别加入1:500倍稀释的兔抗牛轮状病毒阳性血清和胎牛血清，37℃摇床孵育2h，TBST洗涤3次，10min/次；加入1:5000倍稀释的HRP标记的羊抗兔二抗，37℃摇床孵育1h，TBST洗涤3次后进行ECL显色(如图4)，结果显示目的蛋白约20kD，能被兔抗牛轮状病毒阳性血清所识别，证明重组VP8蛋白具有生物活性和良好的免疫原性。
实施例2
轮状病毒重组VP8蛋白亚单位疫苗的制备
(1)取实施例1中纯化的重组VP8蛋白稀释为1mg/mL后与201佐剂同时水浴加热至31℃，将二者混合后在搅拌器内以350r/min的转速搅拌5min，搅拌完成后，将疫苗4℃放置过夜后进行疫苗的质量检测。
(2)无菌检测：VP8重组蛋白亚单位疫苗涂布于LB培养基上，37℃培养24h后无细菌生长。
(3)剂型检测；吸取少量VP8亚单位疫苗滴于去离子水中，疫苗与去离子水均匀混合，疫苗为水包油包水重组蛋白亚单位疫苗。
(4)初步稳定性检验：吸取1mL疫苗到1.5mL离心管中，以3000r/min、4℃的条件离心15min，疫苗无分层现象。
(5)安全性检测(动物接种法)：VP8重组的蛋白亚单位疫苗在室温下回温，颈部皮下注射6-8周龄BALB/c怀孕母鼠，接种剂量0.5mL，接种后小鼠精神状态良好，食欲正常，注射部位无红肿、脱毛等异常状况，怀孕母鼠未见流产。
(6)免疫原性测定：取10只新西兰大白兔分为实验组与对照组，每组5只。免疫前耳缘静脉采集所有兔的血液，用ELISA方法进行血清IgG检测。采取皮下注射免疫的方式，实验组注射1mL(1)制备的VP8重组蛋白亚单位疫苗，对照组注射1mLPBS，一免后间隔2周进行第二次免疫，共免疫2次。在初免后每周各进行一次耳缘静脉采血，共采集5周，并用间接ELISA检测血清特异性抗体。
间接ELISA检测程序及条件如下：100μl(1μg/ml)本发明重组VP8蛋白包被酶标板，4℃过夜。PBST洗涤后加入4％PEG6000封闭1h。PBST洗涤后加入1:64000稀释的待检血清，37℃1h。PBST洗涤后加入1:20000稀释的羊抗兔酶标二抗，37℃1h。PBST洗涤后加入显色液，37℃避光显色15min，加入终止液在450nm处读取OD450。ELISA检测结果(图5)显示免疫后兔产生了可检测的血清抗体，表明重组VP8蛋白具有良好的免疫原性。
(7)中和抗体效价的测定：取20只新西兰大白兔分为1-4组，每组5只。1组为对照组，2组为VP8亚单位疫苗组，3组为轮状病毒全病毒灭活疫苗组，4组为美国USDA批准的NCDV株G6单型BRV减毒活苗组。按照各组疫苗的免疫程序免疫兔子，免疫前对所有兔子耳缘静脉采血，第一次免疫后14d进行第二次免疫，共免疫2次，第二次免疫后14天采集各组兔子阳性血清，测定各组的中和抗体效价。
各组兔血清56℃水浴30min后进行病毒血清中和实验，使用固定病毒稀释血清法分别测定各组兔血清中和效价。先用DMEM营养液将实验组兔血清稀释50倍，再用DMEM营养液在96孔板中倍比稀释(21、22、23、……、210)后，每孔加入100μL 200倍TCID50病毒液，37℃培养箱孵育1h后加到MA104细胞的96孔板中，同时设立阳性对照孔(100μL病毒液加100μL维持液)与阴性对照孔(200μL维持液)每日观察至第4d。
采用Reed-Muench氏法计算出各组血清中和效价，实验记录出现CPE的细胞孔数，结果显示(表1)对照组血清免疫中和效价均为0，VP8亚单位疫苗免疫后的平均中和效价为1:17222，BRV灭活疫苗免疫组免疫后的平均中和效价为1:11120，NCDV株BRV减毒活苗免疫后的平均中和效价为1:14666。本发明VP8亚单位疫苗免疫后的中和效价最高。
表1是兔免疫前后血清抗体中和效价
本发明将优化后的重组VP8蛋白作为抗原，与佐剂混合制备得到的轮状病毒亚单位疫苗，用于皮下注射免疫可诱导机体产生可检测的、高水平的血清中和抗体，能够用于治疗和/或预防轮状病毒引起的幼龄动物腹泻症状。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的保护范围，凡是利用本发明的说明书所作的等效流程或等效结构的变换，或直接、或间接运用在其他相关的技术领域，均应同理包括在本发明的保护范围之内。
<110> 西南民族大学
<120> 一种牛轮状病毒重组VP8蛋白与应用
<130> 1
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 168
<212> PRT
<213> VP8重组蛋白
<400> 1
Glu Pro Ile Leu Asp Gly Pro Tyr Gln Pro Thr Thr Phe Asn Pro Pro
1 5 10 15
Val Ser Tyr Trp Met Leu Leu Ala Pro Thr Asn Ala Gly Val Val Ala
20 25 30
Glu Gly Thr Asn Asn Thr Asn Arg Trp Leu Ala Thr Ile Leu Ile Glu
35 40 45
Pro Asn Val Gln Ser Val Glu Arg Thr Tyr Thr Leu Phe Gly Gln Gln
50 55 60
Val Gln Ile Thr Val Ser Asn Asp Ser Gln Thr Lys Trp Lys Phe Val
65 70 75 80
Asp Val Ser Lys Gln Thr Gln Asp Gly Ser Tyr Ser Gln His Gly Pro
85 90 95
Leu Leu Ser Thr Pro Lys Leu Tyr Gly Val Met Lys His Gly Gly Lys
100 105 110
Ile Tyr Thr Tyr Asn Gly Glu Thr Pro Asn Ala Asn Ile Gly Tyr Tyr
115 120 125
Ser Thr Thr Asn Tyr Asp Ser Val Asn Met Thr Ala Tyr Cys Asp Phe
130 135 140
Tyr Ile Ile Pro Leu Ala Gln Glu Glu Lys Cys Thr Glu Tyr Ile Asn
145 150 155 160
Asn Gly Leu Pro Pro Ile Gln Leu
165
<210> 2
<211> 501
<212> DNA
<213> VP8基因
<400> 2
gaaccaatat tagacggacc atatcaaccg acgactttca acccaccggt gagttattgg 60
atgttactcg ctccgactaa cgcaggagtg gtagctgaag gcacaaataa tacaaatagg 120
tggctagcga caatattaat agaaccaaac gtgcagtcag ttgaaaggac ctacacatta 180
tttggtcagc aagtacaaat tacagtgtca aacgattctc aaacgaaatg gaaatttgta 240
gatgttagca aacaaacgca agatggcagc tattcacagc atggaccatt gttatcaaca 300
ccaaagctgt atggagtaat gaaacacgga ggtaaaatat atacatataa tggagaaaca 360
ccgaacgcga acatagggta ttattcaaca acaaattatg actctgttaa tatgacagcg 420
tattgcgatt tttatataat accattagcg caagaggaaa aatgtactga gtatataaat 480
aatggattac caccgataca a 501
<210> 3
<211> 513
<212> DNA
<213> VP8优化基因
<400> 3
catatggagc ctatcctgga cggtccatat caaccaacta ctttcaaccc gcctgtcagc 60
tactggatgc tgctggcacc gactaatgca ggtgttgttg ctgaaggtac taacaacact 120
aaccgttggc tggctaccat cctgatcgaa ccgaacgttc aaagcgtcga acgcacctat 180
acgctgttcg gtcagcaggt acagattacc gtaagcaacg actctcagac caagtggaaa 240
ttcgtggacg tgtctaaaca gacccaggat ggttcttact cccagcatgg tccgctgctg 300
tctaccccga aactgtacgg cgttatgaaa cacggcggca aaatttacac gtacaacggc 360
gaaaccccga atgcgaacat tggctattac tccacgacca actacgattc cgtgaacatg 420
accgcgtact gtgattttta tatcatcccg ctggcccagg aagagaaatg caccgaatat 480
atcaacaacg gcctgccgcc gatccagctc gag 513
<210> 4
<211> 176
<212> PRT
<213> VP8优化氨基酸
<400> 4
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1 5 10 15
Pro Val Ser Tyr Trp Met Leu Leu Ala Pro Thr Asn Ala Gly Val Val
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Ala Glu Gly Thr Asn Asn Thr Asn Arg Trp Leu Ala Thr Ile Leu Ile
35 40 45
Glu Pro Asn Val Gln Ser Val Glu Arg Thr Tyr Thr Leu Phe Gly Gln
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Gln Val Gln Ile Thr Val Ser Asn Asp Ser Gln Thr Lys Trp Lys Phe
65 70 75 80
Val Asp Val Ser Lys Gln Thr Gln Asp Gly Ser Tyr Ser Gln His Gly
85 90 95
Pro Leu Leu Ser Thr Pro Lys Leu Tyr Gly Val Met Lys His Gly Gly
100 105 110
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115 120 125
Tyr Ser Thr Thr Asn Tyr Asp Ser Val Asn Met Thr Ala Tyr Cys Asp
130 135 140
Phe Tyr Ile Ile Pro Leu Ala Gln Glu Glu Lys Cys Thr Glu Tyr Ile
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Asn Asn Gly Leu Pro Pro Ile Gln Leu Glu His His His His His His
165 170 175