一种猪轮状病毒重组蛋白以及表达该蛋白的重组腺病毒和应用
阅读说明：本技术 一种猪轮状病毒重组蛋白以及表达该蛋白的重组腺病毒和应用 (Porcine rotavirus recombinant protein, recombinant adenovirus expressing protein and application ) 是由 张华伟 徐高原 陈映瑾 周明光 罗修鑫 周飞燕 郝根喜 汤细彪 于 2021-01-13 设计创作，主要内容包括：本发明涉及兽医生物技术领域,尤其涉及一种猪轮状病毒重组蛋白以及表达该蛋白的重组腺病毒和应用。所述所述重组蛋白由猪轮状病毒5型VP7蛋白和猪轮状病毒9型VP8蛋白连接组成,具体包括如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。本发明将猪轮状病毒5型VP7蛋白和猪轮状病毒9型VP8蛋白的编码基因的基因序列构建至腺病毒表达载体中,并进行密码子优化,制备得到针对猪轮状病毒的重组腺病毒,该重组腺病毒表达的目的蛋白的结构和功能与天然状态完全一致,具有较高的安全性和免疫原性。(The invention relates to the field of veterinary biotechnology, in particular to a porcine rotavirus recombinant protein, a recombinant adenovirus expressing the protein and application thereof. The recombinant protein is formed by connecting a porcine rotavirus 5 type VP7 protein and a porcine rotavirus 9 type VP8 protein, and specifically comprises an amino acid sequence shown as SEQ ID NO. 1. The invention constructs the gene sequences of the coding genes of the porcine rotavirus 5 type VP7 protein and the porcine rotavirus 9 type VP8 protein into an adenovirus expression vector, and performs codon optimization to prepare the recombinant adenovirus aiming at the porcine rotavirus.)
技术领域
本发明涉及兽医生物技术领域，尤其涉及一种猪轮状病毒重组蛋白以及表达该蛋白的重组腺病毒和应用。
背景技术
猪轮状病毒(Porcine Rotavirus，RoRV)为没有囊膜的双链RNA病毒，属于呼肠孤病毒科(Reoviridae)轮状病毒属(Rotavirus)。作为重要病原之一，猪轮状病毒对于养猪业的危害主要在于引起仔猪病毒性腹泻。猪轮状病毒感染引起的仔猪病毒性腹泻是指由猪轮状病毒引起的仔猪以呕吐、厌食、脱水、腹泻和酸碱平衡紊乱为主要症状的疾病。由猪轮状病毒所引起的病毒性感染无论是单独感染或者交叉感染在猪群中均普遍存在，由此造成仔猪的患病甚至死亡给猪养殖业造成了巨大的经济损失。目前没有效果显著的药物用来治疗由猪轮状病毒感染引起的疾病，因此做好对猪轮状病毒感染的预防尤为重要，而接种疫苗能有效防控该疾病的爆发。
猪轮状病毒外衣壳蛋白主要由VP8与VP7组成，VP8与VP7是猪轮状病毒外膜上的主要中和抗原，能够刺激机体产生体液免疫和粘膜免疫，从而激发机体的免疫保护作用，因此，VP7和VP8基因是猪轮状病毒疫苗研制的主要候选基因。
腺病毒是目前最高效可靠的重组病毒表达系统之一，可用于在哺乳动物细胞中高水平地表达目的蛋白。因腺病毒感染不依赖细胞周期，故其既可以感染增殖细胞也可以感染非增殖细胞。同时其可感染的宿主范围广泛，可感染除人以外的几乎所有类型的细胞，且能将外源基因在靶细胞中持续表达10d以上。并且具有病毒颗粒稳定，病毒滴度高，可用于动物试验以及有较好的生物安全性等特点。虽然人腺病毒载体疫苗在人体中获得应用还需要更深入的研究，但是作为动物疫苗却很有前景，因为动物体内没有人腺病毒载体的中和抗体，相同的载体疫苗多次使用的概率也很低。
发明内容
为了至少解决一种现有技术存在的问题，本发明提供一种猪轮状病毒重组蛋白以及表达该蛋白的重组腺病毒和应用，通过将G5-VP7和G9-VP8构建至腺病毒表达系统中进行表达得到重组腺病毒，具有较高的免疫原性和安全性。
第一方面，本发明提供一种猪轮状病毒重组蛋白，所述重组蛋白由猪轮状病毒5型VP7蛋白和猪轮状病毒9型VP8蛋白连接组成。
进一步地，所述重组蛋白包括如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
本发明进一步提供用于编码所述重组蛋白的核酸，所述核酸包括如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
第二方面，本发明提供一种生物材料，所述生物材料包括所述核酸，所述生物材料为表达盒、载体或转基因细胞。
进一步地，所述生物材料为腺病毒表达载体pShuttle-CMV。
本发明进一步提供一种包括所述核酸的重组腺病毒。
本发明进一步提供所述重组腺病毒的制备方法，所述制备方法包括：
利用重组的方式将所述核酸的核苷酸序列插入到pShuttle-CMV载体上，并且在其前端插入IL-2信号的序列，在其后端插入8×HIS标签，得到重组腺病毒载体pShuttle-CMV-G5VP7-G9VP8，
使用重组腺病毒载体pShuttle-CMV-G5VP7-G9VP8转染HEK-293T细胞后进行培养，当出现明显细胞病变后，收集上清液即得。
进一步地，在构建得到重组腺病毒载体pShuttle-CMV-G5VP7-G9VP8后，还可以在重组腺病毒载体pShuttle-CMV-G5VP7-G9VP8上插入eGFP标签，便于重组病毒的观察。而且还可增加G5VP7-G9VP8的拷贝数，进一步提供重组蛋白的表达水平
进一步地，所述重组中用于扩增权利要求3所述核酸的引物对包括如下引物序列：
PoRV-G5VP7-G9VP8-F：
5’-GGTACCACCGCCATGTACAGGATGCAACTCCTG-3’，
PoRV-G5VP7-G9VP8-R：
5’-AAGCTTTCAGTGTACAATTGATCTAGAAGTTAGG-3’。
本发明进一步提供所述重组腺病毒在制备用于防治猪轮状病毒的药物中的应用。
第三方面，本发明提供一种疫苗，所述疫苗含有权利要求6所述的重组腺病毒。
本发明具备如下有益效果：
1、本方案使用的腺病毒真核表达体系高效、安全、人畜无害。
2、本方案所表达猪轮状病毒(PoRV)的目的蛋白G5-VP7和G9-VP8的序列进行了密码子优化使其表达水平得到提高，但其结构与功能与天然状态完全一致，最大程度地保留了其免疫原性。
3.本方案融合表达的猪轮状病毒(PoRV)的G5-VP7和G9-VP8蛋白分泌到细胞外，可以更好更快地被DC等抗原呈递细胞识别。
4.本方案所制备的腺病毒载体活疫苗用量少，产率高，抗原不需纯化，抗原免疫原性接近天然。
附图说明
图1为本发明提供的pShuttle-CMV-G5-VP7-G9-VP8图谱；
图2为本发明提供的重组质粒pShuttle-CMV-G5VP7-G9VP8的酶切鉴定结果；
图3为本发明提供的正常细胞和Ad-RV VP7-VP8感染的HEK-293T细胞的对比结果；
图4为本发明提供的目的蛋白PoRV-G5VP7-G9VP8的Western Blot检测结果；
图5为本发明提供的腺病毒Ad-PoRV-G5VP7-G9VP8载体疫苗接种后，猪体内中和抗体的检测结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
本实施例提供一种重组腺病毒的构建方法，具体流程如下：
1、构建转移载体pShuttle-CMV-G5VP7-G9VP8
1.1获取目的基因PoRV-VP7和VP8
根据腺病毒表达系统密码子的偏爱性，对猪轮状病毒5型VP7蛋白和9型VP8蛋白的核苷酸序列进行密码子优化。由生工生物工程股份有限公司进行基因合成。合成的基因序列见SEQ ID NO:1(在开头还包含一个IL-2信号肽)。合成的目的基因置于质粒载体pUC-SP上，即以pUC-SP-G5VP7-G9VP8的形式取得。
1.2构建重组转移载体pShuttle-CMV-PoRV-G5VP7-G9VP8
利用重组的方式将PoRV的G5-VP7和G9-VP8基因插入到pShuttle-CMV载体上，图谱见附图1：
(1)PCR扩增：通过PCR扩增，使插入片段5’和3’最末端分别带有和线性化载体两末端一致的序列(15-20bp)。引物如下：
PoRV-G5VP7-G9VP8-F：
5’-GGTACCACCGCCATGTACAGGATGCAACTCCTG-3’，
PoRV-G5VP7-G9VP8-R：
5’-AAGCTTTCAGTGTACAATTGATCTAGAAGTTAGG-3’。
PCR反应体系如下：
表1 PCR反应体系
PCR扩增后用琼脂糖核酸电泳分离片段，并切胶回收。
(2)酶切载体：本方案采用KpnI、HindIII两个酶切位点(购自TAKARA)，对pShuttle-CMV转移载体进行酶切。体系如下：
表2 酶切体系
酶切后用琼脂糖核酸电泳分离片段，并切胶回收。
(3)连接：通过PCR扩增，使插入片段5’和3’最末端分别带有和线性化载体两末端一致的序列，之后用Vazyme的One Step Cloning Kit进行连接，体系如下：
表3 连接体系
(4)转化：将连接产物转入大肠杆菌感受态DH10B中，涂平板。
(5)提取重组质粒pShuttle-CMV-G5VP7-G9VP8：从平板上挑取单克隆菌落，采用质粒抽提试剂盒提取质粒，KpnI、HindIII进行酶切鉴定正确后得到含PoRV的G5-VP7基因和G9-VP8基因的重组转移载体pShuttle-CMV-G5VP7-G9VP8，酶切鉴定结果见附图2。
2、构建重组质粒pAd-PoRV-G5VP7-G9VP8
2.1获得重组质粒：将pShuttle-CMV-G5VP7-G9VP8重组质粒用P meⅠ线性化后，酶切产物回收后，转化到含有骨架载体pAdEasy-1的E.coli BJ5183感受态细胞。挑取pAd-PoRV-G5VP7-G9VP8阳性克隆，摇菌后提取质粒。用PacⅠ对重组腺病毒质粒pAd-PoRV-G5VP7-G9VP8进行酶切鉴定，并送测序验证。
2.2获取大量重组质粒：取2μL重组转移质粒pShuttle-CMV-G5VP7-G9VP8转入100μL大肠杆菌感受态DH10B中，冰浴30min后，42℃热激1min，再冰浴3min，加入900μL无抗性的LB，37℃复苏4h，涂布于LB平板(含卡那霉素)中，37℃培养12-16h，挑取单克隆，用去内毒素试剂盒提取重组腺病毒质粒pAd-PoRV-G5VP7-G9VP8.
3、重组腺病毒pAd-PoRV-G5VP7-G9VP8的包装及扩增
3.1重组质粒线性化：用PacⅠ酶切后回收30kd左右的大片段。酶切体系如下：
表4 酶切体系
3.2重组腺病毒的包装：当HEK-293T细胞生长到80％左右时，按脂质体LipofectaminTM 2000说明书2μg质粒/孔转染，进行重组腺病毒pAd-PoRV-G5VP7-G9VP8包装。将细胞置于含5％CO2的37℃培养箱中孵育6h后换液，待细胞长满培养皿，将细胞传代于25cm2细胞培养皿中。待细胞长满瓶底时，再传入75cm2细胞培养瓶中，每天观察出毒迹象，即细胞收缩变圆，并伴随有细胞脱落，如附图3。转染12-14天后，当出现明显的细胞病变反应，且有50％以上细胞从培养瓶壁脱落后收集细胞，-80℃/37℃反复冻融3次，10000g离心10min，收集病毒上清，即为第一代病毒母液P1。
3.3重组腺病毒的扩增及滴度测定：将P1病毒再次感染HEK-293T细胞，感染48h后收集细胞，-80℃/37℃反复冻融3次，10000g离心10min收集病毒上清，标记为P2。同样方法用P2代病毒感染大量的HEK-293T细胞扩增病毒至P3代。利用CsCl梯度离心法对扩增的病毒进行纯化。将收集的病毒悬液进行病毒滴度的检测，根据CPE，按Reed-Muench法计算病毒滴度为1.8×1010TCID50/mL。
3.4 Western blotting检测目的蛋白PoRV-G5VP7-G9VP8的表达：提取重组腺病毒pAd-PoRV-G5VP7-G9VP8感染的HEK-293T细胞总蛋白，以His单抗作为一抗，进行Westernblotting检测，结果如附图4。
实施例2
本实施例利用实施例1制备得到的重组腺病毒制备成疫苗，并对其性能进行了检测，流程如下：
1、腺病毒Ad-PoRV-G5VP7-G9VP8载体疫苗在猪体内评价
1.1腺病毒Ad-PoRV-G5VP7-G9VP8载体疫苗在猪体内进行安全性评价：购买实验猪(14-21日龄的PoRV阴性猪)共8头，分为A、B两组，每组4只。A组每头颈部肌肉注射1010TCID50重组腺病毒(1mL)；B组每头颈部肌肉注射1mL灭菌PBS，连续观察14天，两组实验猪状态相同且均无异常反应，此结果表明该疫苗对猪是安全的。
1.2腺病毒Ad-PoRV-G5VP7-G9VP8载体疫苗在猪体内进行免疫原性评价：购买实验猪12只，随机分成A、B、C三组，每组4只。A组每头猪颈部肌肉注射109TCID50重组腺病毒(1mL)，B组每头猪颈部肌肉注射1010TCID50重组腺病毒(1mL)，C组免疫PBS，3周后以相同剂量加强免疫一次。首免后7天、14天、28天和42天进行前腔静脉采血，进行中和抗体检测。检测结果见附图5。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 武汉科前生物股份有限公司
<120> 一种猪轮状病毒重组蛋白以及表达该蛋白的重组腺病毒和应用
<130> KHP201117802.2
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 602
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Thr Ala Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu
1 5 10 15
Ala Leu Val Thr Asn Ser Met Tyr Gly Ile Glu Tyr Thr Thr Val Leu
20 25 30
Thr Phe Leu Ile Ser Leu Val Phe Val Asn Tyr Ile Leu Lys Ser Val
35 40 45
Thr Arg Thr Met Asp Phe Ile Ile Tyr Arg Phe Leu Leu Val Ile Val
50 55 60
Val Leu Ala Pro Phe Ile Lys Thr Gln Asn Tyr Gly Ile Asn Leu Pro
65 70 75 80
Ile Thr Gly Ser Met Asp Thr Pro Tyr Ala Asn Ser Thr Thr Ser Glu
85 90 95
Thr Phe Leu Thr Ser Thr Leu Cys Leu Tyr Tyr Pro Asn Glu Ala Ala
100 105 110
Thr Glu Ile Ala Asp Thr Lys Trp Thr Glu Thr Leu Ser Gln Leu Phe
115 120 125
Leu Thr Lys Gly Trp Pro Thr Gly Ser Val Tyr Phe Lys Gly Tyr Val
130 135 140
Asp Ile Ala Ser Phe Ser Val Glu Pro Gln Leu Tyr Cys Asp Tyr Asn
145 150 155 160
Ile Val Leu Met Lys Tyr Asp Gly Asn Leu Gln Leu Asp Met Ser Glu
165 170 175
Leu Ala Asp Leu Ile Leu Asn Glu Trp Leu Cys Asn Pro Met Asp Ile
180 185 190
Thr Leu Tyr Tyr Tyr Gln Gln Thr Asp Glu Ala Asn Lys Trp Ile Ser
195 200 205
Met Gly Thr Ser Cys Thr Ile Lys Val Cys Pro Leu Asn Ala Gln Thr
210 215 220
Leu Gly Ile Gly Cys Thr Thr Ile Asp Ile Asn Ser Phe Glu Thr Val
225 230 235 240
Ala Asn Ala Glu Lys Leu Ala Ile Thr Asp Val Val Asp Gly Val Asn
245 250 255
His Lys Leu Asp Val Thr Thr Asn Thr Cys Thr Ile Arg Asn Cys Lys
260 265 270
Lys Leu Gly Pro Arg Glu Asn Val Ala Val Ile Gln Val Gly Gly Pro
275 280 285
Asn Ile Leu Asp Ile Thr Ala Asp Pro Thr Thr Ala Pro Gln Thr Glu
290 295 300
Arg Met Met Arg Ile Asn Trp Lys Arg Trp Trp Gln Val Phe Tyr Thr
305 310 315 320
Ile Val Asp Tyr Val Asn Gln Ile Val Gln Val Met Ser Lys Arg Ser
325 330 335
Arg Ser Leu Asp Ser Ala Ala Phe Tyr Tyr Arg Val Gly Gly Gly Gly
340 345 350
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ser Leu Ile Tyr Arg Gln Leu Leu Ser
355 360 365
Asn Ser Tyr Thr Val Asp Leu Ser Asp Glu Ile Gln Ile Ile Gly Ser
370 375 380
Glu Lys Thr Gln Asn Val Thr Ile Asn Pro Gly Pro Phe Ala Gln Thr
385 390 395 400
Gly Tyr Ala Pro Val Asn Trp Gly Pro Gly Glu Thr Asn Asp Ser Thr
405 410 415
Thr Val Glu Pro Val Leu Asp Gly Pro Tyr Gln Pro Thr Thr Phe Asn
420 425 430
Pro Pro Val Ser Tyr Trp Ile Leu Leu Ser Pro Ser Asn Ala Gly Val
435 440 445
Val Val Glu Gly Thr Asn Asn Ser Asp Arg Trp Leu Ala Thr Ile Leu
450 455 460
Ile Glu Pro Asn Val Thr Ser Gln Ser Arg Thr Tyr Thr Leu Phe Gly
465 470 475 480
Gln Gln Glu Gln Ile Thr Val Glu Asn Val Ser Thr Thr Lys Trp Lys
485 490 495
Phe Val Asp Leu Ala Lys Thr Asp Val Asn Gly Thr Phe Thr Gln His
500 505 510
Gly Pro Leu Leu Ser Asp Thr Lys Leu Tyr Gly Val Met Lys Phe Ser
515 520 525
Gly Arg Leu Tyr Thr Tyr Asn Gly Glu Thr Pro Asn Ala Thr Thr Gly
530 535 540
Tyr Tyr Thr Thr Thr Asn Tyr Asp Thr Val Asn Met Thr Ser His Cys
545 550 555 560
Asp Phe Tyr Ile Ile Pro Arg Ser Glu Glu Asn Ala Cys Thr Asn Tyr
565 570 575
Ile Asn Asn Gly Leu Pro Pro Ile Gln Asn Thr Arg Asn Val Val Pro
580 585 590
Val Ser Leu Thr Ser Arg Ser Ile Val His
595 600
<210> 2
<211> 1821
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt gcactaagtc ttgcacttgt cacaaacagt 60
atgtacggca tcgagtacac caccgtgctg accttcctga tcagcctggt gttcgtgaac 120
tacatcctga agagcgtgac ccgcaccatg gacttcatca tctaccgctt cctgctggtg 180
atcgtggtgc tggccccctt catcaagacc cagaactacg gcatcaacct gcccatcacc 240
ggcagcatgg acacccccta cgccaacagc accaccagcg agaccttcct gaccagcacc 300
ctgtgcctgt actaccccaa cgaggccgcc accgagatcg ccgacaccaa gtggaccgag 360
accctgagcc agctgttcct gaccaagggc tggcccaccg gcagcgtgta cttcaagggc 420
tacgtggaca tcgccagctt cagcgtggag ccccagctgt actgcgacta caacatcgtg 480
ctgatgaagt acgacggcaa cctgcagctg gacatgagcg agctggccga cctgatcctg 540
aacgagtggc tgtgcaaccc catggacatc accctgtact actaccagca gaccgacgag 600
gccaacaagt ggatcagcat gggcaccagc tgcaccatca aggtgtgccc cctgaacgcc 660
cagaccctgg gcatcggctg caccaccatc gacatcaaca gcttcgagac cgtggccaac 720
gccgagaagc tggccatcac cgacgtggtg gacggcgtga accacaagct ggacgtgacc 780
accaacacct gcaccatccg caactgcaag aagctgggcc cccgcgagaa cgtggccgtg 840
atccaggtgg gcggccccaa catcctggac atcaccgccg accccaccac cgccccccag 900
accgagcgca tgatgcgcat caactggaag cgctggtggc aggtgttcta caccatcgtg 960
gactacgtga accagatcgt gcaggtgatg agcaagcgca gccgcagcct ggacagcgcc 1020
gccttctact accgcgtggg cggcggcggc agcggcggcg gcggcagcat ggccagcctg 1080
atctaccgcc agctgttcac caacagctac accatcgacc tgagcgacga gatcgaggag 1140
atcggcagcc tgaagagcca ggacgtgacc atcaaccccg gccccttcgc ccagaccggc 1200
tacgcccccg tgagctgggg ccccggcgag accaacgaca gcaccaccat cgagcccgtg 1260
ctggacggcc cctaccagcc caccaccctg aaccccccca tcgagtactg gaccctgttc 1320
gcccccaacg acaagggcat cgtggccgag ctgaccaaca acatcgacat ctggctggtg 1380
atcatcctga tcgagcccaa cgtgacccgc gagacccgca cctacaccat cttcggccag 1440
cgcgtggagc tggtgatcga gaacgtgagc cagaccaagt ggaagttcgt ggacttccgc 1500
cgccgcaacc agcacgacac ctacgtgagc gagggcaccc tgctgagcga caccaagctg 1560
caggccgcca tgaagtacgg cgccaagctg ttcaccttca tcggcgacac ccccagcgcc 1620
accccccagg acttcggcta caccaccagc aactacagcg ccatcgaggt gaagagcttc 1680
tgcgacttct acatcgtgcc ccgcctgccc cgcgaggtgt gccgcaacta catcaacaac 1740
ggcctgcccc ccatgcagaa cacccgcaac gtggtgcccg tggccctgag cgcccaccac 1800
caccaccacc accaccactg a 1821
<210> 3
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggtaccaccg ccatgtacag gatgcaactc ctg 33
<210> 4
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aagctttcag tgtacaattg atctagaagt tagg 34