具体实施方式

本说明不旨在是可以实施本发明的所有不同方式或可以添加到本发明中的所有特征的详细目录。例如，关于一个实施例所说明的特征可以并入其他实施例中，并且关于一个特定实施例所说明的特征可以从那个实施例删除。因此，本发明预期了，在本发明的一些实施例中，可以排除或省略在此陈述的任何特征或特征的组合。此外，鉴于本披露内容，本文建议的不同实施例的众多变化以及增加物对于本领域技术人员是显而易见的，这不脱离本发明。因此，以下说明旨在阐述本发明的一些特定实施例，并且并没有穷尽地叙述其所有排列、组合和变化。

除非另外定义，本文所使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。在本文的发明的说明中使用的术语是仅出于描述特定实施例的目的，且并不旨在限制本发明。还应当理解的是本文使用的术语仅仅是出于描述具体实施例的目的并且不旨在限制本发明的范围。与本发明相关的通用的参考文献包括：Alwine等人(1977)Proc.Nat.Acad.Sci.[美国国家科学院学报]74:5350-54；Baldwin(2004)Mol.Cell.Proteomics[分子与细胞蛋白质组学]3(1):1-9；Can和Annan(1997)Overview of peptide and protein analysis by mass spectrometry[通过质谱分析肽和蛋白的概述].In:Current Protocols in Molecular Biology[现代分子生物学实验指南]由Ausubel等人编辑.纽约:约翰威立国际出版集团(Wiley),第10.21.1-10.21.27页；Chang等人(2000)Plant Physiol.[植物生理学]122(2):295-317；Domon和Aebersold(2006)Science[科学]312(5771):212-17；Nain等人(2005)Plant Mol.Biol.Rep.[植物分子生物学报告]23:59-65；Patterson(1998)Protein identification andcharacterization by mass spectrometry.[通过质谱的蛋白质鉴定和表征]In:CurrentProtocols in Molecular Biology[现代分子生物学实验指南],由Ausubel等人编辑纽约:约翰威立国际出版集团,第10.22.1-10.22.24页；Paterson和Aebersold(1995)Electrophoresis[电泳]16:1791-1814；Rajagopal和Ahern(2001)Science[科学]294(5551):2571-73；Sesikeran和Vasanthi(2008)Asia Pac.J.Clin.Nutr.[亚太临床营养杂志]17增刊1:241-44；以及Toplak等人(2004)Plant Mol.Biol.Rep.[植物分子生物学报告]22:237-50。

定义

如本文和所附权利要求书中使用的，单数形式“一个/种(a/an)”和“该/所述(the)”可以表示一个或多于一个。因此，例如，提及“一种植物”可以指单种植物或多种植物。

如本文所使用的，“和/或”是指并且涵盖一个或多个相关的列出项的任何及全部可能组合，连同当以可替代性，“或”解释时组合的缺少。

术语“约”本文用于意指大约、大致、约或在……左右。当术语“约”结合数值范围来使用时，它通过将边界延伸至高于以及低于所阐述的数值来限定这个范围。一般而言，术语“约”本文用于将数值限定至以20％的变化，优选地10％上下(更高或更低)地高于以及低于规定值。关于温度，术语“约”意指±1℃，优选±0.5℃。当术语“约”被用于本发明的上下文中(例如与温度或分子量值组合)时，确切值(即，无“约”)是优选的。

术语“包含(comprises和/或comprising)”当在本说明书中使用时，指明所列举特征、整体、步骤、操作、元件、和/或部件的存在，但是不排除一种或多种其他特征、整体、步骤、操作、元件、部件、和/或其组的存在或添加。

如本文所使用的，过渡短语“基本上由……组成”(以及语法变体)意指，权利要求书的范围有待被解读为涵盖权利要求书中所列举的指定材料或步骤以及不实质上改变所要求的发明的一个或多个基本和新颖特征的那些。因此，当用于本发明的权利要求中时，术语“基本上由……组成”并不旨在被解释为等同于“包含(comprising)”。

如本文使用的，术语转基因“事件”是指通过用异源DNA(例如，包括目的基因的表达盒)转化和再生单个植物细胞而产生的重组植物。术语“事件”是指包含异源DNA的原始转化体和/或该转化体的子代。术语“事件”也是指通过该转化体和另一种玉米品系之间进行有性异型杂交(sexual outcross)而产生的子代。即使在重复回交至一个轮回亲本后，来自该转化的亲本的插入DNA和侧翼DNA存在于在该杂交子代的同样的染色体位置。通常，植物组织的转化产生多个事件，每个上述事件代表DNA构建体插入至植物细胞的基因组中的不同位置中。基于转基因或其他期望的特征的表达，选择特定的事件。本发明的此类转基因事件的非限制性实例包括“事件Bt11”，其包含cry1Ab和pat基因，并描述于US 6114608中(也称为“Bt11事件”或仅“Bt11”)；“事件5307”，其包含eCry3.1Ab和PMI基因，并描述于US8466346中(也称为“5307事件”或仅称为“5307”)；“事件MIR604”，其包含mCry3A和PMI基因，并描述于US 7361813中(也称为“MIR604事件”或仅称为“MIR604”)；“事件MIR162”，其包含Vip3A和PMI基因，并在描述于US 8232456中(也称为“事件MIR162”或仅称为“MIR162”)；“事件GA21”，其包含dmEPSPS基因，并描述于US 6566587中(也称为“GA21事件”或仅称为“GA21”)；“事件3272”，其包含α-淀粉酶797E和PMI基因，并描述于US 7635799中(也称为“3272事件”或仅称为“3272”)；“事件MON810”，其包含Cry1Ab，并描述于US6713259中(也称为“MON810事件”或仅称为“MON810”)；“事件MON89034”，其包含Cry1A.105和Cry2Ab基因，并描述于US8062840中(也称为“MON89034事件”或仅称为“MON89034”)；“事件TC1507”，其包含Cry1F和PAT基因，并描述于US 7288643(也称为“TC1507事件”或仅称为“TC1507”)；“事件DAS59122”，其包含Cry34/Cry35和PAT基因，并描述于US 7323556中(也称为“DAS59122事件”或仅称为“DAS59122”)和“事件DP4114”，其包含Cry1F、Cry34/Cry35和PAT基因，并描述于US9790561中(也称为“DP4114事件”或仅称为“DP4114”)。

术语“分离的”核酸分子、多核苷酸或毒素是不再存在于其天然环境中的核酸分子、多核苷酸或毒性蛋白。本发明的分离的核酸分子、多核苷酸或毒素可以按照纯化的形式存在，或者可以存在于重组宿主中，例如转基因细菌细胞或转基因植物中。

如本文使用的，一般术语“质谱”是指任何合适的质谱方法、设备或配置，包括例如电喷雾电离(ESI)、基质辅助激光解吸/电离(MALDI)MS、MALDI-飞行时间(TOF)MS、大气压(AP)MALDI MS、真空MALDI MS、串联MS或其任何组合。质谱设备通过测量分子在一组磁场和电场中的飞行路径，来测量分子的分子量(作为分子的质荷比的函数)。质荷比是带电粒子的电动力学中广泛使用的物理量。特定肽的质荷比可由本领域技术人员事先计算。当经历相同的电场和磁场时，质荷比不同的两个粒子在真空中不会沿相同的路径移动。本发明尤其包括使用高效液相色谱(HPLC)，随后对该肽进行串联MS分析。在“串联质谱”中，可以在MS仪器中过滤替代肽，并在随后将该替代肽碎裂以产生一个或多个“过渡离子”，在第二个MS程序中对这些过渡离子进行分析(检测和/或定量)。

质谱方法和设备的详细概述可在以下参考文献中找到，在此通过引用将其并入：Can和Annan(1997)Overview of peptide and protein analysis by mass spectrometry[通过质谱分析肽和蛋白的概述].In:Current Protocols in Molecular Biology[现代分子生物学实验指南]由Ausubel等人编辑.纽约:约翰威立国际出版集团(Wiley),第10.21.1-10.21.27页；Paterson和Aebersold(1995)Electrophoresis[电泳]16:1791-1814；Patterson(1998)Protein identification and characterization by massspectrometry.[通过质谱的蛋白质鉴定和表征]In:Current Protocols in MolecularBiology[现代分子生物学实验指南],由Ausubel等人编辑纽约:约翰威立国际出版集团,第10.22.1-10.22.24页；以及Domon和Aebersold(2006)Science[科学]312(5771):212-17。

肽是一种短聚合物，由α-氨基酸按定义顺序连接而成。肽也可以通过用蛋白酶消化多肽(例如蛋白质)来产生。

“植物”是在发育的任何阶段的任何植物，特别是种子植物。

“植物细胞”是植物的结构和生理单位，包含原生质体和细胞壁。植物细胞可以处于分离的单个细胞或培养细胞的形式，或者是作为较高级的组织单位(如例如，植物组织、植物器官、或全株植物)的一部分。

“植物细胞培养物”意指植物单元(如例如，原生质体、细胞培养物细胞、植物组织中的细胞、花粉、花粉管、胚珠、胚囊、接合子以及处于不同发育阶段的胚)的培养物。

“植物材料”是指叶、茎、根、花或花的部分、果实、花粉、卵细胞、接合子、种子、切条、细胞或组织培养物、或植物的任何其他部分或产物。

“植物器官”是植物的独特而明显的已结构化并且分化的部分，如根、茎、叶、花蕾或胚。

如在此使用的“植物组织”意指组织化成结构和功能单元的一组植物细胞。包括植物中或培养物中的任何植物组织。这个术语包括但不限于全株植物、植物器官、植物种子、组织培养物以及被组织化成结构和/或功能单元的任何植物细胞群组。这个术语与如以上列出的或由该定义以其他方式涵盖的任何具体类型的植物组织的联合应用或单独应用并不旨在排除任何其他类型的植物组织。

如本文使用的，术语“替代肽”是指通过蛋白水解消化(例如胰蛋白酶消化)从靶蛋白衍生的肽，该靶蛋白在质谱测定中起作用以产生一个或多个过渡离子，当在复合生物基质(诸如来自转基因植物的样品)中该靶蛋白伴随存在一种或多种其他蛋白和/或转基因蛋白时，该一个或多个过渡离子与该替代肽组合差异检测和/或定量该靶蛋白，并且不检测和/或定量该生物基质中的该一种或多种其他蛋白质或转基因蛋白。“替代肽”也可以称为该靶蛋白的“特征(signature)肽”。例如，本发明的HPPD替代肽产生一个或多个过渡离子，当该HPPD蛋白伴随存在一种或多种非HPPD蛋白时，其与HPPD-替代肽组合差异检测和/或定量复合生物基质中的靶HPPD蛋白。根据本发明的实施例，本发明的两种或更多种标记的替代肽可以同时用于质谱测定中，以检测和/或定量复合生物基质中的两种或多种靶蛋白。

“标记的替代肽”是一种非天然存在的替代肽，其被标记使得易于在质谱测定中检测该替代肽。例如，该标记可以是稳定的同位素标记的氨基酸(SIL)，诸如赖氨酸、异亮氨酸、缬氨酸或精氨酸。因此，SIL标记的替代肽具有与未标记的替代肽相同的氨基酸序列，不同之处在于该替代肽的一个或多个氨基酸被重同位素标记。例如，如本文所述，替代肽GNFSELFK(SEQ ID NO:1)用重赖氨酸(K)标记并且可以被命名为GNFSELFK[C13N15-K]等。

如本文使用的，术语“堆叠(stacked或stacking)”是指植物的基因组中存在掺入的多个异源多核苷酸或转基因蛋白或转基因事件。

如本文所用，“靶蛋白”意为当靶蛋白处于复合生物基质中时旨在通过标记的替代肽选择性检测和/或定量的蛋白质。

核苷酸在本文中由以下标准缩写表示：腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和鸟嘌呤(G)。氨基酸同样由以下标准缩写表示：丙氨酸(Ala；A)、精氨酸(Arg；R)、天冬酰胺(Asn；N)、天冬氨酸(Asp；D)、半胱氨酸(Cys；C)、谷氨酰胺(Gln；Q)、谷氨酸(Glu；E)、甘氨酸(Gly；G)、组氨酸(His；H)、异亮氨酸(Ile；1)、亮氨酸(Leu；L)、赖氨酸(Lys；K)、甲硫氨酸(Met；M)、苯丙氨酸(Phe；F)、脯氨酸(Pro；P)、丝氨酸(Ser；S)、苏氨酸(Thr；T)、色氨酸(Trp；W)、酪氨酸(Tyr；Y)、以及缬氨酸(Val；V)。

本发明涵盖可用于实施质谱的组合物、方法和系统，该质谱用于差异检测和/或定量衍生自作物植物的复合生物样品中的一种或多种靶HPPD蛋白，这些复合生物样品(例如，来自一种或多种作物植物的叶、茎、根、花粉和种子的生物样品)包含靶蛋白和非靶蛋白的混合物，每种生物样品都可能对质谱结果产生不同的影响。

通过质谱的多反应监测测定(MRM)定量靶蛋白的准确度完全取决于选择合适的替代肽以及替代肽/过渡离子组合的靶蛋白区分能力。本发明的替代肽的许多不同组合可以通过MRM测定用一种或多种来自HPPD蛋白的特定替代肽同时进行监测和定量，并因此提供通过质谱鉴定和定量在给定生物样品内的每种靶HPPD蛋白的方法。组成该盒的可用替代肽可在单个MRM测定中单独或以任何组合进行分析，或在多个MRM测定中进行分析。

本发明的替代肽结合基于MRM的测定具有众多应用，包括定量肽/蛋白质分析，用于确定不同生长阶段的表达水平，确定潜在的暴露水平以进行环境风险评估，确定食品加工中靶蛋白的不同水平，确定比较研究中的表达水平，并比较世代研究中的表达水平。在最广泛的意义上，这些靶蛋白的独特替代肽可与MRM测定结合使用，用于监测或定量可出现在作物植物或转基因事件中的除草剂耐受性状，或特定组织(即叶、根、核、花粉)内的多个转基因事件的育种堆叠。

基于MRM的测定可以定量或测量来自HPPD蛋白的特定替代肽的相对或绝对水平。这些蛋白的相对定量水平可以通过MRM测定通过相互比较特征峰面积来确定。可以从不同的样本或组织类型中定量单个HPPD替代肽的相对水平。通常，通过将MRM测量中的肽丰度与作为每种靶替代肽的内标的稳定的同位素标记的(SIL)合成肽类似物进行比较，来确定相对定量水平。与本领域通常教导的相反，SIL肽通过掺入[¹³C₆ ¹⁵N₂]赖氨酸或[¹³C₆ ¹⁵N₄]精氨酸来标记，但也可包括其他氨基酸，诸如异亮氨酸和缬氨酸。SIL标准品需要是高纯度的，并应通过氨基酸分析进行定量标准化。与本领域通常教导的相反，本发明的SIL在蛋白消化后立即加标到样品中，从而用于校正后续分析步骤。该SIL在液相色谱分离中与未标记的替代肽共洗脱，并显示出相同的MS/MS碎裂图谱，但由于该同位素标记，其仅质量不同。标记的替代肽和产物离子的质量偏移结果使该质谱仪区分未标记的肽和标记的肽。由于复合肽消化物通常包含多组可能被误认为该靶肽的共洗脱过渡物，因此该同位素标记的标准品的共洗脱可鉴定正确的信号，并提供最佳的保护，以防止假阳性定量。由于将已知浓度的加标SIL标准品加标到每个样品中，因此可以确定HPPD蛋白的来自不同靶蛋白的每种相应替代肽的相对量。由于单个肽或多个肽的相对定量可以相对于样品内或样品之间的另一个肽或多个肽的量进行，因此可以通过确定生物样品内峰面积是否彼此相关来确定存在的多个肽的相对量。从各个特征峰面积得出的不同样品之间的相对定量数据通常会归一化为每个样品分析的蛋白质的量。可以在一个样品和/或多个样品中同时对来自多种蛋白质的多种肽进行相对定量，以进一步了解一种肽/蛋白质相对于其他肽/蛋白质的相对蛋白量。

HPPD的绝对定量水平可以通过基于MRM测定，通过将来自一个生物样品中相应蛋白质的单个替代肽的特征峰面积与样品中已知量的一种或多种内标进行比较来确定。这可以通过将已知浓度的这些蛋白质加标到不含靶蛋白的阴性对照基质中来实现。多反应监测(MRM)测定包含对具有精确加标浓度的靶蛋白的非靶标样品进行称重；在裂解缓冲液中提取样品并使其均质化；离心样品以分离可溶性蛋白和不溶性蛋白，以富集和降低提取物的复杂性；用胰蛋白酶消化可溶性蛋白样品(组织或生物样品可以用一种或多种蛋白酶(包括但不限于胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、内切蛋白酶Asp-N和Lys-C)处理一段时间以充分消化样品)，离心样品，添加固定浓度的SIL肽(在绝对定量中，SIL用作指示剂)；通过利用阳离子交换的固相萃取脱盐，以最小化基质效应或干扰并减少离子抑制；并通过液相色谱串联质谱联用对样品进行分析。典型地，离子阱质谱仪或能够进行全局分析(用于从单个复杂蛋白质/肽裂解物中鉴定尽可能多的肽)的另一种形式的质谱仪通常用于分析。尽管可以在任何类型的质谱仪上开发和执行基于MRM的测定，但通常认为MRM测定最有利的仪器平台是三重四极杆仪器平台。通过LC-MS/MS测量七种蛋白质独有的目标替代肽和SIL。确定每个目标肽的峰面积比(替代肽的峰面积/相应SIL肽的峰面积)。使用峰面积比从校准曲线反算出七种目的蛋白的浓度。可以对许多肽进行绝对定量，这允许同时定量测定单个样品和/或多个样品中的多种蛋白，以了解单个生物样品或大样品组中的绝对蛋白含量。

在一些实施例中，本发明涵盖一种标记的替代肽，其在质谱分析中起作用以选择性地检测或定量来自一种或多种作物植物的一个或多个生物样品中的蛋白质混合物中的对羟基苯基丙酮酸双加氧酶(HPPD)蛋白，所述替代肽包含标记和选自由GNFSELFK(SEQ IDNO:1)和GNFSQLFK(SEQ ID NO:2)组成的组的氨基酸序列。在一些方面，通过掺入稳定的同位素标记的(SIL)氨基酸来标记该被标记的替代肽。在其他方面，所述SIL氨基酸为赖氨酸、异亮氨酸、缬氨酸或精氨酸。在其他方面，所述作物植物是大麦、水稻、大豆、小麦、燕麦或玉蜀黍。在另外的方面，所述作物植物是大麦、水稻、大豆、小麦或水稻，并且所述替代肽包含标记和SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在另外的方面，所述作物植物是玉蜀黍，并且所述替代肽包含标记和SEQ ID NO:2的氨基酸序列。

在一些实施例中，本发明涵盖包含至少两个标记的替代肽的测定盒，所述替代肽包含选自由GNFSELFK(SEQ ID NO:1)和GNFSQLFK(SEQ ID NO:2)组成的组的氨基酸序列。

在一些实施例中，本发明涵盖一种同时检测或定量来自作物植物的包含所述靶蛋白和非靶蛋白的混合物的复合生物样品中的一种或多种靶HPPD蛋白的方法，所述方法包括：(a)从作物植物中获得生物样品；(b)从所述生物样品中提取蛋白，得到包含蛋白质混合物的提取物；(c)减少步骤b的提取物中不溶性蛋白的量，得到浓缩的可溶性蛋白的提取物；(d)消化步骤c的提取物中的可溶性蛋白，得到包含肽碎片的提取物，其中所述肽碎片包含至少一种对靶蛋白具有特异性的替代肽；(e)浓缩步骤d的提取物中的肽碎片；(f)添加一种或多种本发明的标记的替代肽，其中每种标记的替代肽具有与所述靶蛋白的每种替代肽相同的氨基酸序列，并且其中添加的标记的替代肽的数目等于该混合物中靶蛋白的数目；(g)通过减少所述混合物中非替代肽的量来浓缩所述替代肽和所述标记的替代肽；(h)通过液相色谱使来自步骤g的所述肽碎片混合物分解；(i)通过质谱分析从步骤h得到的肽碎片混合物，其中检测到标记的替代肽的过渡离子碎片指示存在衍生所述替代肽的靶蛋白；以及，任选地，(j)通过将由步骤i的所述过渡离子碎片产生的质谱信号与由过渡产生的质谱信号进行比较，计算所述生物样品中靶蛋白的量。在一些方面，所述作物植物是大麦、水稻、大豆、小麦或水稻，并且所述替代肽包含标记和SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在其他方面，所述作物植物是玉蜀黍，并且所述替代肽包含标记和SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在其他方面，通过掺入稳定的同位素标记的(SIL)氨基酸来标记该肽。在另外的方面，所述SIL氨基酸为赖氨酸、异亮氨酸、缬氨酸或精氨酸。

本领域中有许多参考文献已经提出了许多不同的方法来预测哪种替代肽最适合任何给定的靶蛋白，并且许多参考文献已经提出了使用质谱法定量靶蛋白的捷径，例如Mead等人2009.Mol.Cell.Proteomics[分子和细胞蛋白质组学]8:696-705和美国专利号8,227,252。然而，依赖此类预测方法和捷径可导致混杂结果，因为不可预测的因素可干扰基于质谱的测定，从而导致灵敏度下降和定量不准确。至少一个主要因素在于生物基质本身。例如，从与来自作物植物的叶、根、花粉和种子的生物样品同样有效的替代肽中鉴定出单个过渡离子是非常不可预测且困难的。基质的化学成分、pH值或离子强度的差异可影响MS仪器中的蛋白水解、肽稳定性、聚集或电离。因此，必须鉴定和凭经验测试所有相关基质(特别是作物植物的基质)的替代肽和特定替代肽/过渡离子组合，以克服此类测定的不可预测的性质。本发明在开发用于特异性检测和/或定量靶蛋白的质谱测定中采用两步法，包括：1)从源自蛋白水解切割的靶蛋白的肽库中测试和选择替代肽，以及测试SIL替代肽和过渡离子肽的组合，并选择特异性检测和定量所有生物基质(例如来自作物植物的叶、根、花粉或种子的生物样品)中的靶蛋白的组合；以及2)凭经验确定适用于所有生物基质(包括作物植物的叶、根、花粉和种子，特别是玉米植物)中的所有替代肽和替代肽/过渡离子组合的样品制备和质谱仪条件的适当方法。

因此，在一些实施例中，本发明涵盖同时检测和/或定量来自转基因植物的包含靶转基因蛋白和非转基因蛋白的混合物的复合生物样品中的一种或多种靶蛋白的方法，其中该方法包括以下步骤：a)从转基因植物中获得生物样品；b)从所述生物样品中提取蛋白，得到包含蛋白混合物的提取物；c)减少步骤b的提取物中非转基因不溶性蛋白的量，得到浓缩的可溶性蛋白的提取物；d)消化步骤c的提取物中的可溶性蛋白，得到包含肽碎片的提取物，其中所述肽碎片包含至少一种对每种靶蛋白具有特异性的未标记的替代肽；e)浓缩步骤d的提取物中的肽碎片；f)添加一种或多种本发明的标记的替代肽，其中每种标记的替代肽具有与衍生自所述靶蛋白的每种未标记的替代肽相同的氨基酸序列，并且其中添加的标记的替代肽的数目等于该混合物中靶蛋白的数目；g)通过减少所述混合物中非替代肽的量来浓缩所述未标记的替代肽和所述标记的替代肽；h)通过液相色谱使来自步骤g的所述肽碎片混合物分解；i)通过质谱分析从步骤h得到的肽碎片混合物，其中检测到未标记的替代肽的过渡离子碎片指示存在衍生所述替代肽的靶蛋白；并且任选地j)通过比较由步骤i的过渡离子碎片产生的质谱信号与由标记的替代肽的过渡离子产生的质谱信号，计算所述生物样品中靶蛋白的量。

包括以下特定实例以说明本发明的优选实施例。本领域技术人员应当理解，以下实例中披露的技术代表了发明人发现的在本发明的实践中发挥良好作用的技术，因此可以认为构成了其实践的优选模式。然而，根据本披露，本领域技术人员应当理解，可以在所披露的特定实施例中进行许多改变，并且在不脱离本发明的概念、精神和范围的情况下仍可获得相似或类似的结果。更具体地，明显的是，某些化学和生理学相关的药剂可以替代本文所述的药剂，同时将获得相同或相似的结果。所有这些对本领域技术人员来说显而易见的相似替代和修改都被视为在所附权利要求书所限定的本发明的精神、范围和概念之内。

实例

虽然已经结合本发明的特定实施例描述了本发明，但是应当理解，本发明的设备能够进行进一步的改良。本专利申请旨在涵盖任何一般而言遵循本发明的原理的变化、用途或改编，并且包括这样的偏离本披露的内容：其在本发明所属领域的已知或惯常操作内，并且可以适用于此前所阐述的关键特征，并且遵循所附权利要求的范围。

在本说明书中提到的所有公开物和专利申请均指示本发明所属领域中的技术人员的技术水平。所有公开物和专利申请均通过引用并入本文，其程度如同每个单独的公开物或专利申请被明确地并单独地指示通过引用而并入。

实例1.使用质谱测定验证商品作物(Commodity Crop Articles of Commerce)中内源性对羟基苯基丙酮酸双加氧酶的定量

本研究的目的是验证使用液相色谱串联质谱联用(LC-MS/MS)对各种商品作物(大麦、玉蜀黍、水稻、大豆和小麦种子，以及大麦、玉蜀黍、燕麦、大豆和小麦饲料)中的对羟基苯基丙酮酸双加氧酶(HPPD)蛋白进行定量的基于质谱(MS)的方法。HPPD蛋白特有的替代肽用于确定相对浓度。在研究中实施定量方法之前，根据良好实验室规范标准(GLPS)该方法针对预期用途进行验证。商品作物样品用于评估方法性能参数，包括特异性、线性、定量限、残留、精确度和准确度、提取效率和稳定性。

特异性的评估表明在任何测试的商品作物样品中对未标记的肽(空白和缓冲液之间的两次转换的平均比率差异<30.0％)和稳定同位素标记的(SIL)肽(QC0(内源性)的SIL信号≤5.0％)保留时间没有显著干扰。所有特异性参数均符合验收标准。

确定了用作靶HPPD蛋白的替代物的每个特征肽的定量下限(LLOQ)。该定量限：大麦种子为0.209μg/g干重(DW)，玉蜀黍种子为0.122μg/g DW，水稻种子为0.083μg/g DW，大豆种子为0.686μg/g DW，小麦种子为0.301μg/g DW，大麦饲料为0.524μg/g DW，玉蜀黍饲料为0.326μg/g DW，燕麦饲料为0.660μg/g DW，大豆饲料为1.001μg/g DW，以及小麦饲料为0.640μg/g DW。

表1中总结了每种商品作物的HPPD的验证定量范围(LLOQ)和定量上限(ULOQ)。

表1.定量范围

QC0样品的批内和批间CV≤25.0％，三个浓度(低、中和高)的质量控制(QC)样品的CV≤20.0％，显示出良好的方法精确度。类似地，低、中和高QC样品的批内和批间偏差％在±20.0％以内，显示出良好的方法准确度。因此，所有方法精确度和准确度参数均符合验收标准。表2中总结了该方法的批内和批间精确度和准确度。

表2.商品作物中HPPD的批内和批间的精确度和准确度范围

具有1/x的数据权重的线性方程用于表示浓度/检测器响应关系。因此，所有已建立的数据均符合验收标准，并被认为适用于线性评估。

蛋白提取方法的效率：大麦种子为59.9％，玉蜀黍种子为69.8％，水稻种子为73.9％，大豆种子为64.9％，小麦种子为54.3％，大麦饲料为69.8％，玉蜀黍饲料为76.3％、燕麦饲料为78.4％，大豆饲料为65.4％，以及小麦饲料为77.2％。除小麦种子的CV为27.5％外，所有商品作物的第一轮提取的CV均低于20.0％。然而，来自单次提取的小麦种子的精确度和准确度结果(QC0)表明达到了精确度≤20.0％。

在-20℃评估处理稳定性(干提取物)6天。稳定性评估符合验收标准。对于所有商品作物，CV≤25.0％，稳定性和第0天QC之间的峰面积比的差异％在±25.0％以内。

除了大麦和小麦种子的最终提取的％分别为8.2％和6.2％以及小麦种子第一轮提取的精确度为27.5％CV外，所有评估的性能参数均符合规定的验收标准。由于样品分析中HPPD的浓度将通过单次提取(第一轮)确定并根据提取效率％进行调整，并且在精确度和准确度运行中小麦种子的精确度达到≤20.0％，因此对研究的结果没有影响。基于本研究的结果，基于质谱的方法已被证实适用于根据GLPS对商品作物中的HPPD蛋白进行定量。

本研究的目的是验证使用液相色谱串联质谱联用(LC-MS/MS)分析对各种商品作物(大麦、玉蜀黍、水稻、大豆和小麦种子，以及大麦、玉蜀黍、燕麦、大豆和小麦饲料)中的对羟基苯基丙酮酸双加氧酶(HPPD)蛋白进行定量的基于质谱(MS)的方法。HPPD蛋白特有的替代肽用于确定在不同植物物种/基质中的相对浓度(表3)。在研究中实施定量方法之前，根据良好实验室规范标准(GLPS)该方法针对预期用途进行验证。商品作物样品用于评估方法性能参数，包括特异性、线性、定量限、残留、精确度和准确度、提取效率和稳定性。

表3.HPPD替代肽

用于本研究的商品作物材料是来自各种植物物种的基质，其用于制备线性样品和质量控制(QC)样品。表4鉴定基质材料的来源。这些样品由赞助商提供，并在-80℃±10℃的标称温度下储存直至使用。

表4.商品作物材料

标准品和QC样品

对于线性评估，生成了反向曲线。使用以不同浓度的用SIL肽强化的商品作物提取物制备一组八种非零标准品(STD)，包括LLOQ(STD 1)和ULOQ(STD 8)STD。

使用用未标记肽强化的商品作物提取物以三种不同浓度(低、中和高)制备QC样品。表5和表6列出了标称浓度。

表5.商品作物中标准品的浓度(标称)

^aDW-干重

表6.商品作物中的QC样品的浓度(标称^a)

^a标称＝用QC0(未标记肽的内源水平)调整前的标称浓度

合成肽

本研究中使用的纯化和定量的SIL和未标记合成肽列于表7中。合成肽由JPTPeptide Technologies GmbH提供，并在-20℃的标称温度下储存直至使用。

表7.合成肽列表

分析方法

基于LC-MS/MS的方法以确定商品作物中HPPD蛋白质的数量的验证过程涉及以下实验和数据评估步骤。简而言之，用于鉴定和定量复合生物基质中HPPD替代肽的LC-MS/MS方法包括：(i)称重冻干的商品作物；(ii)在裂解缓冲液中均质化/提取来自植物物种/基质样品的蛋白；(iii)离心样品以分离可溶性蛋白和不溶性蛋白，以富集目的蛋白并降低样品的复杂性；(iv)用胰蛋白酶消化可溶性蛋白样品；(v)离心样品；(vi)添加SIL肽(固定或可变，取决于评估)；(vii)通过利用阳离子交换的固相萃取脱盐，以最小化基质效应或干扰并减少离子抑制；以及(viii)通过LC-MS/MS分析样品。通过LC-MS/MS测量每种商品作物HPPD蛋白独有的目标替代肽和相应SIL肽。使用MultiQuantTM软件3.0.2版分析数据，其中对每个样品的每个替代肽(未标记)和每个相应的SIL肽的色谱峰面积进行积分。

对于反向曲线，针对每个替代肽确定SIL肽的峰面积。然后，对于每个替代肽，将每个标准样品的SIL肽的峰面积绘制在y轴上，作为蛋白质浓度(x轴)的函数，以创建反向曲线。

对于QC样品，确定了峰面积比(未标记肽的峰面积/相应SIL肽的峰面积)。QC样品的未标记肽的浓度计算如下：

样品处理

称量10至18mg之间的每种商品作物，并将其添加至含有基质A裂解珠(MPBiomedicals公司)的试管中。然后将裂解缓冲液(磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的0.1％RapiGestTM(沃特斯公司(Waters)))添加到每个样品管中，并使用均质器(MP Biomedicals公司)进行均质化。然后将样品在4℃离心以去除不溶性材料。如表8所述，将上清液转移；在PBS中的0.1％RapiGest中合并并稀释。这些被稀释的商品作物以不同浓度要么用SIL肽强化得到标准品，要么用未标记肽强化得到QC样品。

表8.基质稀释因子

对于每个处理过的标准品和QC样品，添加等体积的2,2,2-三氟乙醇(TFE)以使蛋白质变性，然后用100mM碳酸氢铵将TFE稀释至10％并使用0.1μg/μL胰蛋白酶消化并于37℃孵育14至18小时。消化后，用终浓度为5％的甲酸(FA)将样品酸化，以及除了空白和残留空白外根据验证评估将SIL肽以可变或固定浓度添加到每个样品中。然后使用混合模式阳离子交换(MCX)μElution板通过固相萃取对样品进行脱盐。收集洗脱液并转移到两个MS板上，将其蒸发至干燥并储存在-20℃(标称)下直至MS分析。

处理过的样品用11μL的92.5/7.5水/乙腈(ACN)+0.2％FA重新溶解，然后进行超声处理、涡旋和离心。针对每个样品，将八微升材料进样到NanoAcquity超高效液相色谱(沃特斯公司)(与QTRAP 6500质谱仪(AB Sciex公司)联用)上。使用HALO肽ES-C18 50mm x 0.5mm，2.7μm色谱柱(加拿大生命科学公司(Canadian Life Science))实现肽分离。所用的LC梯度如下表9所示。流速为28.000μL/min。使用Turbo V MS源以正离子模式测量分析物。使用1.6版(AB Sciex公司)进行数据采集。

表9.LC-MS/MS测定的LC梯度

^aDMSO-二甲亚砜

替代肽和相应的SIL肽是HPPD蛋白所独有的。使用MultiQuant3.0.2版(AB Sciex公司)对每个样品的每个替代肽(未标记)和每个相应的SIL肽的色谱峰面积进行积分。

对于反向曲线，针对每个替代肽确定SIL肽的峰面积。将每个标准样品的SIL肽的峰面积绘制在y轴上，作为蛋白质浓度(x轴)的函数，以创建反向曲线。

对于QC样品，确定了峰面积比(未标记肽的峰面积/相应SIL肽的峰面积)。QC样品的未标记肽的浓度计算如上所述。

使用Microsoft Office软件进行平均值、标准偏差(SD)和变异系数(CV)计算。未四舍五入的值用于计算平均值、SD和CV，然后在汇总表中适当四舍五入。

特异性

特异性由在样品中存在各种植物基质成分的情况下测量和区分替代肽的方法的能力确定。通过LC-MS/MS确定HPPD蛋白的每个独特替代肽的存在或不存在来测量特异性。

在如下所述的所有商品作物提取物中，对于未标记肽使用定量和定性转换(quantifier and qualifier transition)对测定特异性进行评估，对于SIL肽仅使用定量转换(quantifier transition)对测定特异性进行评估。

未标记肽

进行了以下分析：

通过在用未标记肽强化的被消化的牛血清白蛋白(BSA)缓冲液(n＝3)与空白(n＝3)中比较监测的两个转换(定量/定性)的平均比率来评估测定特异性。空白被认为是含有可检测量的未添加SIL或未标记的肽处理的内源性HPPD蛋白的基质。

使用以下公式计算差异％：

以下验收标准用于确认未标记肽的特异性评估的适用性：空白和缓冲液之间的差异％必须在30.0％以内。

SIL肽

进行了以下分析：

通过确定QC0(内源性，n＝3)与空白(n＝3)中SIL肽(定量转换)的峰面积来评估测定特异性。空白被认为是含有可检测量的未添加SIL或未标记的肽处理的内源性HPPD蛋白的基质。

使用以下公式计算QC0(内源性)的％：

使用以下验收标准来确认SIL肽的特异性评估的适用性：空白样品中SIL肽的平均峰面积必须≤QC0(内源性)样品中SIL肽的平均峰面积的5.0％。

线性

线性是方法得出结果的能力，这些结果由样品中分析物的量和响应性在数学上定义。基于方法的准确度评估线性。对于每个植物物种/基质中的HPPD，使用定义反向曲线的最简单的回归模型，即线性曲线拟合。基于使用相关系数(R值)的拟合质量应用该模型。

对所有肽应用1/x的数据权重。将相同的回归模型和相同的数据权重应用于每个植物物种/基质的所有测定运行。

以下运行验收标准用于确认线性评估的适用性：(1)至少75.0％的非零标准品必须是有效的，并且偏差不得超过标称浓度的20.0％，但LLOQ的偏差不得超过25.0％；(2)插值曲线必须有R≥0.9900。

定量限

LLOQ和ULOQ是在可接受的准确度极限内可以确定替代肽响应的最小和最大浓度。使用所述反向曲线确定每个植物物种/基质中替代肽的LLOQ和ULOQ。

以下验收标准用于确认LLOQ和ULOQ评估的适用性：LLOQ和ULOQ标准品必须满足以上定义的准确度标准。

HPPD的定量范围是已证明分析程序具有合适的准确度和线性水平的上限浓度和下限浓度之间的区间(参见表5的标准品浓度)。使用从该方法的线性评估中获得的数据，确定每个植物物种/基质中HPPD的定量范围。确定准确度有效地验证了测试的高浓度和低浓度作为程序的定量范围。

残留是指在随后的进样中存在分析物。在本研究中，通过评估在每个ULOQ标准品之后进样的两个空白样品，确定线性评估期间的残留。它们必须不受干扰。以下运行验收标准用于评估所有线性运行的残留。评估ULOQ标准品后进样的第一个残留空白样品。对第二个残留空白进行了评估，但不是验收标准的一部分。在ULOQ标准之后进样的第一个残留空白样品中至少有50％必须在可接受的干扰范围内，如下所述，保留时间为：SIL肽的峰面积必须≤LLOQ标准品中SIL肽的平均峰面积的20.0％。此外，在精确度和准确度以及稳定性评估中，对再溶解缓冲液(RSB)样品进行了分析，以评估进样高QC样品后的残留。评估残留的顺序是：高QC，然后是两个RSB样品。

运行验收标准

作为验证的一部分，精确度和准确度以及稳定性运行包括QC样品以证明运行验收。必须满足以下标准才能将上述运行视为有效。每个植物物种/基质都被独立处理以达到验收标准。

QC样品

QC样品提供了接受或拒绝运行的基础。QC样品是通过用已知浓度的未标记肽强化样品基质来制备的。以下验收标准用于确认使用低QC(QC1)、中间范围QC(QC2)、高QC(QC3)的QC样品的适用性：(1)至少50％的低、中、高各浓度QC样品必须在±20.0％偏差内；(2)至少67％的低、中和高浓度QC样品必须在其标称值的±20.0％偏差内。

精确度和准确度

精确度是当该程序重复应用于均质样品的多次采样时，单个测试结果之间的一致程度。准确度是当该程序重复应用于均质样品的多次采样时，所发现的值与可接受的参考值之间的一致程度。在本研究中，LC-MS/MS测定的每个植物物种/基质中HPPD蛋白的精确度和准确度是通过评估测定与测定间以及分析者与分析者间的变异性来确定的。

使用QC样品评估方法的精确度和准确度。使用三种浓度(低、中和高)(表5和表6)的QC样品进行精确度和准确度测定。QC样品是用商品作物提取物制备的，并用未标记肽进行了强化。

精确度(CV)和准确度(偏差)在三个独立的测定运行中由两个不同的分析者在三个不同的日子里进行评估。

每个精确度和准确度的运行由每个QC浓度的三个重复组成。QC0(内源性)也包括在内并一式三份进行分析。

使用以下公式计算偏差％：

满足第0部分中规定的运行验收标准的精确度和准确度的运行用于评估批内精确度和准确度。然后使用满足批内标准的精确度和准确度的运行来评估批间精确度和准确度。以下验收标准用于确认批内和批间运行的精确度和准确度评估的适用性：(1)QC0样品的CV必须≤25.0％；(2)低、中、高浓度的QC样品的CV必须≤20.0％且偏差在±20.0％以内。

此外，通过查看精确度和准确度的运行的批量大小来建立用于研究样品分析的测定运行的最大进样时间长度。使用最大批量大小的精确度和准确度的运行来设置研究样品分析的最大进样时间长度。此外，对QC0(内源性)样品进行了趋势分析。

提取效率是从基质中回收的目的蛋白(即HPPD)的量。提取效率由连续顺序提取确定。如果最后一轮回收的总蛋白不超过5.0％，则认为该提取回收是最终的。使用商品作物通过HPPD的重复提取来评估蛋白提取方法的效率。

一位分析者提取了每种商品作物的三个重复。收集不溶性材料并再提取3次，保留每份上清液用于分析。

使用以下公式计算每个样品的提取效率：

以下验收标准用于确认每种蛋白的提取效率的适用性：当最终提取结果不超过来自所有组合提取的每个单独蛋白质的总回收材料的5.0％时，将认为顺序提取完成：

提取效率(第一次迭代的重复均值)预计是≥60.0％回收率，以及第一轮提取的精确度必须≤20.0％。

稳定性

评估了在给定条件下给定时间间隔内给定植物物种/基质中HPPD蛋白的稳定性。确定每个植物物种/基质中HPPD蛋白的稳定性，以及处理样品中替代肽的稳定性。

处理样品的稳定性

在两个不同浓度(低浓度和高浓度)下分析干提取物的处理样品的稳定性，每个浓度重复三次。新鲜制备和处理的QC样品通过LC-MS/MS(被认是第0天)进行分析。干燥稳定性样品没有立即通过LC-MS/MS进行分析，而是进行储存，持续预定的时间段。

干燥稳定性样品在-20℃的标称温度下储存6天(146小时16分钟)，然后重新溶解并通过LC-MS/MS进行分析。

以下验收标准用于确认处理样品中的替代肽的稳定性：(1)处理过的第0天样品和稳定性样品的总体平均峰面积比必须≤25.0％CV；(2)稳定性QC和第0天QC(在进样当天处理)之间的峰面积比的差异百分比必须在±25.0％以内。

根据验证方案，在一般说明中适当概述了残留评估，其中指出峰面积用于残留评估，但由于疏忽，验收标准中出现的描述说明了峰面积比。峰面积是进行评估的正确方法，因此在本研究中使用峰面积评估干扰。因此，由于应用了评估残留空白中的干扰的合适方法(即峰面积)，因此对数据质量和完整性没有影响。

根据验证方案，定量转换的每个肽的峰面积比(SIL/未标记)用于绘制线性标度的校准曲线数据。然而，相反，使用定量转换的每个肽的峰面积来绘图。由于在高加标浓度下对来自稳定同位素标记肽的未标记信号的贡献，峰面积比不能用于线性评估。由于进行了线性评估，因此对数据质量和完整性没有影响。

根据验证方案，提取效率评估使用4次连续提取(轮)进行。对于两种基质(即大麦和小麦种子)，提取效率结果不符合下述验收标准。

大麦种子-最终提取(第4轮)结果为8.2％(验收标准：<5.0％)

小麦种子-最终提取(第4轮)结果为6.2％(验收标准：<5.0％)。

第一轮提取的精确度为27.5％CV(验收标准：≤20.0％)。

但是，对研究结果没有影响，因为：(1)大麦和小麦种子的最终提取结果表明，在四轮提取后，HPPD蛋白的提取接近完成。此外，样品分析中HPPD的浓度将由单次提取(第一轮)确定，并根据提取效率％进行调整；以及(2)对于小麦种子，第一轮提取的精确度(27.5％CV)超过了20.0％CV标准，但是来自三个验证运行(运行4至6)(来自单次提取的)的QC0(内源性)的精确度和准确度结果表明达到了≤20.0％的精确度。

根据验证方案，对于每次精确度和准确度运行，在每个基质末端的高QC样品之后注入两(2)个RSB样品。然而，由于疏忽对于一种基质(即小麦种子)，在高QC样品(QC3重复3)之后进样的RSB样品是使用MRM方法获取肽GNFSQLFK(SEQ ID NO:2)而不是肽GNFSELFK(SEQID NO:1)。因此，未对小麦种子进行RSB残留评估。

但是，对研究结果没有影响，因为：(1)任何其他基质(包括小麦饲料)均未观察到肽GNFSELFK(SEQ ID NO:1)的残留，因此总体结论是肽GNFSELFK(SEQ ID NO:1)没有表现出残留的任何倾向，并可以推断小麦种子基质中肽GNFSELFK的残留是高度不可能的；(2)因此，可用数据集允许建立RSB残留验收标准(即在RT下，相比QC0的峰面积，≤未标记肽的峰面积的5.0％)以用于与肽GNFSELFK(SEQ ID NO:1)及GNFSQLFK(SEQ ID NO:2)相关的所有基质(包括小麦种子)的样品分析。

也有轻微的SOP偏差，其对研究没有影响。这些都记录在研究文件中。在进行本研究期间没有发生其他会对生成的数据的质量或完整性产生不利影响的情况。

特异性

评估了所有商品作物提取物中未标记肽和SIL肽的测定特异性。该评估显示出在被测试的商品作物样品中、在替代肽和相应的SIL肽的保留时间的一些轻微干扰。对于未标记肽，在所有测试的植物物种/基质中，空白和缓冲液样品之间两个转换的平均比率的百分比差异低于30.0％，并且所有干扰均≤QC0(内源性)样品中SIL肽的平均峰面积的5.0％，满足特异性验收标准。

线性

使用第3.4节和第0节中所述的反向曲线确定每个植物物种/基质中HPPD蛋白的线性。使用了定义反向曲线的最简单的回归模型，即线性回归。对所有植物物种/基质使用1/x的数据权重。表10总结了线性评估的标准曲线参数(斜率、截距和R值)。每个植物物种/基质中HPPD蛋白标准曲线的相关系数(R)≥0.9900。所有已建立的数据均符合第0部分所述的验收标准，并被认为适合线性评估。

表10.商品作物中具有加权因子1/x的线性方程的反向曲线参数

表11中提供了每个植物物种/基质中反向计算的反向曲线的标准浓度。

表11.商品作物中反向计算的反向曲线的标准浓度

对于每个植物物种/基质的每个标准品，N＝2定量限

在线性评估中，LLOQ和ULOQ样品的准确度(偏差)分别在±25.0％和±20.0％以内(表11)，因此定量限设置为最低和最高非零标准品的浓度。表12总结了每个植物物种/基质中HPPD的定量下限和上限。

表12.商品作物中HPPD的定量限

每个植物物种/基质中HPPD的定量范围是下限(LLOQ)和上限(ULOQ)浓度之间的区间，已证明分析程序具有合适的准确度水平。LLOQ和ULOQ样品符合每个植物物种/基质中HPPD的准确度标准。为每个植物物种/基质设置该方法的定量范围(表13)。

表13.商品作物中HPPD的定量范围

残留

测试商品作物样品的ULOQ标准品后，在线性评估中通过评估进样的空白样品来确定残留。评估表明对SIL肽的保留时间没有干扰。在ULOQ标准之后进样的至少50％的第一残留空白样品中，SIL肽的峰面积比≤20.0％的LLOQ标准品的SIL肽的平均峰面积比，满足残留验收标准。

此外，在高QC样品进样后使用RSB样品在精确度和准确度以及稳定性运行期间评估残留。总体而言，评估显示空白样品中没有残留。用于研究样品分析的RSB空白残留验收标准将≤QC0(内源性)样品中未标记肽的平均峰面积的5.0％。

精确度和准确度

商品作物的HPPD方法的精确度和准确度使用本文所述的QC样品进行评估。进行三次精确度和准确度运行。所有运行均符合运行验收标准。批内和批间运行的精确度(CV)和准确度(偏差)数据总结在表14至表23中(每个植物植物/基质一张表)。

对于批内和批间，QC0样品的CV小于25.0％，以及低、中和高QC样品的CV小于20.0％，因此，方法精确度评估是合适的。

对于批内和批间，低、中和高QC样品的偏差在±20.0％以内；因此该方法的准确度评估是合适的。

精确度和准确度批次的最长进样时间约为36小时58分钟(批次大小为187次进样)，因此这被确定为针对研究样品分析的测定的最长进样时间。

对来自精确度和准确度运行的QC0(内源性)样品进行趋势分析。QC0(内源性)样品也进行了样品分析以扩展趋势分析。

表14.大麦种子中HPPD的批内和批间的精确度和准确度结果

标称＝用于计算的实际浓度

对每次运行中每个QC，N＝3

N/Ap＝不适用

表15玉蜀黍种子中HPPD的批内和批间的精确度和准确度结果

标称＝用于计算的实际浓度

对每次运行中每个QC，N＝3

N/Ap＝不适用

表16.水稻种子中HPPD的批内和批间的精确度和准确度结果

标称＝用于计算的实际浓度

对每次运行中每个QC，N＝3

N/Ap＝不适用

表17.大豆种子中HPPD的批内和批间的精确度和准确度结果

标称＝用于计算的实际浓度

对每次运行中每个QC，N＝3

N/Ap＝不适用

表18.小麦种子中HPPD的批内和批间的精确度和准确度结果

标称＝用于计算的实际浓度

对每次运行中每个QC，N＝3

N/Ap＝不适用

表19.大麦饲料中HPPD的批内和批间的精确度和准确度结果

标称＝用于计算的实际浓度

对每次运行中每个QC，N＝3

N/Ap＝不适用

表20.玉蜀黍饲料中HPPD的批内和批间的精确度和准确度结果

标称＝用于计算的实际浓度

对每次运行中每个QC，N＝3

N/Ap＝不适用

表21.燕麦饲料中HPPD的批内和批间的精确度和准确度结果

标称＝用于计算的实际浓度

对每次运行中每个QC，N＝3

N/Ap＝不适用

表22.大豆饲料中HPPD的批内和批间的精确度和准确度结果

标称＝用于计算的实际浓度

对每次运行中每个QC，N＝3

N/Ap＝不适用

表23.小麦饲料中HPPD的批内和批间的精确度和准确度结果

标称＝用于计算的实际浓度

对每次运行中每个QC，N＝3

N/Ap＝不适用

提取效率

表24总结了从商品作物中提取蛋白质方法的效率。HPPD的所有植物物种/基质在单次迭代中都达到了可接受的提取效率。来自大麦种子(59.9％)、玉蜀黍种子(69.8％)、水稻种子(73.9％)、大豆种子(64.9％)、小麦种子(54.3％)、大麦饲料(69.8％)、玉蜀黍饲料(76.3％)、燕麦饲料(78.4％)、大豆饲料(65.4％)和小麦饲料(77.2％)的HPPD的平均提取效率表明该方法符合可接受的提取效率评估。此外，所有植物物种/基质中HPPD的CV值均低于20.0％，以及除大麦和小麦种子外的所有商品作物的最终提取量均低于5.0％。

表24.来自商品作物的HPPD的提取效率

N＝4次提取迭代和每次迭代3次重复

在第3次运行中进行提取效率

详细参见附录A、表A14

斜体和粗体值超出验收标准，请参阅第5.1.3节

表25总结了替代肽在-20℃的标称温度下6天(146小时16分钟)的干燥提取稳定性。对于干燥处理的样品稳定性评估，稳定性样品的平均峰响应比≤25.0％CV，当与第0天QC样品相比稳定性样品的差异％在±25.0％内。

表25.商品作物干提取物在-20℃标称温度下持续6天(146小时16分钟)的稳定性

对于所有的QC，N＝3；N/Ap＝不适用

^a差异％-(QC稳定性-第0天QC)/第0天QC x 100

在第7次运行中进行干燥稳定性

详细参照附录A、表A15

本研究的目的是验证使用LC-MS/MS对各种商品作物(大麦、玉蜀黍、水稻、大豆和小麦种子，以及大麦、玉蜀黍、燕麦、大豆和小麦饲料)中的对羟基苯基丙酮酸双加氧酶(HPPD)蛋白进行定量的基于MS的方法。HPPD蛋白特有的替代肽用于确定相对浓度。商品作物样品用于评估方法性能参数，包括特异性、线性、定量限、残留、精确度和准确度、提取效率和稳定性。

特异性的评估表明在任何测试的商品作物样品中对未标记的肽(空白和缓冲液之间的两次转换的平均比率差异<30.0％)和SIL肽(QC0(内源性)的SIL信号)≤5.0％)保留时间没有显著干扰。所有特异性参数均符合验收标准。

商品作物中HPPD的定量下限和定量范围(分别以fmol/mg DW和μg/g DW计)如表26所示。

表26.商品作物、替代肽、定量下限和定量范围的列表

表27中总结了该方法的批内和批间精确度和准确度。

表27.商品作物中HPPD的批内和批间的精确度和准确度范围

确定了线性方程，以充分表示所有商品作物中HPPD的浓度/检测器响应关系。对所有商品作物使用1/x的数据权重。

蛋白提取方法的效率：大麦种子为59.9％，玉蜀黍种子为69.8％，水稻种子为73.9％，大豆种子为64.9％，小麦种子为54.3％，大麦饲料为69.8％，玉蜀黍饲料为76.3％、燕麦饲料为78.4％，大豆饲料为65.4％，以及小麦饲料为77.2％。除小麦种子的CV为27.5％外，所有商品作物的第一轮提取的CV均低于20.0％。然而，来自单次提取的小麦种子的QC0(内源性)精确度和准确度结果表明达到了精确度≤20.0％。

在-20℃评估处理稳定性(干提取物)6天。稳定性评估符合验收标准。对于所有商品作物，CV≤25.0％，稳定性和第0天QC之间的峰面积比的差异％在±25.0％以内。

除了大麦和小麦种子的最终提取的％分别为8.2％和6.2％以及小麦种子第一轮提取的精确度为27.5％CV外，所有评估的性能参数均符合规定的验收标准。由于样品分析中HPPD的浓度将通过单次提取(第一轮)确定并根据提取效率％进行调整，并且在精确度和准确度运行中小麦种子的精确度达到≤20.0％，因此对研究的结果没有影响。基于本研究的结果，基于质谱的方法已被证实适用于根据GLPS对本研究中被评估的商品作物的列表中的HPPD蛋白进行定量。

虽然已经结合本发明的特定实施例描述了本发明，但是应当理解，本发明的设备能够进行进一步的改良。本专利申请旨在涵盖任何一般而言遵循本发明的原理的变化、用途或改编，并且包括这样的偏离本披露的内容：其在本发明所属领域的已知或惯常操作内，并且可以适用于此前所阐述的关键特征，并且遵循所附权利要求的范围。

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<213> 玉蜀黍

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1 5