具体实施方式

本发明提供了人脐带静脉内皮细胞在制备抗衰老的产品中的应用。本发明所述人脐带静脉内皮细胞优选为临床级人脐带静脉内皮细胞，纯度优选为99.9％。本发明对所述临床级人脐带静脉内皮细胞的分离培养方法没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的常规人脐带静脉内皮细胞的分离培养方法即可。本发明将人脐带静脉内皮细胞应用于制备抗衰老的产品，人脐带静脉内皮细胞能够起到抗衰老的作用。对于老龄化皮肤的抗衰老改善方面作用是显著的。本发明所述老龄化，优选指年龄为60周岁左右的人群。

本发明还提供了人脐带静脉内皮细胞在制备抗皮肤衰老的产品中的应用。人脐带静脉内皮细胞可以改善衰老皮肤光泽、增加皮肤厚度、减少皮下血管数量、增加皮肤含水量和/或减少皮肤油分，将皮肤由粗糙改为柔细，增加皮肤弹性。

本发明还提供了人脐带静脉内皮细胞在制备抗D-半乳糖所致皮肤衰老的产品中的应用。人脐带静脉内皮细胞可以抗D-半乳糖所致皮肤衰老，改善皮肤光泽、增加皮肤厚度、减少皮下血管数量、增加皮肤含水量和/或减少皮肤油分，将皮肤由粗糙改为柔细，增加皮肤弹性。

本发明还提供了人脐带静脉内皮细胞在制备改善衰老皮肤光泽的产品中的应用。试验结果表明，经人脐带静脉内皮细胞处理后，皮肤光泽明亮。

本发明还提供了人脐带静脉内皮细胞在制备增加衰老皮肤厚度的产品中的应用。试验结果表明，经人脐带静脉内皮细胞处理后，皮肤变厚。

本发明还提供了人脐带静脉内皮细胞在制备减少衰老皮肤皮下血管数量的产品中的应用。试验结果表明，经人脐带静脉内皮细胞处理后，皮下血管显著减少。

本发明还提供了人脐带静脉内皮细胞在制备增加衰老皮肤含水量和/或减少皮肤油分的产品中的应用。试验结果表明，经人脐带静脉内皮细胞处理后，皮肤含水量增加，油分减少，增加皮肤弹性。

本发明还提供了人脐带静脉内皮细胞在制备改善衰老皮肤粗糙度的产品中的应用。试验结果表明，经人脐带静脉内皮细胞处理后，皮肤状态从粗糙到柔细变化。

本发明还提供了一种抗衰老的人脐带静脉内皮细胞冻干粉，所述冻干粉的制备方法包括以下步骤：

将人脐带静脉内皮细胞进行反复冻融、真空冷冻干燥，得到人脐带静脉内皮细胞冻干粉。

具体的，本发明优选将人脐带静脉内皮细胞进行扩增，收获细胞重悬于生理盐水中，在-80℃冻成固体状；解冻，加水稀释，得到细胞悬液，再在-80℃冷冻，重复此步骤，得到反复冻融的细胞悬液；将反复冻融的细胞进行真空冷冻干燥，得到人脐带静脉内皮细胞冻干粉。

本发明将人脐带静脉内皮细胞进行扩增，收获细胞重悬于生理盐水中，在-80℃冻成固体状。本发明优选选取由原代传代至P5的人脐带静脉内皮细胞进行扩增。本发明优选收获1000万细胞重悬于10mL生理盐水中。本发明所述-80℃的条件优选由冰箱提供。

本发明解冻，加水稀释，得到细胞悬液，再在-80℃冷冻，重复此步骤，得到反复冻融的细胞。本发明优选加入10倍体积的水，所述水优选为双蒸水。本发明所述-80℃的条件优选由-80℃冰箱提供。本发明所述冷冻优选为过夜冷冻，更优选为冷冻8～12h。本发明反复冻融的次数优选为3～5次，更优选为3次。

反复冻融后，本发明将反复冻融的细胞进行真空冷冻干燥，得到人脐带静脉内皮细胞冻干粉。本发明所述人脐带静脉内皮细胞冻干粉制备好后，优选在4℃保存。具体的，所述真空冷冻干燥优选包括以下步骤：开启真空冷冻冻干机，将细胞悬液冻至-45℃；然后开启冻干机冷阱制冷至-45℃，抽真空至20Pa；开启箱体加热至-20℃，并保持240min；继续加热至1℃保温240min；继续加热至30℃保温300min；检测合格后36℃出料；灌装检验入库。

本发明所述人脐带静脉内皮细胞冻干粉在使用时，优选使用溶剂进行稀释，稀释后每毫升溶液中优选含2000～50000个人脐带静脉内皮细胞。

本发明所述人脐带静脉内皮细胞冻干粉具有抗衰老功能，抗皮肤衰老活性强，可以改善衰老皮肤的光泽、增加皮肤厚度、减少皮下血管数量、增加皮肤含水量和/或减少皮肤油分，将皮肤由粗糙改为柔细。本发明所述制备方法得到的人脐带静脉内皮细胞纯度高达99.9％，为临床级人脐带静脉内皮细胞，本发明所述人脐带静脉内皮细胞具有易获得、无伦理争议、无创取材的优势，且使用、保存及运输便利；目前市面存在干细胞抗衰老临床研究以静脉及面部注射活细胞为主，由于使用的是新鲜细胞，对运输的要求较高，会增加运输成本；其次，新鲜细胞的活力不能完全保存，制备的新鲜细胞一般在4h内需立即使用，时间越长，活力及性能会下降。本发明结合真空冷冻干燥方法，将干细胞在低温下使其所含的水分冻结，然后在真空的环境下干燥，让水分由固体状态直接升华为水蒸气并从细胞制品中排出而使细胞全部的活性因子干燥，有效地防止了细胞的理化及生物特性的改变，对生物组织和细胞结构和特征的损伤较小，使其快速进入休眠状态，有效保护了细胞有效成份的稳定性及其活性因子的生物效能；其次，人脐带静脉内皮细胞冻干粉在干燥后形态疏松、颜色基本不发生改变，加水后能够快速溶解并恢复原有水溶液的理化特性和生物活性。此外，由于干燥在真空条件下进行，对于一些易氧化的物质具有很好的保护作用。最后，本发明冻干粉经过冻干后水份含量非常低，使制品的稳定性提高，受污染的机会减小，这不仅方便了运输还延长了制品保存期限。

目前并未有关于人脐带静脉内皮细胞抗衰老的研究出现，且关于干细胞抗衰老的研究多集中于间充质干细胞及其冻干粉或分泌因子，分泌因子抗皮肤衰老虽然可以克服使用的不便以及运输保存成本增加等弊端，但是并不能达到完全获得细胞的生物活性因子；使用脐带间充质干细胞冻干粉抗皮肤衰老的研究，人群样本较年轻，多集中在30～50岁之间，以及所需细胞数量大(100万/mL)。本发明所述人脐带静脉内皮细胞冻干粉在浓度为2000～50000个细胞/mL的条件下能使14月龄亚急性衰老模型(D-半乳糖诱导)小鼠背部皮肤(相当于人60岁左右的皮肤状态)在15天内有年轻态的变化，并在30天处理后能显著延缓皮肤衰老，维持皮肤水油平衡以及增加皮肤弹性。本申请所述冻干粉对于老龄化皮肤的抗衰老改善方面作用是显著的。

本发明还提供了一种抗衰老的人脐带静脉内皮细胞溶液，所述溶液以寡肽原液为溶剂，以上述技术方案所述冻干粉为溶质，混合得到。在本发明中，每毫升溶液中优选含2000～50000个人脐带静脉内皮细胞，更优选为50000个人脐带静脉内皮细胞。在本发明中，所述寡肽原液的制备用原料优选包括以下质量百分含量的组分(％)：水70，丙二醇1，水解胶原3，乙酰半胱氨酸2，乙酰络氨酸1，丙氨酸1，芦荟提取物2，北美金缕梅提取物2，黄芩提取物2，苦参根提取物2，胀果甘草根提取物2，寡肽-12，甜菜碱2，对羟基苯乙酮1，1,2-己二醇1，尿囊素1，透明质酸钠2，甘草酸二钾1，燕麦肽2(该寡肽原液由上海姿博生物科技有限公司自制,货号：O-0001)。本发明所述寡肽原液对皮肤没有任何伤害，且有助于胶原蛋白和弹性蛋白的生成，维持皮肤年轻弹性。由于寡肽是一种微小分子结构，所以其能够轻松透过表皮细胞，直达表皮细胞下的真皮层并被真皮细胞快速吸收，所以用寡肽做人脐带静脉内皮细胞冻干粉溶剂可以促进后续细胞冻干粉成效的吸收，直达真皮层。本发明选用14月龄的小鼠，在背部皮下注射D-半乳糖诱导小鼠亚急性衰老模型，建造一个皮肤老龄化的动物模型。将人脐带静脉内皮细胞冻干粉用寡肽原液溶解制成干细胞冻干粉涂抹于小鼠背部皮肤，可以改善衰老皮肤光泽、增加皮肤厚度、减少皮下血管数量、增加皮肤含水量和/或减少皮肤油分，将皮肤由粗糙改为柔细。

下面结合具体实施例对本发明所述的人脐带静脉内皮细胞在制备抗衰老的产品中的应用及抗衰老冻干粉和溶液做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1

临床级原代人脐带静脉内皮细胞的分离及培养

表1耗材列表清单

表2试剂列表

临床级原代人脐带静脉内皮细胞的分离、制备及传代扩增

1实验开始前检查实验环境和仪器、设备运行情况。对生物安全柜操作台面进行75％乙醇溶液擦拭消毒，对器具、用品进行高压或酒精擦拭消毒。

2将脐带组织的两端结扎，浸泡于含有双抗的生理盐水瓶子中，2～8℃运输到实验室。在生物安全柜中打开瓶子，弃去瓶中保存液后，向瓶中加入生理盐水(浸没脐带即可)，震荡清洗。

3弃去盐水后，将脐带倒入无菌100mm培养皿中，用75％乙醇溶液喷淋脐带表面。用生理盐水清洗喷淋后的脐带2～3次后，向培养皿中加入生理盐水，取无菌剪刀将脐带分为3～4cm的小段，用镊子夹住脐带中央向两端推挤，洗去血液。

4将洗干净的脐带放入含生理盐水的无菌100mm培养皿中，找到脐静脉，从静脉旁边钝性剥开脐带，剔除静脉放入培养皿，分离脐带间充质(华氏胶)放入培养皿。分别用生理盐水和5mL注射器将培养皿中的血管冲洗三次以上，以清除血管内血液。

5用血管夹夹住血管一头，用5ml注射器注入胶原酶至血管明显胀起，用血管夹夹住另一头。盖上培养皿盖子放入5％CO₂，37℃细胞培养箱消化15min。消化后的血管用生理盐水和5mL注射器冲洗3遍，收集冲洗后的液体至50mL离心管，1500rpm离心5min。

6弃上清向沉淀中加入10mL ECM完全培养基重悬，制成细胞悬液。按照4～5cm血管种植六孔板一个孔。显微镜观察并每3天更换培养基。

7待细胞融合度达80％，加入5mL生理盐水洗去瓶中残余培养基。弃去生理盐水后，加入1mL Tryple-Express，室温或37℃静置消化2min左右，直至显微镜观察细胞呈透亮圆形，轻轻晃动飘起。

8消化后加入5mL生理盐水终止消化，冲洗下瓶壁残余细胞后将液体转移至离心管，1500rpm离心5min。弃上清，按1:3比例接种六孔板。放入培养箱于5％CO₂，37℃条件下培养。

9用显微镜观察六孔板细胞培养瓶中细胞状态，细胞融合度达到80％时进行传代。加入10mL生理盐水洗去瓶中残余培养基，弃去生理盐水后，加入1mL Tryple-Express，室温或37℃静置消化2min，消化好的细胞加入5mL生理盐水终止消化，冲洗下瓶壁残余细胞后将液体转移至离心管，1500rpm离心5min。

10弃上清，向沉淀中加入20mL完全培养基重悬，制成细胞悬液。取20μL计数后，按照100万/T-175接种于培养瓶进行扩增培养。放入培养箱于5％CO₂，37℃条件下培养。

临床级人脐带静脉内皮细胞的鉴定及纯度检测(结果如图1)

临床级人脐带静脉内皮细胞的鉴定

1将制备扩增得来的细胞铺24孔板，待细胞融合度为80％，用DPBS清洗3次，用4％PFA固定15min，再用DPBS清洗3次。

2用5％BSA+0.4％Triton X-100透化液配制按1:500比例配制一抗(Anti-VonWillebrand Factor antibody,货号ab154193,abcam公司)孵育液，一抗4℃孵育过夜。

3弃一抗，用DPBS清洗3次，按1:500比例用上述透化液配制二抗(Anti-rabbit IgG(H+L)，F(ab')2Fragment(Alexa488Conjugate),货号4412，Cell SignalingTechnology公司)孵育液，二抗室温孵育1h。

4弃二抗，用DPBS清洗3次，室温孵育DAPI(货号D9542，Sigma公司)15min，吸弃DAPI染色液，用DPBS清洗3次，用荧光显微镜(OLYMPUS IX51)观察及拍照。

5如图1中的A所示，血管性血友病因子(Von Willebrand Factor)是一种多聚体粘附糖蛋白，由内皮细胞合成和分泌，是参与血管形成过程的关键因子。通过免疫荧光染色检测Von Willebrand Factor阳性表达为100％，鉴别该制备细胞为内皮细胞。

临床级人脐带静脉内皮细胞的纯度检测

1将制备扩增得来的细胞铺6孔板(2个孔)，待细胞融合度为80％，生理盐水洗去瓶中残余培养基，弃去生理盐水后，加入1mL Tryple-Express，室温或37℃静置消化2min，消化好的细胞加入5mL生理盐水终止消化，，离心100g，5min。

2取细胞染色PE Mouse Anti-Human CD31(货号：555446，BD公司)，用流式细胞仪(货号：FACSCanto II，BD公司)检测CD31的阳性表达。

3如图1中的B所示，内皮细胞粘附分子-1(Platelet/endothelial cell adhesionmolecule-1，PECAM-1 or CD31)在内皮细胞-细胞连接处高表达，起着粘附应激反应蛋白的作用，既可以维持内皮细胞连接完整性，又可以迅速恢复发炎或血栓形成后血管通透性屏障。通过对细胞表面抗原检测，CD31在该细胞中表达率为99.9％，鉴别该制备细胞为纯度为99.9％的内皮细胞。

实施例2

临床级人脐带静脉内皮细胞冻干粉制作

1.取P5并经过质量鉴定合格的临床级人脐带静脉内皮细胞进行扩增，收获1000万细胞重悬10mL生理盐水中，放置在-80℃冰箱中冻成固体状；将细胞解冻，加入10倍体积的双蒸水稀释细胞悬液，再放入-80℃冰箱中过夜冷冻(重复该步骤3次)，得到反复冻融的细胞悬液；

2.开启真空冷冻冻干机，将细胞悬液冻至-45℃；然后开启冻干机冷阱制冷至-45℃，抽真空至20Pa；开启箱体加热至-20℃，并保持240min；继续加热至1℃保温240min；继续加热至30℃保温300min；检测合格后36℃出料；灌装检验入库。

实施例3

临床级人脐带静脉内皮细胞冻干粉对小鼠老龄化皮肤的作用

实验步骤

9月龄雌性昆明鼠购买于维通利华的，饲养至12月龄，称重，背部退毛并按剂量1mg/g皮下注射D-半乳糖(货号：D8310，北京索莱宝科技有限公司)，连续注射30天，每天一次，进行皮肤衰老造模。

注射D-半乳糖结束一周后，将小鼠随机分成4组：1)control(寡肽原液)；2)2000cells/mL；3)10000cells/mL；3)50000cells/mL进行不同组别的处理(所有细胞冻干粉用寡肽原液做溶剂)。每天涂抹0.1mL不同浓度的临床级人脐带静脉内皮细胞冻干粉于小鼠背部直至吸收。

每周测量一次小鼠体重，每15天进行拍照记录小鼠皮肤老化情况，并于治疗结束后用皮肤检测仪检测小鼠背部皮肤的含水量、油分及弹性，评估该冻干粉抗皮肤衰老的作用。

结果分析如图2(临床级人脐带静脉内皮细胞冻干粉干预4周内小鼠体重的变化)，如图2所示，小鼠体重在干预处理的四周内并未有显著改变，表明小鼠处于一个正常饮食状态，其次由于小鼠处于老龄化，体重并未明显增加，且有小部分下降趋势。

如图3(临床级人脐带静脉内皮细胞冻干粉抗小鼠皮肤衰老作用结果；细胞冻干粉分为2000cells/mL、10000cells/mL和50000cells/mL三个浓度梯度(溶解于寡肽原液，干预周期为四周))所示，在day0时，4组衰老小鼠背部皮肤变薄，皮色暗淡，皮下血管明显。在经过15天的临床级人脐带静脉内皮细胞冻干粉处理后，相对于control组，三个不同浓度的处理组的小鼠皮色光泽明亮，肉眼观察到皮肤变厚，皮下血管显著减少。经过一个月处理后，三种浓度细胞冻干粉处理组的小鼠皮肤状态相比同天control组依然有显著改善，并且50000cells/mL的处理组小鼠皮肤状态更佳。

表3临床级人脐带静脉内皮细胞冻干粉抗小鼠皮肤衰老-皮肤含水量、油分及弹性

注：一定范围内，含水量高，油分低，皮肤弹性指数好，证明皮肤更年轻化；油分越高，含水量低，则证明皮肤偏粗老。

经过4周的处理后，对不同组处理后的小鼠皮肤状况进行量化评估，利用皮肤监测仪检测小鼠皮肤的含水量、油分及弹性。从表3中可以看出，人脐带静脉内皮细胞冻干粉在抗小鼠皮肤衰老作用时具有剂量依赖性。随着细胞冻干粉浓度的增加，小鼠皮肤的含水量增加，油分减少，皮肤状态也从粗糙到柔细变化。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。