一种睡莲茎细胞水的提取方法和得到的睡莲茎细胞水的应用
阅读说明：本技术 一种睡莲茎细胞水的提取方法和得到的睡莲茎细胞水的应用 (Extraction method of water lily stem cell water and application of obtained water lily stem cell water ) 是由 张文环 蔡少纯 李佩晶 耿林 艾艳 艾勇 于 2020-06-03 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种睡莲茎细胞水的制备方法,采用低温真空提取技术与酶解技术相结合,不需要添加任何溶剂,在较低的温度下能得到纯天然的睡莲茎细胞水。通过本发明方法得到的睡莲茎细胞水品质高,澄清透明、含有50多种易挥发活性成分,具有清爽怡人的气味,具有抗氧化、保湿、抗炎的效果,可作为绿色天然的原料应用于食品、保健品、药品及化妆品等领域。(The invention discloses a preparation method of water lily stem cell water, which combines a low-temperature vacuum extraction technology with an enzymolysis technology, does not need to add any solvent, and can obtain pure natural water lily stem cell water at a lower temperature. The water lily stem cell water obtained by the method has high quality, is clear and transparent, contains more than 50 volatile active ingredients, has fresh and pleasant smell, has the effects of oxidation resistance, moisture retention and inflammation resistance, and can be used as a green and natural raw material to be applied to the fields of food, health care products, medicines, cosmetics and the like.)
技术领域
本发明涉及农产品处理技术领域，特别是涉及一种睡莲茎细胞水的制备方法以及睡莲茎细胞水的应用。
背景技术
睡莲，多年生水生草本，根状茎肥厚，从东北至云南，西至新疆皆有分布，朝鲜，日本，印度，俄罗斯，北美等。生于池沼、湖泊等静水水体中。许多公园水体栽培作为观赏植物，根状茎食用或酿酒，又入药，能治小儿慢惊风；全草可作绿肥。实验研究表明，睡莲对重金属具有吸附作用。睡莲浸出液对铜绿微囊藻的生长有一定的抑制作用，表现为明显的低促高抑现象。根据对睡莲的营养成分分析，结果表明睡莲富含17种氨基酸，睡莲蛋白属优质蛋白。分析结果还表明睡莲含有丰富的VC、黄酮甙、微量元素锌，这二者配合具有很强的排铅功能。动物急性毒性实验、微核试验及精子畸变实验都表明睡莲是一种安全可靠无任何毒副作用物质。睡莲花粉营养丰富，具有完全性、均衡性、浓缩性等特点，是具有开发利用前景的天然营养源。
中国专利申请2019102522047公开了一种白睡莲根茎提取物的提取工艺。主要是通过采用溶剂法提取桦木酸。但是，该方法采用了乙醇作为提取剂，乙醇无法完全去除，导致一些对于乙醇过敏者不可使用。
酶解法也常用于植物细胞液的提取中。中国专利申请CN109730948A公开了一种采用超声低温旋蒸法和酶法相结合制备牡丹鲜花细胞水的方法：首先通过压榨法得到榨汁和残渣1，再将残渣1旋蒸得到细胞水1和残渣2，最后将残渣2进行酶解再旋蒸得到细胞水3。将榨汁、细胞水1/2混合后得到高收率牡丹花细胞水。该方法具有较高的提取效率，但是具有如下缺陷：(1)采用压榨法，后与真空提取法得到的液体混合，这样会带入多糖、色素和刺激气味，导致防腐和脱色问题；(2)工艺后期配合其他植物一起蒸馏，解决防腐问题，但是容易改变原有的牡丹花细胞水成分和气味！后期生产也无法控制品质。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种睡莲茎的提取方法，得到纯天然的睡莲茎细胞水，具有50多种挥发性活性成分，具有抗氧化、保湿、抗炎的效果，可作为绿色天然的原料应用于食品、保健品、药品及化妆品等领域。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种睡莲茎细胞水的制备方法，包括以下步骤：不加入溶剂，将睡莲茎在30℃-60℃、压力-60kPa～-101kPa下初步提取，睡莲茎细胞水形成蒸气并冷凝收集液体，提取1-2.5小时，得到初提细胞水和初提睡莲茎残渣；在初提细胞水中加入初始睡莲茎总质量为基准的0.2-0.4％的纤维素酶和0-0.1％果胶酶，再将初提细胞水加入初提睡莲茎残渣中，在35℃-55℃、压力-70kPa～-101kPa条件下再次提取，3-6小时提取结束，收集得到睡莲茎细胞水。
初步提取时间是关键参数之一，如果时间太短，提取出的睡莲茎细胞水过少，加入酶后细胞水很难湿润睡莲茎表面，导致酶解不能正常进行。如果初步提取时间过长，细胞水流出过多，降低了后续提取效率，也增加了酶解时间带来过度酶解的风险。本发明通过在初提细胞水中加入一定量的酶，再次投入容器中对睡莲茎残渣进行提取，具有如下有益优点。第一、初提细胞水表面张力低，渗透性好；第二、初提细胞水pH为3-7，无需额外调节pH，有利于提高酶活性；第三、酶解能够加速破壁；第四、低温真空技术。通过四种效应的协同，能够在较低温度(35-55℃)下控制酶解速度，加快细胞液流出速度。再次提取步骤中的前1小时左右会蒸除掉倒回容器内的初提细胞水，加快酶解速度，缩短酶解的时长(此时初提液体的多少就至关重要，多了会延长酶解时间，少了会缩短酶解时间)，也避免了传统酶解法需要加入大量的水稀释细胞液以及酶解过度带来的刺激气味。
关于初提液体的渗透性，通过实验发现，当采用睡莲茎细胞液作为溶剂法的溶剂提取睡莲茎残渣时，相比于采用纯水作为溶剂，能够多提取出70％左右的黄酮和多糖。
优选的，所述的初提阶段的温度为40℃-50℃，压力为-75kPa～-101kPa。优选的初提条件可以达到多提取出初提细胞液与活性成分保留的平衡。
优选的，再次提取条件为40℃-50℃、压力-80kPa～-101kPa。通过优选的再次提取步骤，能够保证初提细胞液存在时间为45分钟-1.5小时范围内，保证合适的酶解时间。
优选的，在初提细胞水中加入初始睡莲茎总质量为基准的0.25-0.35％的纤维素酶和0-0.06％果胶酶。酶的加入量关系到酶解的速度，太多会导致酶解过度，太低也会造成酶解不足，细胞水的提取率降低。
在提取过程中进行搅拌，搅拌速度为1-150转/分钟。通过搅拌，可以保证传热效果，也能够增加睡莲茎暴露在真空条件下的几率，减少提取时间。
收集过程中进行冷凝，温度为-10～8℃。
所述的睡莲茎切成1-10mm厚的片状。可采用往复式切割机进行切割。
上述的睡莲茎细胞水应用，睡莲茎细胞水具有抗氧化、保湿、抗炎的效果，用于护肤品、食品、保健品等。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
通过单一低温-真空提取技术得到的睡莲茎细胞水，挥发性活性成分较少，气味相对较淡，并且提取时间比较长。本发明不加入任何溶剂，利用低温真空提取技术与酶解技术能够加速细胞液提取速度的同时，也能够抑制酶解法过度酶解会导致有色物质与重异味物质析出的缺陷。通过本发明方法得到的睡莲茎细胞水具有50多种挥发性活性成分，香味浓郁，液体澄清透明，不含有多糖、黄酮等易霉变物质，具有抗氧化、保湿、抗炎的效果。
附图说明
图1：睡莲茎细胞水安全性测试结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例和对比例所采用的睡莲茎无霉变，洗净后沥干水分进行以下实施例和对比例提取实验。
实施例1：不加入任何溶剂，将50kg睡莲茎利用往复式切割机切割成2-6mm厚的片，在45℃、压力-85kPa下初步提取，睡莲茎细胞水形成蒸气后冷凝收集液体，提取2.5小时，得到初提细胞液和睡莲茎初提残渣，加入100g纤维素酶和25g果胶酶，再将初提细胞液加入初提残渣中，在45℃、压力-90kPa条件下再次提取，8小时提取结束，收集得到睡莲茎细胞水。提取全程冷凝温度-5℃，搅拌45转/分。得到的睡莲茎细胞水澄清透明，香味浓郁，40.1kg。
实施例2：实施例2与实施例1的区别在于，初步提取阶段中，温度35℃、压力-65kPa。得到37.9kg睡莲茎细胞水，澄清透明，香味浓郁。
实施例3：实施例3与实施例1的区别在于，初步提取阶段中，温度55℃、压力-100kPa。得到39.2kg睡莲茎细胞水，澄清透明，香味浓郁。
实施例4：实施例4与实施例1的区别在于，再次提取阶段中，35℃、压力-70kPa。得到37.5kg睡莲茎细胞水，澄清透明，香味浓郁。
实施例5：实施例5与实施例1的区别在于，再次提取阶段中，55℃、压力-100kPa。得到38.1kg睡莲茎细胞水，澄清透明，香味浓郁。
实施例6：实施例6与实施例1的区别在于，加入的纤维素酶200g、果胶酶50g，再次提取时间6小时。得到40.3kg睡莲茎细胞水，澄清透明，香味浓郁，但是有一丝杂味。
对比例1：不加入任何溶剂，将50kg睡莲茎利用往复式切割机切割成2-6mm厚的片，在45℃、压力-100kPa下提取，睡莲茎细胞水形成蒸气后冷凝收集液体(冷凝温度为-5℃)，提取8小时，全程搅拌45转/分，得到澄清透明的睡莲茎细胞水，34.3kg，香味不够浓郁。
对比例2：将50kg睡莲茎利用往复式切割机切割成2-5mm厚的条状，与5kg水、200g纤维素酶和50g果胶酶混合后在50℃下搅拌50℃下搅拌45分钟，后在60℃、压力-100kPa下提取，睡莲茎细胞水形成蒸气后冷凝收集液体(冷凝温度为-5℃)，提取8小时，全程搅拌45转/分，得到澄清透明的睡莲茎细胞水39.8kg(含有5kg水)，气味不够浓郁。
对比例3：将50kg睡莲茎利用往复式切割机切割成2-5mm厚的条状，与5kg水、100g纤维素酶和25g果胶酶混合后在50-60℃下搅拌6小时，全程搅拌45转/分，过滤(两重过滤，先采用离心机固液分离，再采用0.22um滤膜精滤)得到41.4kg睡莲茎细胞水(含有5kg外加的水)，液体中有微小悬浮物，并且异味重。
对比例4：与实施例1的区别在于，初提时间为30分钟，得到澄清透明的32.5kg睡莲茎细胞水，气味较淡。
对比例5：与实施例1的区别在于，初提时间为4小时，得到澄清透明的38.5kg睡莲茎细胞水，有明显的异味。
表1：实施例和对比例所提取睡莲茎细胞液检测结果(以下含量精确到小数点后一位)
续表1：
实施例和对比例实验数据评价：
由对比例1可知，通过采用单一低温-真空提取法，提取得到的细胞液虽然防腐性能合格，但是活性成分较少、气味较淡。
由对比例2可知，虽然额外加入5kg水与纤维素酶、果胶酶，但是由于水的加入量不足，无法浸湿全部的植物表面，并且半小时即蒸发完毕导致酶解不足。并且额外加入的水会稀释细胞液，降低品质。
由对比例3可知，采用纯酶解技术，导致酶解过度、异味重，并且即使通过双重过滤，液体中还是会含有一些肉眼可见细小悬浮物。
由对比例4/5可知，初提时间也会较大的影响整个提取过程：如初提时间过短，无法覆盖植物表面，不到半小时即蒸发完毕导致酶解不足。如初提时间过长，加入酶后再次提取过程中，酶解时间过长，导致有明显异味，同时，由于初提残渣表面太干，导致酶解很难进入残渣内部，因此细胞水的收率不高。
各项测试方法：
(1)睡莲茎细胞水活性成分分析：在80℃进样温度下进行顶空气质检测。
1.仪器信息：
Agilent 7980A GC；
MS:5975C；
50/30μm CAR/PDMS/DVB萃取纤维头，美国SUPELCO公司。
2.GC-MS条件：
色谱柱为HP-INNOWAX毛细管柱子(30m×0.25mm×0.25μm)；载气为He，流速1mL/min，分离比5:1；进样温度为250℃；升温程序为起始温度为40℃，保持5min，以8℃/min，升至250℃，保持5min。
质谱条件：EI电离源，能量70eV；离子源温度230℃，四极杆温度150℃，接口温度250℃，扫描范围30-400m/z。
3.样品前处理：
将5mL样品、1g NaCl置于20ml顶空瓶中，拧紧瓶盖。于搅拌模式80℃下平衡5min后，用固相微萃取针80℃下萃取5min，然后于进样口解析5min。
表2：实施例1睡莲茎细胞水顶空气检测结果(仅保留含量高的成分)
(2)睡莲茎细胞水安全性测试
HaCaT细胞为人永生表皮细胞系，对HaCaT细胞的细胞毒性，可作为对皮肤安全性的参考数据。正常细胞代谢旺盛，其线粒体内的琥珀酸脱氢酶，可将四唑盐类物质还原为带颜色的结晶状物质，沉积在细胞周围，该变化可通过酶标仪读取OD值，通过OD值与空白对照组的比较，可以得知细胞的相对生长情况。
由说明书附图1(实施例1睡莲茎细胞水安全性测试图)睡莲茎细胞水对人体表皮细胞基本无毒性，是非常天然绿色的原料。
(3)睡莲茎细胞水抗氧化性能
采用DPPH自由基清除法，根据DPPH分子中存在的稳定氮自由基，其醇溶液呈深紫色，且在517nm附近有强吸收。当有自由基清除剂存在时，分子中的单电子因配对而使其吸收逐渐消失，其褪色程度与其接受的电子数量成定量关系，因此，可通过测定其最大吸收波长517nm处的吸光度的减少来定量分析自由基清除能力测定样品的抗氧化功效。实施例1睡莲茎细胞水实验例结果如下表所示。
睡莲茎细胞水浓度(％)
DPPH清除率/％
20
10
40
16
50
23
60
30
80
37
100
50
通过上表中的数据可以看出，睡莲茎细胞水具有良好的抗氧化功效。
(4)睡莲茎细胞水抗炎功效
睡莲茎细胞水中活性成分较多，其中具有抗菌消炎成分比较明显，如苯乙醇等，因此对其进行抗炎功效的测试。
脂多糖是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分,它可以激活巨噬细胞释放多种炎性细胞因子，因此利用脂多糖(LPS)刺激小鼠单核-巨噬细胞建立体外炎症反应模型，样品进行干预，以及采用地塞米松为阳性对照，采用酶联免疫法(ELISA)测定炎症因子IL-6和TNF-α的水平变化，从而探讨样品的体外抗炎作用。
将实施例1的睡莲茎细胞水原液配制成不同的浓度进行测试，测试结果如下表。
睡莲茎细胞水浓度
IL-6(pg/mL)
TNF-α(pg/mL)
100％
35
151
80％
37
162
40％
36
189
15％
39
205
10％
45
216
5％
48
230
空白
25
150
LPS刺激
50
260
地塞米松
45
206
从上表中可得知，15％浓度的睡莲茎细胞水具有抗炎的作用，可使皮肤受LPS刺激后，IL-6表达因子下降明显；而100％浓度的睡莲茎细胞水可使受LPS刺激后的皮肤的TNF-α表达因子下降到正常范围内。
(5)睡莲茎细胞水保存条件
睡莲茎细胞水中活性成分较多，为防止其中菌类繁殖导致产品质量下降，因此如何保存十分重要。
下表对实施例1睡莲茎细胞水在室温、4℃，两种保存条件下的理化值和菌类繁殖情况进行了为期一个月的检测。
1)室温不加防腐剂
2)4℃不加防腐剂
下表对对比例3的睡莲茎细胞水在室温、4℃，两种保存条件下的理化值和菌类繁殖情况进行了为期一个月的检测。
3)室温不加防腐剂
4)4℃不加防腐剂
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