阅读说明：本技术 一种从荷叶中联产多种活性物质的方法 (Method for co-producing multiple active substances from lotus leaves ) 是由 李响 于 2019-07-17 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种从荷叶中联产多种活性物质的方法,该包括以下步骤：提取、萃取得各活性物质部分,再分别对各部分进行分离纯化,最终得到了8种生物碱单体、3种黄酮单体以及4种多酚单体,且本申请制备得到的荷叶总生物碱、荷叶总黄酮以及荷叶总多酚均可直接应用于不同的领域。本发明提供的方法操作简便,生产周期短,分离效率高,工艺稳定,成本低廉,可实现工业化从荷叶中联产多种活性物质,得到的单体的纯度达95％以上,有效成分回收率大于70%,极大地利用了荷叶资源。(The invention discloses a method for co-producing multiple active substances from lotus leaves, which comprises the following steps: extracting and extracting to obtain active substance parts, and then respectively separating and purifying the active substance parts to finally obtain 8 alkaloid monomers, 3 flavone monomers and 4 polyphenol monomers, wherein the lotus leaf total alkaloids, the lotus leaf total flavones and the lotus leaf total polyphenols prepared by the method can be directly applied to different fields. The method provided by the invention has the advantages of simple operation, short production period, high separation efficiency, stable process and low cost, can realize industrial co-production of various active substances from lotus leaves, ensures that the purity of the obtained monomer reaches more than 95 percent, ensures that the recovery rate of active ingredients is more than 70 percent, and greatly utilizes lotus leaf resources.)

一种从荷叶中联产多种活性物质的方法

技术领域

本发明属于中药活性成分的分离纯化技术领域，具体涉及一种从荷叶中联产多种活性物质的方法。

背景技术

荷叶为睡莲科莲属植物莲Nelumbo nucifera Gaertn .的干燥叶，世界各国均有分布，在我国大部分地区也均有分布，主产于湖北、湖南、浙江、江苏等地，在湖北种植面积达100万亩左右。本公司地处湖北洪湖，是著名的水产之都，盛产莲藕，其是洪湖的主要特产之一。荷叶苦，平，归肝、脾、胃经，具有解暑清热、生发清阳、散瘀止血等功效。1991 年11月，***的卫监发(1991) 第45 号文件中，荷叶被列入第2 批“既是食品又是药品”的名单之中。荷叶具有减肥降脂作用，《本草纲目》中就有“荷叶服之，令人瘦劣”的记载。荷叶中含有蛋白质、维生素 C、脂肪、碳水化合物、胡萝卜素、硫胺素、尼克酸等物质，同时还含有铁、钙、磷等多种微量元素以及黄酮类化合物和包括荷叶碱、亚美罂粟碱、原荷叶碱、N-去甲基荷叶碱等在内的多种生物碱。荷叶中的黄酮类化合物和生物碱均具有明显的生物活性和生理功能，荷叶提取物具有降脂减肥、抗氧化、抑制高胆固醇血症和动脉硬化和抑菌等功效，因此对于荷叶提取物的研究成为医药、美容、食品界备受关注的焦点。

荷叶中活性物质种类丰富，包括多酚类、黄酮类、生物碱类、皂苷类、甾体类、有机酸、多糖、氨基酸及挥发油等物质，用于化妆品配方中，能够起到显著的抗氧化、抗皱、补水、美白、淡化色斑、亮肤等作用。

由于洪湖莲藕的种植量大，由此衍生的一系列产品也非常多，但其多由藕、莲子等加工制作而成，目前对于荷叶的利用还不充分，造成了资源的极大浪费。目前传统提取荷叶粉有效物质的方法提取得率都不高，而且提取过程中都会使用到大量的有机溶剂，不利于实际生产应用。

本发明为充分利用荷叶资源，拓展荷叶资源的应用领域，减少因为荷叶腐烂而对环境造成的污染问题，对其中的活性成分进行提取、纯化，其工艺简单，成本低廉，同时可联产多种生物活性物质，进而应用于不同的领域。

发明内容

本发明旨在克服现有技术的缺陷，提供一种从荷叶中联产多种生物活性物质的方法。该方法操作简便，生产周期短，分离效率高，工艺稳定，成本低廉，可实现工业化联产荷叶中多种生物活性物质，得到的各活性物质纯度高达95％以上，有效成分回收率大于70%。

为了实现上述发明，本发明采用的技术方案如下：从荷叶中联产多种生物活性物质的方法包括以下步骤：

1）将荷叶清洗烘干后，粉碎过80目筛，以体积分数为65-95%的甲醇或乙醇，超声波辅助加热提取2-3次，提取温度为60-85℃，每次提取时间为0.5-2小时，合并提取液，提取液经真空抽滤去除滤渣，减压浓缩得浸膏；

2）将步骤1）得到的浸膏用水分散后，依次以石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，所得氯仿部分、乙酸乙酯部分和正丁醇部分供进一步分离；

3）将上述步骤2）中得到的氯仿部分经超滤膜设备，所得过滤液再经纳滤膜设备，所得滤液减压浓缩后，经冷冻干燥或喷雾干燥得荷叶总生物碱；

4）将上述荷叶中生物碱用中低压制备型液相色谱进行分离，以0.1-0.2%三乙胺的水溶液和乙腈作为洗脱剂，依次进行梯度洗脱，分瓶收集洗脱液，静置析晶并过滤干燥后，经鉴定，共得到如下具体8种生物碱：荷叶碱、去氢荷叶碱、莲碱、去氢莲碱、亚美罂粟碱、巴婆碱、O-去甲基荷叶碱、N-去甲基荷叶碱；

5）将上述步骤2）中得到的乙酸乙酯部分减压浓缩至干，用蒸馏水溶解，将所得水溶液上大孔吸附树脂，用10倍柱体积的去离子水洗脱，再依次用水、50-75%乙醇洗脱，分别洗至无色，收集乙醇洗脱液，浓缩干燥即荷叶总黄酮；

6）将步骤5）得到的荷叶总黄酮上Sephadex LH-20 柱色谱，以二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，经TCL检测合并相同组分，上述各组分再经半制备型HPLC，乙腈-水为洗脱剂，最终分离得到如下3种黄酮化合物：槲皮素、木犀草素、3-甲氧基槲皮素，其中3-甲氧基槲皮素为首次从荷叶中分离得到；

7）将上述步骤2）中得到的正丁醇部分减压浓缩至干，用蒸馏水溶解，将所得水溶液上聚酰胺柱层析，以乙醇-水进行梯度洗脱，每个梯度洗3-5倍柱体积，收集30%-50%乙醇洗脱液，浓缩干燥即荷叶总多酚；

8）上述步骤7）所得的荷叶总多酚上半制备型HPLC，以甲醇-水作为流动相，流速为1ml/min，收集不同时间的流出物，最终分离得到如下4中多酚物质：儿茶素、表儿茶素、Nympholide A2和Nympholide B3。

上述步骤1）中提取溶剂的用量为药材质量：溶液体积为1Kg: 10-40L；超声波功率为350W；

步骤3）中超滤和纳滤的温度均控制在40-60℃、压力均控制在0.6-2.2MPa；

步骤5）中大孔吸附树脂为AB-8大孔树脂，上样浓度为20mg /mL，上样体积20mL，径高比为1:30，乙醇浓度为70%。

本发明还提供了上述步骤3）所得的荷叶总生物碱在制备降脂减肥药品、食品或化妆品中的应用。

本发明还提供了上述步骤5）所得的荷叶总黄酮在制备化妆品中的应用。

本发明还提供了上述步骤7）所得的荷叶总多酚在制备化妆品中的应用。

与现有技术相比，本发明的优点是：

本发明提供了一种从荷叶中联产多种活性物质的方法，该包括以下步骤：提取、萃取得各活性物质部分，再分别对各部分进行分离纯化，最终得到了8种生物碱单体、3种黄酮单体以及4种多酚单体，且本申请制备得到的荷叶总生物碱、荷叶总黄酮以及荷叶总多酚均可直接应用于不同的领域。其中对于荷叶总生物碱的分离提取，本发明采用膜分离技术并联合中低压制备型液相色谱进行分离，快速高效地获得了多种生物碱单体；对于荷叶总黄酮的分离纯化，本发明以大孔吸附树脂、Sephadex LH-20 柱色谱以及半制备型HPLC联合使用，高效分离得到了3种黄酮单体，其中3-甲氧基槲皮素为首次从荷叶中分离得到；对于荷叶总多酚的分离纯化，本申请以聚酰胺柱层析联合半制备型HPLC，同样高效地分离得到了4种多酚单体。上述单体化合物的获得，为进一步开发荷叶可利用价值提供了重要保障。

本发明所提供的一种从荷叶中联产多种活性物质的方法，优化提取分离步骤，降低生产成本，依据该方法所得的活性单体含量大于95%，有效成分回收率大于70%。

具体实施方式

实施例1：

从荷叶中联产多种生物活性物质的方法包括以下步骤：

1）将荷叶25kg清洗烘干后，粉碎过80目筛，以体积分数为75%的乙醇，超声波辅助加热提取3次，提取温度为65℃，每次提取时间为1.5小时，提取溶剂的用量为药材质量：溶液体积为1Kg: 20L；超声波功率为350W，合并提取液，提取液经真空抽滤去除滤渣，减压浓缩得浸膏；

2）将步骤1）得到的浸膏用水分散后，依次以石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，所得氯仿部分、乙酸乙酯部分和正丁醇部分供进一步分离；

3）将上述步骤2）中得到的氯仿部分经超滤膜设备，温度控制在40-60℃、压力控制在0.6-2.2MPa，所得过滤液再经纳滤膜设备，温度控制在40-60℃、压力控制在0.6-2.2MPa，所得滤液减压浓缩后，经冷冻干燥或喷雾干燥得荷叶总生物碱；

4）将上述荷叶中生物碱用中低压制备型液相色谱进行分离，以0.1三乙胺的水溶液和乙腈作为洗脱剂，依次进行梯度洗脱，分瓶收集洗脱液，静置析晶并过滤干燥后，经鉴定，共得到如下具体8种生物碱：荷叶碱、去氢荷叶碱、莲碱、去氢莲碱、亚美罂粟碱、巴婆碱、O-去甲基荷叶碱、N-去甲基荷叶碱，上述化合物纯度均大于98%；

5）将上述步骤2）中得到的乙酸乙酯部分减压浓缩至干，用蒸馏水溶解，将所得水溶液上AB-8大孔吸附树脂，上样浓度为20mg /mL，上样体积20mL，径高比为1:30，用10倍柱体积的去离子水洗脱，再依次用水、70%乙醇洗脱，分别洗至无色，收集乙醇洗脱液，浓缩干燥即荷叶总黄酮；

6）将步骤5）得到的荷叶总黄酮上Sephadex LH-20 柱色谱，以二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，经TCL检测合并相同组分，上述各组分再经半制备型HPLC，乙腈-水为洗脱剂，最终分离得到如下3种黄酮化合物：槲皮素、木犀草素、3-甲氧基槲皮素，其中3-甲氧基槲皮素为首次从荷叶中分离得到，上述化合物纯度均大于95%；

7）将上述步骤2）中得到的正丁醇部分减压浓缩至干，用蒸馏水溶解，将所得水溶液上聚酰胺柱层析，以乙醇-水进行梯度洗脱，每个梯度洗3-5倍柱体积，收集30%-50%乙醇洗脱液，浓缩干燥即荷叶总多酚；

8）上述步骤7）所得的荷叶总多酚上半制备型HPLC，以甲醇-水作为流动相，流速为1ml/min，收集不同时间的流出物，最终分离得到如下4中多酚物质：儿茶素、表儿茶素、Nympholide A2和Nympholide B3，上述化合物纯度均大于95%。

实施例2：

从荷叶中联产多种生物活性物质的方法包括以下步骤：

1）将荷叶50kg清洗烘干后，粉碎过80目筛，以体积分数为65%的甲醇，超声波辅助加热提取2次，提取温度为70℃，每次提取时间为2小时，提取溶剂的用量为药材质量：溶液体积为1Kg: 10L；超声波功率为350W，合并提取液，提取液经真空抽滤去除滤渣，减压浓缩得浸膏；

2）将步骤1）得到的浸膏用水分散后，依次以石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，所得氯仿部分、乙酸乙酯部分和正丁醇部分供进一步分离；

3）将上述步骤2）中得到的氯仿部分经超滤膜设备，温度控制在60℃、压力控制在1.5MPa，所得过滤液再经纳滤膜设备，温度控制在60℃、压力控制在2.0MPa，所得滤液减压浓缩后，经冷冻干燥或喷雾干燥得荷叶总生物碱；

4）将上述荷叶中生物碱用中低压制备型液相色谱进行分离，以0.2三乙胺的水溶液和乙腈作为洗脱剂，依次进行梯度洗脱，分瓶收集洗脱液，静置析晶并过滤干燥后，经鉴定，共得到如下具体8种生物碱：荷叶碱、去氢荷叶碱、莲碱、去氢莲碱、亚美罂粟碱、巴婆碱、O-去甲基荷叶碱、N-去甲基荷叶碱，上述化合物纯度均大于98%；

5）将上述步骤2）中得到的乙酸乙酯部分减压浓缩至干，用蒸馏水溶解，将所得水溶液上AB-8大孔吸附树脂，上样浓度为20mg /mL，上样体积20mL，径高比为1:30，用10倍柱体积的去离子水洗脱，再依次用水、70%乙醇洗脱，分别洗至无色，收集乙醇洗脱液，浓缩干燥即荷叶总黄酮；

6）将步骤5）得到的荷叶总黄酮上Sephadex LH-20 柱色谱，以二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，经TCL检测合并相同组分，上述各组分再经半制备型HPLC，乙腈-水为洗脱剂，最终分离得到如下3种黄酮化合物：槲皮素、木犀草素、3-甲氧基槲皮素，其中3-甲氧基槲皮素为首次从荷叶中分离得到，上述化合物纯度均大于95%；

7）将上述步骤2）中得到的正丁醇部分减压浓缩至干，用蒸馏水溶解，将所得水溶液上聚酰胺柱层析，以乙醇-水进行梯度洗脱，每个梯度洗3-5倍柱体积，收集30%-50%乙醇洗脱液，浓缩干燥即荷叶总多酚；

8）上述步骤7）所得的荷叶总多酚上半制备型HPLC，以甲醇-水作为流动相，流速为1ml/min，收集不同时间的流出物，最终分离得到如下4中多酚物质：儿茶素、表儿茶素、Nympholide A2和Nympholide B3，上述化合物纯度均大于95%。

实施例3：

从荷叶中联产多种生物活性物质的方法包括以下步骤：

1）将荷叶100kg清洗烘干后，粉碎过80目筛，以体积分数为90%的乙醇，超声波辅助加热提取3次，提取温度为85℃，每次提取时间为1小时，提取溶剂的用量为药材质量：溶液体积为1Kg: 40L；超声波功率为350W，合并提取液，提取液经真空抽滤去除滤渣，减压浓缩得浸膏；

2）将步骤1）得到的浸膏用水分散后，依次以石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，所得氯仿部分、乙酸乙酯部分和正丁醇部分供进一步分离；

3）将上述步骤2）中得到的氯仿部分经超滤膜设备，温度控制在40-60℃、压力控制在0.6-2.2MPa，所得过滤液再经纳滤膜设备，温度控制在40-60℃、压力控制在0.6-2.2MPa，所得滤液减压浓缩后，经冷冻干燥或喷雾干燥得荷叶总生物碱；

4）将上述荷叶中生物碱用中低压制备型液相色谱进行分离，以0.1三乙胺的水溶液和乙腈作为洗脱剂，依次进行梯度洗脱，分瓶收集洗脱液，静置析晶并过滤干燥后，经鉴定，共得到如下具体8种生物碱：荷叶碱、去氢荷叶碱、莲碱、去氢莲碱、亚美罂粟碱、巴婆碱、O-去甲基荷叶碱、N-去甲基荷叶碱，上述化合物纯度均大于98%；

5）将上述步骤2）中得到的乙酸乙酯部分减压浓缩至干，用蒸馏水溶解，将所得水溶液上AB-8大孔吸附树脂，上样浓度为20mg /mL，上样体积20mL，径高比为1:30，用10倍柱体积的去离子水洗脱，再依次用水、70%乙醇洗脱，分别洗至无色，收集乙醇洗脱液，浓缩干燥即荷叶总黄酮；

6）将步骤5）得到的荷叶总黄酮上Sephadex LH-20 柱色谱，以二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，经TCL检测合并相同组分，上述各组分再经半制备型HPLC，乙腈-水为洗脱剂，最终分离得到如下3种黄酮化合物：槲皮素、木犀草素、3-甲氧基槲皮素，其中3-甲氧基槲皮素为首次从荷叶中分离得到，上述化合物纯度均大于95%；

7）将上述步骤2）中得到的正丁醇部分减压浓缩至干，用蒸馏水溶解，将所得水溶液上聚酰胺柱层析，以乙醇-水进行梯度洗脱，每个梯度洗3-5倍柱体积，收集30%-50%乙醇洗脱液，浓缩干燥即荷叶总多酚；

8）上述步骤7）所得的荷叶总多酚上半制备型HPLC，以甲醇-水作为流动相，流速为1ml/min，收集不同时间的流出物，最终分离得到如下4中多酚物质：儿茶素、表儿茶素、Nympholide A2和Nympholide B3，上述化合物纯度均大于95%。