一种Fucoidan/碳酸钙杂化纳米棒及其制备方法
阅读说明：本技术 一种Fucoidan/碳酸钙杂化纳米棒及其制备方法 (Fucoidan/calcium carbonate hybrid nanorod and preparation method thereof ) 是由 刘源岗 王士斌 王沛 仝彩玲 周丽芳 于 2021-10-22 设计创作，主要内容包括：本发明涉及生物材料领域,公开了一种Fucoidan/碳酸钙杂化纳米棒及其制备方法与应用。本发明所述Fucoidan/碳酸钙杂化纳米棒通过沉淀法合成,以碳酸钠和氯化钙为原料,Fucoidan作为有机调控剂；通过控制Fucoidan的浓度来调控合成碳酸钙杂化纳米棒的粒径大小。沉淀法法工艺简单,操作方便,不需要使用复杂的仪器设备,所合成的Fucoidan/碳酸钙杂化纳米棒生物相容性良好和具有pH响应药物释放的特性。药物静电作用和扩散作用负载在纳米棒上,减缓药物的释放速率,提高了稳定性与长效性。(The invention relates to the field of biological materials, and discloses a Fucoidan/calcium carbonate hybrid nanorod as well as a preparation method and application thereof. The Fucoidan/calcium carbonate hybrid nanorod is synthesized by a precipitation method, sodium carbonate and calcium chloride are used as raw materials, and Fucoidan is used as an organic regulating agent; the particle size of the synthesized calcium carbonate hybrid nanorod is regulated and controlled by controlling the concentration of Fucoidan. The precipitation method has simple process and convenient operation, does not need complex instruments and equipment, and the synthesized Fucoidan/calcium carbonate hybrid nanorod has good biocompatibility and the characteristic of pH response drug release. The electrostatic action and the diffusion action of the drug are loaded on the nano-rod, so that the release rate of the drug is slowed, and the stability and the long-acting property are improved.)
技术领域
本发明涉及生物材料领域，具体的说是涉及一种岩藻聚糖/碳酸钙杂化纳米棒及其制备方法。
背景技术
碳酸钙(CaCO3)在涂料、橡胶、塑料、农业、医学、药学等多个领域有着广泛而重要的用途。具有在一定pH值下可降解、生物相容性好、化学成分简单、成本低、易于规模化生产等内在优点，具有广阔的生物医学应用前景。近年来发展了几种合成CaCO3纳米粒的方法，包括火焰法、声化学法、反向胶束体系中石灰溶液碳化法、仿生法、聚丙烯酸稳定法和微孔分散法。由于基于沉淀的工艺简单、收率高、适用性强而成为应用最广泛的技术。文献报道主要有两种沉淀策略。第一种策略是将氢氧化钙水溶液与二氧化碳气泡形成CaCO3。替代策略是采用碳酸钠和氯化钙或硝酸钙的化学组合来合成CaCO3。
岩藻多糖(Fucoidan)是一种天然多糖，由于其生物相容性好、易于生物活性分子包封、免疫原性较低等优点，成为生物医学应用的一个有趣的候选者。此外，它还具有诱导肿瘤细胞凋亡的能力。Fucoidan的抗癌作用因其结构的不同而不同，但它也可以靶向多种细胞类型的多个受体或信号分子，如p-选择素，包括肿瘤细胞和免疫细胞，显示其在体内预防或治疗癌症的能力。近年来，人们对岩藻糖脂的临床转化越来越感兴趣。一些研究小组对岩藻糖苷进行了观察性研究，用于临床试验。本发明利用Fucoidan作为有机调控模板于室温条件下制备碳酸钙纳米棒，该实验方法简单，条件温和可控，重复性好，生产成本低。
发明内容
针对当前碳酸钙纳米棒合成面临着反应强烈、操作复杂，以及碳酸钙生物活性低等问题，本发明的目的在于提供一种Fucoidan/碳酸钙杂化纳米棒。
为此，本发明所采用的技术方案是：
一种Fucoidan/碳酸钙杂化纳米棒，所述纳米棒通过沉淀法而形成。
所述的Fucoidan/碳酸钙杂化纳米棒长径为500～1200nm，短径为100～500nm；所述的Fucoidan/碳酸钙杂化纳米棒由Fucoidan作为有机物而形成的纳米棒。
一种Fucoidan/碳酸钙杂化纳米棒及其制备方法与应用，包括如下步骤：
将碳酸钠和氯化钙分别溶于超纯水中，并在氯化钙溶液中加入Fucoidan作为调控剂搅拌0.5～1h，然后将碳酸钠溶液逐滴加入到搅拌的氯化钙溶液中，通过沉淀法生成Fucoidan/碳酸钙杂化纳米棒，搅拌6～8h后离心分离，水洗2～3次除杂，得到产品Fucoidan/碳酸钙杂化纳米棒。
通过上述技术方案，本发明的有益技术效果包括：
根据本发明制备的Fucoidan/碳酸钙杂化纳米棒，长短径比可控，生物相容性良好。
附图说明
图1放大倍数10k下Fucoidan/碳酸钙纳米棒的扫描电镜图
图2放大倍数30k下Fucoidan/碳酸钙纳米棒的扫描电镜图
图3 Fucoidan/碳酸钙纳米棒负载MTO在pH7.4和5.5磷酸盐缓冲溶液中的体外释放曲线
图4 Fucoidan/碳酸钙纳米棒在不同浓度的溶血率
图5 L929细胞与Fucoidan/碳酸钙纳米棒共培养24h后的细胞存活率
图6 L929细胞与Fucoidan/碳酸钙纳米棒共培养48h后的细胞存活率
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，所描述的实施例只是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
实施例1：Fucoidan/碳酸钙杂化纳米棒的制备
称取2g的Fucoidan，置于50mL离心管中，用量筒量取40mL的超纯水，倒入离心管，超声溶解后，用0.22μm滤膜过滤，得到50mg/mL的Fucoidan溶液。然后用超纯水配制0.02mol/L的CaCl2溶液和Na2CO3溶液。分别吸取10、8、6、4、2、1、0.6、0.4、0.2、0mL的50mg/mLFucoidan溶液，加到8个含有CaCl2溶液的烧杯中，再加入0、2、4、6、8、9、9.4、9.6、9.8、10mL的超纯水，搅拌0.5～1h。取10mL Na2CO3溶液加入到已搅拌半小时的CaCl2和Fucoidan的混合溶液中，此时搅拌速度调到1400rpm以上，用保鲜膜封住烧杯口。待搅拌24小时后，离心5min并水洗2～3次。
实施例2：Fucoidan/碳酸钙杂化纳米棒的结构
根据本实施例1产物的扫描电镜图(图1、2)，可以看出Fucoidan/碳酸钙杂化纳米棒为均匀的棒状结构，对纳米棒的尺寸分布进行统计可知长径约为570nm，短径约为120nm。
实施例3：药物的负载与释放
本实验药物模型为米托蒽醌(Mitoxantrone hydrochloride，MTO)，以下为实验步骤：称取2mg的碳酸钙纳米棒置于25mL的烧杯中，用移液枪吸取5mL的PBS加入到烧杯中，先使用超声机超声分散，然后放在搅拌器上搅拌，调整转速为800rpm；称取4mg的MTO，加入20mL的PBS，超声使其溶解，然后加入到碳酸钙溶液中，用锡箔纸把烧杯包裹住，使其避光，磁力搅拌一夜；离心并用PBS水洗2～3次，得到。测定上清液的吸光度，根据标准曲线计算出浓度，同时计算出载药量和包封率分别为43.7％和34.5％。在pH为7.4和5.5的磷酸盐缓冲液进行释药考察，温度为37℃。在1h、2h、4h、6h、9h、12h、24h、36h、2d、3d、5d，分别取出1mL的上清液在660nm波长测定吸光度，并加入新的对应pH的磷酸盐缓冲液，测得MTO的释放速率明显受pH的影响。结果表明：此碳酸钙纳米棒对药物释放具有pH响应性。
实施例4：Fucoidan/碳酸钙杂化纳米棒的生物相容性研究
(1)溶血试验
使用取血针从兔子耳后静脉抽取1mL，置于肝素抗凝管中。取0.8mL新鲜抗凝兔血加入1mL生理盐水中制成母液。用生理盐水配制不同浓度的碳酸钙纳米棒混悬液，浓度设置为10、20、50、100、200μg/mL。阴性对照组为生理盐水，阳性对照组为超纯水。取以上五组溶液5mL于10mL离心管中，在37℃水浴30min。再分别向各组中加入0.1mL抗凝兔血母液，混合均匀后重新置于37℃水浴60min。再将其取出在2500rpm离心5min，取其上清液在最大吸收峰波长下测量吸光度，并记录数据。结果表明：浓度区间在0～200μg/mL之间，Fucoidan/碳酸钙纳米棒的溶血率均低于5％，合格。
(2)细胞毒性
将对数生长期的L929细胞接种于96孔细胞培养板没孔100μL，其密度为6×104个/ml，置于CO2培养箱中培养12h。再加入不同浓度Fucoidan/碳酸钙纳米棒溶液，浓度分别为10、20、50、100、200μg/mL。并且设置空白组和阴性对照组，每组设置6个平行复孔。培养24h和48h后，从培养板中弃去旧的培养基，并用新鲜的PBS冲洗2遍。再向每个孔内加入MTT试剂10μL、新鲜培养基100μL，放入培养箱中孵育3h。然后取出96孔板吸弃MTT试剂和培养基，加入150μL DMSO溶液用，适当振荡促进结晶溶解。用酶标仪在570nm波长下检测其吸光度，根据公式计算细胞存活率。结果表明：细胞存活率均超过90％，根据国标GB/T16886对材料的细胞毒性进行评定，Fucoidan/碳酸钙纳米棒的毒性等级为1，视为合格。
以上仅为本发明的优选实施方式，而不是对其保护范围的限制，本领域技术人员在本发明的原理下所做的任何不具有创造性的改进，均应认为在本发明的保护范围内。
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