一种止血原料三七素的制备方法
阅读说明：本技术 一种止血原料三七素的制备方法 (Preparation method of hemostatic raw material sanchinin ) 是由 孙秋 唐天鹏 丁瑞 赵平舟 于 2021-09-13 设计创作，主要内容包括：本发明属于医药生物技术领域,公开一种止血原料三七素的制备方法,包括如下步骤：将漆酶溶液在常温下加入到弱酸性溶液中,搅拌状态下加入色氨酸和苯酚反应2～4h,再加入含草酸单甲酯的甲醇溶液,在高氧溶液条件下反应6-9h,处理后得到粗品三七素,将粗品三七素重结晶得到纯品三七素。本发明采用色氨酸和苯酚作为反应原料,在漆酶的作用下反应得到二氨基丙酸,与草酸单甲酯的甲醇溶液进行反应得到三七素,整个反应过程中操作简单,且不会使用强碱催化剂即可得到80%以上纯度的三七素,同时本发明的制备方法反应条件温和,反应时间短,大大提高了生产效率,节省了生产成本,利于工业化生产。(The invention belongs to the technical field of medical biology, and discloses a preparation method of a hemostatic raw material sanchinin, which comprises the following steps: adding a laccase solution into a weakly acidic solution at normal temperature, adding tryptophan and phenol to react for 2-4h under a stirring state, adding a methanol solution containing monomethyl oxalate, reacting for 6-9h under a high-oxygen solution condition, treating to obtain a crude dencichine product, and recrystallizing the crude dencichine product to obtain a pure dencichine product. The preparation method adopts tryptophan and phenol as reaction raw materials, the reaction is carried out under the action of laccase to obtain diaminopropionic acid, and the diaminopropionic acid reacts with a methanol solution of monomethyl oxalate to obtain dencichine, the operation in the whole reaction process is simple, and no strong base catalyst is used to obtain the dencichine with the purity of more than 80%.)
技术领域
本发明属于医药生物技术领域，涉及一种止血原料三七素的制备方法。
背景技术
三七又名田七，是我国珍贵的药材，具有散瘀止血、消肿止痛的功效，用于咯血，吐血，衄血，便血，崩漏，外伤出血，胸腹刺痛，跌扑肿痛。三七中含有的主要单体止血活性物质为三七素。三七素又称为田七氨酸，是三七中的一种非蛋白游离氨基酸，具有止血活性成分，通过增加体内血小板数量止血，并缩短凝血和出血的时间，被广泛用于外伤出血治疗等，是云南白药等多种传统药方的有效成分。
目前三七素的合成有多种方法，其中Rao等人是以D-天冬氨酸为起始原料，合成D-α,β-二氨基丙酸时使用30%发烟硫酸，叠氮化钠，环境污染较大，叠氮化钠目前来源受限，且产率较低，不适合工业生产。CN105061247公开了一种三七素的合成改进方法，使用碘苯二乙酸为原料进行霍夫曼降解得到N-α-Boc-L-α,β-二氨基丙酸，在1,4-二氧六环中与草酰氯缩合后淬灭后得到三七素，碘苯二乙酸价格较贵并且由于N-α-Boc-L-α,β-二氨基丙酸在有机溶剂中溶解度较差，反应时会出现反应不完全，搅拌困难等缺点，且草酰氯有极大刺激性气味，易挥发变质，且反应活性很高，易产生副产物，反应后淬灭时会大量放热和放出氯化氢，污染较大，不利于放大生产；CN1122659C公开了高效止血药三七素的合成制备方法，需要将L-天冬素与苯磺基卤化物进行反应等复杂操作过程，且又用到强碱作为催化剂，安全没有保障，也极易造成环境污染。
发明内容
本发明要解决的技术问题是针对现有三七素合成方法存在成本高、反应复杂、易造成环境污染等缺陷，提供一种止血原料三七素的制备方法，本发明制备方法通过生物酶作用来获得合成三七素的有效途径，工艺简单，成本低廉，操作安全，环境兼容性好，可实行工业化生产。
为了解决上述技术问题，本发明的技术方案为：
一种止血原料三七素的制备方法，包括如下步骤：将漆酶溶液在常温下加入到弱酸性溶液中，搅拌状态下加入色氨酸和苯酚反应2-4h，再加入含草酸单甲酯的甲醇溶液，在高氧溶液条件下反应6-9h，处理后得到粗品三七素，将粗品三七素重结晶得到纯品三七素。
本发明反应机理如下：
；
优选的，所述漆酶溶液的初始活力值为0.5u/ml。
优选的，所述弱酸性溶液是pH为4-7的有机酸溶液。
优选的，所述色氨酸为L型结构色氨酸。
优选的，所述甲醇溶液的体积百分浓度为40-80%。
优选的，所述苯酚浓度为0-100mg/L。
优选的，所述高氧溶液是溶液中通入的氧压力大于3Mpa。
与现有技术相比本发明的有益效果是：
本发明采用色氨酸和苯酚作为反应原料，在漆酶的作用下反应得到二氨基丙酸，与草酸单甲酯的甲醇溶液进行反应得到三七素，整个反应过程中操作简单，且不会使用强碱催化剂即可得到80%以上纯度的三七素，同时本发明的制备方法反应条件温和，反应时间短，大大提高了生产效率，节省了生产成本，利于工业化生产。
本发明制备方法工艺简单，成本低廉，操作安全，环境兼容性好，可实行工业化生产。
附图说明
图1为本发明中测定三七素的HPLC标准曲线；
图2为本发明中三七素标准品的HPLC图；
图3为本发明中三七素样品的HPLC图。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
实施例1
取0.0125g的柠檬酸溶于100mL的水中，加入2mg的漆酶（酶活≥0.5u/mg，上海源叶生物科技有限公司提供），边搅拌边缓慢加入1mg苯酚和100g色氨酸，反应2h，然后加入含30g草酸单甲酯的50%的甲醇100mL，通入医用氧气，保持压力5Mpa，反应8h。溶液静置后有固体析出，用50%丙酮溶液洗涤、干燥，得到粗品三七素，再将其溶解于100mL蒸馏水中，用稀盐酸调节pH值为2，得白色沉淀，50%丙酮溶液洗涤、干燥，得到15g三七素。
实施例2
取0.00625g的柠檬酸溶于100mL的水中，加入2mg的漆酶（酶活≥0.5u/mg，上海源叶生物科技有限公司提供），边搅拌边缓慢加入2mg苯酚和120g色氨酸，反应4h，然后加入含50g草酸单甲酯的70%的甲醇80mL，通入医用氧气，保持压力4Mpa，反应9h。溶液静置后有固体析出，用50%丙酮溶液洗涤、干燥，得到粗品三七素，再将其溶解于100mL蒸馏水中，用稀盐酸调节pH值为2，得白色沉淀，50%丙酮溶液洗涤、干燥，得到25g三七素。
实施例3
取0.01875g的柠檬酸溶于100mL的水中，加入2mg的漆酶（酶活≥0.5u/mg，上海源叶生物科技有限公司提供），边搅拌边缓慢加入3mg苯酚和90g色氨酸，反应3h，然后加入含40g草酸单甲酯的80%的甲醇100mL，通入医用氧气，保持压力6Mpa，反应6h。溶液静置后有固体析出，用50%丙酮溶液洗涤、干燥，得到粗品三七素，再将其溶解于100mL蒸馏水中，用稀盐酸调节pH值为2，得白色沉淀，50%丙酮溶液洗涤、干燥，得到20g三七素。
三七素含量的测定
色谱条件：色谱柱：H ypersil ODS2 ( 250 mm x4. 6 mm，5µm )；流动相：甲醇-水( 70 : 30 )； 流速1. 0 mL /min；检测波长：214 nm，进样量为 5µL。
标准品溶液制备：取三七素标准品 25.02 mg，用50%乙醇/水溶液溶解，定容至25ml，用0.22µm滤膜过滤后进样检验。标准品中三七素的浓度为1.001 mg/ml。
测试样品制备：取三七素标准品18.50 mg，用50%乙醇/水溶液溶解，定容至25ml，用0.22µm滤膜过滤后进样检验。测试样品中三七素的浓度为0.633mg/ml。
标准曲线的制备：精密吸取上述对照品溶液适量至10 mL棕色量瓶中, 加纯净水稀释至刻度， 配制成浓度分别为 2、5、10、20、40 µg/mL的系列对照品溶液，摇匀，分别吸取5 µL依次进样，按上述色谱条件测定三七素峰面积值，以峰面积积分值 ( Y) 对对照品浓度 ( X) 进行线性回归，得回归方程：Y=3.8162 x 103X + 4.4362 x 103，r= 0. 9999。结果表明，三七素对照品浓度在 2-40 µg/mL的范围内与峰面积值呈良好的线性关系。
精密度试验：精密吸取同一对照品溶液，连续进样5次，每次5 µL，测得三七素峰面积的 RSD为 1.02% ( n=5)，表明精密度良好。
稳定性试验：精密吸取同一对照品溶液，分别在 0、2、4、6、8 h进样测定，结果三七素峰面积的 RSD为 0.98%，供试品溶液在 8 h内峰面积基本稳定。
含量测定：取测试样品溶液5µL，测试样品的HPLC图（图3），计算峰面积，然后对应标准曲线，计算三七素的百分含量：0.663mg/ml*25ml/18.50mg*99.8%*100%=85.37%。
以上为本发明较佳实施例，只适用于帮助理解本发明实施例的原理；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本实施例，在具体实施方式以及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
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