黑松露抗氧化多肽及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 黑松露抗氧化多肽及其制备方法和应用 (Black truffle antioxidant polypeptide and preparation method and application thereof ) 是由 何阳 于 2021-08-16 设计创作，主要内容包括：本发明提供了黑松露抗氧化多肽,其包括多肽LC10和NC10中的一种或两种,其中,LC10由SEQ ID No.1的氨基酸序列组成；NC10由SEQ IDNo.2的氨基酸序列组成。其抗氧化性能好,溶解性较好,稳定性高,生产成本低,能够在抗氧化药品和化妆品中得到应用。(The invention provides an anti-oxidation polypeptide of truffle, which comprises one or two of polypeptides LC10 and NC10, wherein LC10 consists of an amino acid sequence of SEQ ID No. 1; NC10 consists of the amino acid sequence of SEQ ID No. 2. The antioxidant has good oxidation resistance, good solubility, high stability and low production cost, and can be applied to antioxidant medicines and cosmetics.)
技术领域
本发明涉及多肽及其应用技术领域，具体而言，涉及黑松露抗氧化多肽及其制备方法和应用。
背景技术
人体内时刻都在发生氧化-还原反应，有氧呼吸过程中大约5％的氧会转化成活性氧和自由基，细胞在新陈代谢过程中也会产生一系列的活性氧，随着生活环境的变化以及人们生活方式的改变，除呼吸外，人们接触到外界污染、放射线照射等因素也使得人体内产生大量活性氧自由基(ROS)，ROS的过量产生会造成氧化损伤，进而会导致肿瘤，心血管疾病和糖尿病等疾病的发生。
抗氧化剂广泛应用于食品添加剂、保健药品、化妆品和治疗心脑血管疾病和抗癌药物中。但是，人工合成的抗氧化合成物大多具有以下缺点：(1)溶解性不好；(2)人体吸收性差，可能存在排异等问题；(3)生物活性不稳定；(4)生产成本较高。
随着人们对化学合成物安全性的担忧日益加重，天然抗氧化物的使用也在逐年增加。近年来，抗氧化多肽因其分子量小，易吸收，安全等优点受到广泛的关注。抗氧化多肽广泛存在于水果和蔬菜等天然植物中，具有显著的抗氧化，抗衰老功能。由于其安全且易被人体吸收，常被用作食品的原辅料直接添加到食品中，可以有效延缓食物的氧化变质，并作为重要原料添加到化妆品和药品中，抑制人体氧化反应造成的疾病的产生和减缓衰老的发生。
松露是目前世界上最贵的食用菌菇之一，具有很好的经济价值。黑松露(Tubermelanosporum)在中国每年产量300吨左右，法国产量30吨左右，中国黑松露占全世界黑松露的80％以上，云南是中国黑松露主产区占全国60％以上。除风味独特外，松露还具有良好的营养价值和生物活性。松露富含蛋白质、维生素、矿物质等元素，含有8种人体必需氨基酸，是优质蛋白质良好的植物来源。研究表明，松露具有抗氧化性、抗肿瘤、抗炎、保肝护肝等多种生理活性，是一种含有多种抗氧化物质的健康食材。例如，松露中的PST-W多糖对DPPH具有清除作用，对过氧化氢诱导的PC12细胞损伤也有良好的抑制力。
因此，本领域需要设计出具有较高抗氧化活性，且稳定性高的黑松露抗氧化多肽。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供黑松露抗氧化多肽，其抗氧化性能好，溶解性较好，稳定性高；
本发明的第二个目的在于提供黑松露抗氧化多肽的制备方法，其制备成本低，制备得到的多肽具有上述优点；
本发明的第三个目的在于提供云南黑松露抗氧化多肽在多个领域的应用。
本发明通过以下技术方案实现：
云南黑松露抗氧化多肽，其包括多肽LC10和NC10中的一种或两种，
其中，LC10由Phe-Met-Pro-Met-Ala-Trp-Thr-Phe-Met-Cys-Pro-Thr-Met(SEQ IDNo.1)的氨基酸序列组成；
NC10由Ala-Ser-Glu-Thr-Ser-Gln-Cys-Thr-Asp-Ala-Val-Ser(SEQ ID No.2)的氨基酸序列组成。
LC10和NC10的分子量分别为1593.96Da和1198.16Da；等电点分别为5.52和3.67。
云南黑松露抗氧化多肽的制备方法，包括以下制备步骤：
按照上述多肽LC10或NC10的氨基酸序列合成多肽，对多肽进行纯化。
进一步地，对多肽进行纯化后还包括测定纯化后的多肽的分子量，测定多肽的等电点以及序列。
进一步地，其中合成多肽的方法为固相合成法或者重组表达的方法。
上述抗氧化多肽或上述制备方法得到的产品在ABTS自由基清除的药品或者化妆品中的运用。
上述抗氧化多肽或上述制备方法得到的产品在DPPH自由基清除的药品或者化妆品中的运用。
上述抗氧化多肽或上述制备方法得到的产品在羟基自由基清除的药品或者化妆品中的运用。
上述抗氧化多肽或上述制备方法得到的产品在提升还原力的药品或者化妆品中的运用。
上述抗氧化多肽或上述制备方法得到的产品在抗氧化、清除自由基或美白护肤品中运用。
本发明提供的抗氧化多肽，以单独多肽LC10或NC10为原料，或者通过LC10或NC10的组合，添加化妆品辅料及其他原料的方式来生产产品。该方式使用常用的辅助剂有：多元醇、甘油、羊毛脂、矿物油、植物油等。与该方式使用常用的其他化妆品原料组合有：熊果苷、曲酸及其衍生物、维生素及其衍生物、甘草黄酮以及其他蛋白、其他多肽、植物提取物、细胞因子、维生素等。可以选择一种或多种辅料和其他化妆品原料药进行组合。
重组载体，包含编码上述抗氧化多肽的核苷酸序列。
本发明的技术方案至少具有如下优点和有益效果：
(1)本发明提供的黑松露抗氧化多肽，基于天然产物的活性，进行创造性地提炼和设计，获得溶解性较好，活性高，稳定性高的新型抗氧化多肽，将LC10和NC10这两种多肽单独或者组合运用均可达到抗氧化的效果；
(2)本发明提供的黑松露抗氧化多肽，肽链较短，生产成本较低；
(3)本发明提供的黑松露抗氧化多肽的制备方法，步骤简单，制备得到的抗氧化多肽具有上述优点。
附图说明
图1为多肽LC10对ABTS自由基清除的测定；
图2为多肽NC10对ABTS自由基清除的测定；
图3为多肽LC10对DPPH自由基清除的测定；
图4为多肽NC10对DPPH自由基清除的测定；
图5为多肽LC10对羟基自由基清除的测定；
图6为多肽NC10对羟基自由基清除的测定；
图7为多肽LC10对ROS影响的测定；
图8为多肽NC10对ROS影响的测定。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
1、根据设计的氨基酸序列：LC10：Phe-Met-Pro-Met-Ala-Trp-Thr-Phe-Met-Cys-Pro-Thr-Met(FMPMAWTFMCPTM)和NC10：Ala-Ser-Glu-Thr-Ser-Gln-Cys-Thr-Asp-Ala-Val-Ser(ASETSQCTDAVS)，分别用固相合成法合成得到粗多肽；
2、将粗多肽通过HPLC反相柱层析脱盐纯化，鉴定其纯度，直到多肽的纯度不低于95％；
HPLC纯化及鉴定方法：将0.1mg待测样品溶于1mL含有0.1％三氟醋酸的超纯水中，若有不溶解的杂质，用0.45μm滤膜过滤，流动相A为0.1％三氟醋酸-水，流动相B为0.1％三氟醋酸-乙腈，待基线平稳后开始上样，上样量为50μL；色谱柱为硅胶烷基键合相C18柱(4.6mm×300mm，胶粒大小5μm，孔径大小为100A)，采用二元流动相梯度洗脱系统，进行梯度洗脱，即在30min内，流动相B在洗脱剂中的含量从0％-80％按线性关系增长，流速1mL/min，检测波长215nmol/L，25℃下测定。
3、通过等电聚焦电泳测定纯化后的LC10和NC10多肽的等电点分别为5.52和3.67。并采用自动氨基酸测序仪测定纯化后多肽的氨基酸序列结构，确定分别为LC10：Phe-Met-Pro-Met-Ala-Trp-Thr-Phe-Met-Cys-Pro-Thr-Met(FMPMAWTFMCPTM)和NC10：Ala-Ser-Glu-Thr-Ser-Gln-Cys-Thr-Asp-Ala-Val-Ser(ASETSQCTDAVS)。
4、通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)测定LC10和NC10多肽分子量分别为1593.96Da和1198.16Da；
方法：将纯化后的多肽溶于去离子水中，配置成1μmol/mL的溶液，取10μL与等体积的饱和基质溶液(将α-氰基-4-羟基肉桂酸溶于含0.1％三氟醋酸的50％乙腈溶液中，制成饱和溶液，离心，取上清液)混合后测定。
实验例1
多肽LC10和NC10在脂性物质中的分散性测试：
测定多肽LC10和多肽NC10在羊毛脂中的均一性和分散性。分别取羊毛脂1000g、多肽LC10和NC10多肽各1000mg，室温于SHW/R型移动式高剪切乳化机中混合均匀，搅拌速度120转/min，搅拌30分钟。混匀后，分装成5mL每管。这种条件下多肽LC10和NC10的理论含量为1mg/g。取分装20管，精密称取适量1g混合物量瓶中，加20％乙醇溶液，使溶解(必要时超声使溶解)并稀释至刻度，精密量取2mL用Folin酚法进行蛋白定量。实验表明20份样品中多肽LC10和NC10的平均含量分别为0.94±0.62mg/g和0.91±0.43mg/g，且每份样品含量范围均在理论含量的90％以内。
说明本发明设计的抗氧化多肽LC10和NC10在脂性环境中具有很好的分散性。经测定，所述抗氧化多肽LC10和NC10可溶于水、乙腈、乙醇、磷酸、醋酸等多种缓冲液。可用于抗氧化、自由基清除、美白的药品或者护肤品的开发。
实验例2
LC10和NC10多肽清除ABTS自由基的能力测试：
将5mL的7mM的ABTS溶液与88μL的140mM的过硫酸钾溶液混合，室温避光静置12-16h，得到ABTS+储液。使用磷酸盐缓冲液(10mM)稀释ABTS+储液至734nm波长的吸光度为0.7±0.2即为ABTS+的工作液，将20μL不同浓度的样品(1、0.5、0.25、0.125、0.0625mM)和280μL的ABTS工作液加入到96孔板中，734nM处测定吸光值A1，以ddH2O代替待测样品的吸光值为A2，以抗坏血酸作为阳性对照，重复3次取平均值，ABTS自由基的清除率计算公式为：清除率＝(A2-A1)/A2×100％。
测定结果如附图1和附图2所示，显示浓度为1mM时抗氧化多肽LC10和NC10清除ABTS自由基的效率分别为57.6％和52.7％。说明本发明提供的LC10和NC10清除ABTS自由基的效果显著。
实验例3
LC10和NC10多肽清除DPPH自由基的能力测试：
LC10和NC10多肽的抗氧化能力是通过螯合或者消耗稳定自由基2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazila(DPPH)确定的。通过吸光度检测法测定DPPH的消耗。
取50μL的不同浓度LC10和NC10多肽(1、0.5、0.25、0.125、0.0625和0mM)置于96孔板中，每孔中加入50μL溶剂(ddH2O)和100μL的DPPH溶液(30mg/mL，使用体积分数为95％的乙醇作为溶剂)，重复三次；用抗坏血酸作为阳性对照，在96孔板中加入50μL不同浓度的抗坏血酸(1、0.5、0.25、0.125、0.0625和0mM)，之后每孔中加入50μL溶剂(ddH2O)和100μL的DPPH溶液，重复三次。将样品混匀后，室温避光沉淀30min，使用ELISA酶标仪检测517nm波长的吸光度，计算并统计LC10和NC10多肽的抗氧化活性。清除率计算公式如下：清除率(％)＝[1-(A1-A2)/A0]×100％
式中：A1——样品溶液+DPPH乙醇溶液的吸光度；
A2——样品溶液+体积分数95％的乙醇溶液的吸光度；
A0——超纯水+DPPH乙醇溶液的吸光度。
测定结果如附图3和附图4所示，显示浓度为1mM时抗氧化多肽LC10和NC10清除DPPH自由基的能力比率分别为50.94％和48.1％。说明本发明提供的LC10和NC10清除DPPH自由基的效果显著。
实验例4
LC10和NC10多肽清除羟基自由基的清除能力的测定：
取50μL不同浓度的LC多肽和NC10多肽样品溶液(1、0.5、0.25、0.125、0.0625mM)，分别加入50μL FeSO4(6mM),100μL H2O2(6mM)，充分摇匀后室温放置10min；加入50μL水杨酸(6mM，乙醇溶解)充分摇匀室温放置30min。使用ELISA酶标仪检测510nm处的吸光度值。重复3次取平均值；抗坏血酸作为阳性对照。清除率计算公式如下：清除率＝(A0-A1)/A0×100％。
式中：A0——以ddH2O代替待测样品的吸光度值；
A1——待测样品的吸光度值。
测定结果如附图5和附图6所示，显示浓度为1mM时抗氧化多肽LC10和NC10清除羟基自由基的比率分别为59.6％和51.2％。说明本发明提供的LC10和NC10清除羟基自由基的效果显著。
实验例5
LC10和NC10多肽还原力测定：
取10μL样品(2mg/ml)与50μL磷酸钠缓冲液以及50μL的1％K3Fe(CN)6混合，50℃水浴20min；然后加入50μL 10％的三氯乙酸，3000rpm离心10min；取上清50μL，加入50μL去离子水和10μL 1％FeCl3。于700nm测光吸收。光吸收越强表示还原力越强。
测定结果如表1和表2所示，显示浓度为2mg/ml时抗氧化多肽LC10和NC10还原力光吸收分别为0.23和0.21和96.2％。
表1.抗氧化多肽LC10还原力测定
表2.抗氧化多肽NC10的还原力测定
实验例6
细胞内活性氧簇(ROS)影响的测定：
将人皮肤成纤维细胞(HFF-1)以105个/ml的细胞密度接种于6孔板培养板中，在37℃的CO2培养箱中过夜培养使细胞贴壁，待细胞密度长至80％左右，将培养基吸去，用PBS洗涤细胞2-3次。分别加入1mmol/L、0.3mmol/L、和0.1mmol/L样品(2％血清DMEM培养基稀释)，空白加入2％血清DMEM处理，采用Rosup处理(使用2％血清DMEM培养基稀释至1μM的工作液)。细胞处理完后去除培养基，用PBS冲洗细胞3次，再向细胞中加入终浓度为10μmol/L的DCFH-DA溶液(用无血清DMEM培养基稀释)，37℃孵育1-2h(避光)。然后用0.25％的胰酶将细胞消化，并用培养基终止消化，收集细胞，离心并用培养基清洗细胞3次。检测前在每孔中加入1mL PBS溶液。之后将样品加入流式细胞仪中，样品使用4488mm激发波长，525mm发射波长，记录染色细胞的数目。
实验结果如附图7和附图8所示，当加入LC10和NC10多肽后，浓度达到0.1mmol/L时，ROS染色平均荧光强度已显著降低。
实验例7
细胞毒性测定实验：
用MTT法检测多肽LC10和多肽NC10对人皮肤成纤维细胞HFF-1毒性。人皮肤成纤维细胞HFF-1购于昆明细胞库。先将成纤维细胞于含有15％胎牛血清以及双抗(青霉素和链霉素各100U/mL)的DMEM中培养，待细胞长满后，用0.25％的胰蛋白酶消化下来，用上述培养基洗两次，重新悬浮细胞，细胞计数后将细胞悬浮液100μL加入到96孔细胞培养板中，使每孔细胞数达到105个。加入样品，对照组加入相同体积的灭菌超纯水，置37℃，5％CO2培养箱内培养24h。培养结束后，96孔细胞培养板每孔加入20μL 5mg/mL MTT溶液(用细胞培养PBS缓冲液配制)，继续培养5h，用注射器吸出孔中液体，每孔加入100μL DMSO，用移液枪吹打几次使紫色结晶完全溶解。酶标仪检测光吸收，测定波长490nmol/L，参考波长630nmol/L。
表3.多肽LC10和多肽NC10对HFF-1细胞的毒性
结果如表3所示，多肽LC10和多肽NC10浓度为200μg/mL时的细胞毒性只有1.86％和0.78％(无统计学差异)，说明多肽LC10和多肽NC10对人皮肤成纤维细胞细胞毒性非常小，对人体正常皮肤细胞不会产生伤害，因此十分利于其进一步的开发应用。
以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
<110> 四川丽妍工坊生物科技有限公司
<120> 云南黑松露抗氧化多肽及其制备方法和应用
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Phe Met Pro Met Ala Trp Thr Phe Met Cys Pro Thr Met
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<210> 2
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Ala Ser Glu Thr Ser Gln Cys Thr Asp Ala Val Ser
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