具体实施方式

下面结合附图具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。实施例中采用的原料、试剂若无特殊说明，皆为市售所得。

实验所用宿主菌EH6为多重耐药大肠杆菌临床株，分离于广西崇左某牛场奶牛粪便中分离得到，与本发明大肠杆菌噬菌体GN6正在办理保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址湖北省武汉市武昌区八一路武汉大学，中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M2021882。

LB(Luria broth)液体培养基(1L)：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，加ddH₂O至1L，调节pH至7.0，121℃，20min高压灭菌。

0.6％LB半固体培养基(1L)：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g，琼脂粉6g，加ddH₂O至1L，调节pH至7.0，121℃，20min高压灭菌。

1.2％LB固体培养基(1L)：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，琼脂粉12g，加ddH₂O至1L，调节pH至7.0，121℃，20min高压灭菌后，冷却至50℃，倾倒平板，冷却凝固后，倒置备用。

伊红美蓝固体培养基(1L)：伊红美蓝琼脂粉5.445g,加ddH₂O至1L，调节pH至7.0，121℃，20min高压灭菌。

SM缓冲液(1L)：称取6.055g Tris-HCI(pH为7.5)定容至100ml，加入5.800g NaCl，2.000g MgSO₄后，加入ddH₂O定容至1L。

1mol/L无菌CaCl₂溶液(1L)：用天平称量CaCl₂固体111g，倒入烧杯加水溶解，将溶液倒入1L容量瓶并用蒸馏水润洗烧杯3次，润洗液一并倒入容量瓶，再定容，高压灭菌备用。

DNase I、RNase A、PEG8000、磷钨酸(PTA，2％w/v)为市售所得。

实施例1

大肠杆菌噬菌体GN6的分离

样品采自广西崇左某牛场化粪池中污水，样品于4℃、12000rpm离心10min，上清液再重复离心3次，最终上清分别用0.45μm和0.22μm滤膜过滤；取5mL滤液，加入保藏于中国典型培养物保藏中心的宿主菌0.1mL，加入2×LB液体培养基5mL，放置于37℃培养14～16h，次日，4℃、12000rpm离心上述培养14～16h后所得培养物10min，上清液用0.22μm滤膜过滤除菌，得到含有噬菌体的原液也即噬菌体悬液。

取保藏于中国典型培养物保藏中心的宿主菌划线接种于伊红美蓝固体培养基上，培养过夜后，挑取单克隆接种于5mL LB(Luria broth)液体培养基中，37℃振荡培养8h后作为宿主菌培养物备用。

将1.2％LB固体培养基分为2个区域，吸取上述备用的宿主菌培养物0.1mL和3mL0.6％LB半固体混合均匀后平铺于1.2％LB固体培养基上，待其晾干后取上述噬菌体悬液10μL滴于其中一个区域待自然晾干后，置于37℃培养箱培养后，观察滴加噬菌体区域有无空斑形成，若有空斑形成，证明有噬菌体存在。

重新另取一份上述噬菌体悬液0.1ml连续10倍稀释，分别取出10^-2、10^-4、10^-6稀释液0.1ml加入0.1ml保藏于中国典型培养物保藏中心的宿主菌，静置15min，加入45℃左右的0.6％半固体LB培养基3.5ml，均匀铺在预先制备好的1.2％LB固体培养基上，37℃培养8h后观察噬菌斑生长情况；挑取单个透亮无晕环、大小均一、边缘整齐的噬菌斑放入装有0.1mL宿主菌培养物和LB液体培养基的EP管中，37℃过夜共培养；第二天取共培养物离心过滤，将滤液用SM缓冲液10倍稀释，与0.1ml宿主菌做双层，如此重复10次左右，即可获得噬菌斑大小均一的噬菌体，4℃保存，备用。

用双层平板法检测上述备用的噬菌体，结果如图1所示，该噬菌体在琼脂培养基中可以形成透亮空斑，周围无晕环，边缘清晰规则，直径约为0.1mm，为典型的裂解性噬菌体。

实施例2

大肠杆菌噬菌体GN6的扩增纯化

取实施例1备用的噬菌体0.1ml和实施例1备用的宿主菌培养物0.1ml于试管中作用15min，加入10ml LB液体培养基，37℃培养6h，4℃、12000rpm离心20min，取上清，0.22μm滤膜过滤，滤液即为噬菌体裂解液。

PEG纯化：在噬菌体裂解液中加入DNase I、RNase A至终浓度均为1μg/ml，37℃温育30min，加入终浓度为1M的NaCl冰浴1h(即加入氯化钠使混合溶中氯化钠的最终浓度为1M)，4℃、12000rpm离心10min，取上清加入终浓度为10％的PEG8000，4℃过夜，然后4℃、12000rpm离心10min，弃上清，倒置5min，尽可能的除去多余的水，然后向剩余的固体物质加入SM缓冲液重悬，加入等体积的氯仿温和震荡30s，4℃、5000rpm离心15min以分离有机相和亲水相，回收含有噬菌体颗粒的亲水相，获纯化的噬菌体悬液。

双层平板法检测噬菌体效价：上述纯化的噬菌体悬液进行10倍梯度稀释，取各梯度的噬菌体稀释液0.1ml与宿主菌液0.1ml充分混匀，铺双层琼脂平板，37℃恒温培养左右6-10h，对每个琼脂平皿进行噬菌斑计数，选择出现30-300左右噬菌斑的平皿，根据稀释的倍数计算得到的噬菌体初始浓度即得噬菌体效价，噬菌体的效价(PFU/ml)＝稀释倍数×噬菌斑个数×10，噬菌体效价为6×10⁹PFU/ml。

实施例3

大肠杆菌噬菌体GN6的透射电镜观察

实施例2纯化后的噬菌体悬液做电镜观察，将实施例2纯化后的噬菌体悬液滴在铜片上，自然沉淀5～10min，用滤纸吸去多余的液体，滴一滴2％的磷钨酸(PTA，2％w/v)染色，室温干燥后使用透射电子显微镜观察；观察结果如图2(100kV)所示，该噬菌体有呈正二十面体的头部，头部直径约为60nm，尾部很短，根据国际病毒分类委员会(ICTV)2015年发表的《病毒分类一国际病毒分类委员会第八次报告》，该噬菌体属于短尾病毒家族(Kayfunavirus)，命名为GN6。

实施例4

大肠杆菌噬菌体GN6最佳感染复数的测定(感染复数为感染初期噬菌体的数与宿主菌数的比值)

取实施例1中备用的宿主菌培养物，调整浓度到1×10⁹CFU/mL，按照感染复数分别为1000、100、10、1、0.1、0.01、0.001的比例分别加入实施例1备用的噬菌体和实施例1中备用的宿主菌培养物，加入LB液体培养基使培养体系的总体积相同，在37℃静止培养5h，于10000rpm离心10min，收集上清稀释到适当浓度，用双层法测定效价，结果如图3所示，大肠杆菌噬菌体GN6的最佳感染复数为0.01。

实施例5

大肠杆菌噬菌体GN6一步生长曲线的测定

将实施例1中备用的宿主菌培养物与过量的实施例1备用的噬菌体混合(MOI>10，确保所有细菌与噬菌体吸附)，37℃温浴15min后12000rpm离心1min，弃上清(未吸附的噬菌体)，LB液体培养基洗涤沉淀(相互吸附的细菌及噬菌体颗粒)1次，用10ml预热的LB液体培养基重悬沉淀，迅速置于37℃摇床中振荡培养，从0min开始，每隔10min取120μl培养物，4℃、10000rpm离心2min去除细菌，取上清稀释至适当浓度(适当浓度即在平板上形成30-300个噬菌斑的浓度)，双层法测定噬菌体效价，测130min，共取样14次，以取样时间为横坐标，噬菌体的效价的对数为纵坐标，绘制一步生长曲线得出噬菌体的潜伏期、暴发期、爆发量。一步生长曲线结果如图4所示，其感染宿主菌潜伏期极短(＜10min)，暴发期为40min，爆发量为43。

实施例6

大肠杆菌噬菌体GN6的温度、酸碱度耐受实验

取10个无菌EP管，各加入0.5ml实施例1备用的噬菌体，分别在4℃、25℃、37℃、50℃、60℃、70℃、80℃条件下作用30min、60min，作用时间结束后立即置于水浴中冷却，然后测定噬菌体的效价；检测结果如图5所示：该噬菌体能耐受50℃高温，60min内效价基本稳定，大于60℃时噬菌体效价随时间推移明显下降，60℃环境中30min内效价基本稳定，之后开始下降至失活，70℃、80℃环境中噬菌体迅速失活。

取11份0.1ml实施例1备用的噬菌体分别放入pH为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12的SM缓冲液(0.9ml)中，37℃作用1-2h，然后用双层法测定反应后噬菌体的效价；检测结果如图6所示：大肠杆菌噬菌体GN6在pH值为6～9的环境中效价变化较小，活性基本不变；当环境pH>9或pH<6时，噬菌体的效价随酸、碱性的增强急剧下降；pH>12或pH<2时，噬菌体效价为0，全部失活，因此可知该噬菌体的最适pH为6～10。

实施例7

大肠杆菌噬菌体GN6宿主谱分析

将实施例1备用的噬菌体效价调整为10⁹PFU/ml备用，用分离于广西各地的20株大肠杆菌对噬菌体的宿主谱进行分析，具体操作如下：分别取20株大肠杆菌菌的过夜培养物0.1ml，加入45℃左右的0.6％LB半固体培养基3ml，均匀铺在预先制备好的固体1.2％LB固体培养基上，然后将每个平板平均分成两个区域，其中一个区域取10μL效价调整为10⁹PFU/ml上述备用的噬菌体滴加在表面，另一个区域滴加即生理盐水作对照，待液滴干燥后倒置于37℃培养12h，观察结果，如有噬菌斑产生则记为“+”，否则为“-”。结果如表1所示：大肠杆菌噬菌体GN6能裂解宿主菌EH6和EA2-1。

表1.大肠杆菌噬菌体GN6的宿主谱

注：斜体+粗体为宿主菌。

实施例8

大肠杆菌噬菌体GN6在培养基中的杀菌效果

实施例1备用的宿主菌培养物稀释到1×10⁹CFU/ml，取无菌试管18根，对照组加入1.5mlLB液体培养基，实验组按照MOI＝0.01(最佳感染复数)分别加入1.5ml上述宿主菌培养物和1.5ml不同浓度的实施例1备用的噬菌体，每组做3个重复；用分光光度计测宿主菌与噬菌体的共培养液的OD₆₀₀，每1h测一次，测5h；噬菌体杀菌实验结果如图7所示，MOI＝0即培养液中仅有宿主菌没有噬菌体，在5h内OD₆₀₀呈上升趋势，并维持在一个较高水平。在培养液中加入噬菌体，MOI＝0.01时，OD₆₀₀先上升再下降最后维持在极低水平(OD₆₀₀＜0.2)，可能是噬菌体的初始浓度较低且细菌繁殖速度较噬菌体更快，噬菌体不能很好的抑制细菌增长，一段时间后，噬菌体浓度升高，杀菌作用明显提高，细菌几乎被全部杀死，说明噬菌体浓度不占优势时也能很好的抑制细菌的增长。综上所述，大肠杆菌噬菌体GN6在防控和治疗多重耐药大肠杆菌感染方面具有较好的应用前景。

实施例9

大肠杆菌噬菌体GN6控制环境中多重耐药大肠杆菌的污染

以动物房作为试验地点，将实施例1备用的宿主菌培养物稀释到1×10⁴CFU/ml并均匀喷洒在地面上(ml/m²)，然后将实施例1备用的噬菌体调整浓度至10⁹CFU/ml，用所得浓度为10⁹CFU/ml噬菌体对地面实施喷杀(ml/m²)，每隔1h，使用平板计数法检测地面宿主菌的数量，结果如图8显示：1h后地面大肠杆菌的数量下降到10³CFU，2h后地面的大肠杆菌的数量下降到10CFU，3h后在地面上几乎已经检测不到大肠杆菌，说明本发明大肠杆菌噬菌体GN6可以有效杀灭养殖环境(地面)中的大肠杆菌。

实施例10

大肠杆菌噬菌体GN6的安全性实验

6周龄SPF级小鼠，雌雄各半，共20只，购自北京实验动物中心；随机分为两组，每组10只(5只雌性、5只雄性)，其中一组腹腔注射噬菌体10⁹PFU/mL/0.1mL/只(将实施例1备用的噬菌体调整浓度至10⁹CFU/ml后所得)，对照组腹腔注射等体积PBS，连续观察7天，脱劲致死小鼠，观察内脏、消化道及黏膜变化情况；结果显示，此剂量的噬菌体对小鼠日常行为没有影响，解剖检查各组织器官均无异常。

前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。