阅读说明：本技术 具有降低的肝向性和增加的肌肉转导的AAV9和AAVrh74之间的肽修饰的杂合重组腺相关病毒血清型 (Hybrid recombinant adeno-associated virus serotypes with peptide modification between AAV9 and AAVrh74 with reduced hepatic tropism and increased muscle transduction ) 是由 G·龙齐蒂 P·维达尔 F·明戈齐 于 2019-10-04 设计创作，主要内容包括：本发明涉及重组腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白,其是包含至少一个拷贝的包含RGD基序的肽的AAV血清型9(AAV9)和AAV血清型74(AAVrh74)衣壳蛋白之间的肽修饰的杂合体,其中与不具有所述肽的重组杂合AAV衣壳蛋白相比,所述重组肽修饰的杂合AAV衣壳蛋白具有进一步降低的肝向性和增加的肌肉转导。本发明还涉及包装目标基因的衍生的肽修饰的杂合AAV血清型载体颗粒及其在基因治疗中的用途,特别是用于治疗神经肌肉遗传疾病,特别是肌肉遗传疾病。(The present invention relates to recombinant adeno-associated virus (AAV) capsid proteins which are peptide-modified hybrids between AAV serotype 9(AAV9) and AAV serotype 74(AAVrh74) capsid proteins comprising at least one copy of a peptide comprising the RGD motif, wherein said recombinant peptide-modified hybrid AAV capsid proteins have a further reduced hepatic tropism and increased muscle transduction compared to a recombinant hybrid AAV capsid protein not having said peptide. The invention also relates to derived peptide-modified hybrid AAV serotype vector particles packaging a gene of interest and their use in gene therapy, in particular for the treatment of neuromuscular genetic diseases, in particular myogenetic diseases.)

具体实施方式

实施例：肽修饰的杂合AAV9-rh74血清型载体

1.材料和方法

新血清型的质粒构建

为了构建包含AAV2 Rep序列和杂合Cap 9-rh74的质粒，合成1029nt的片段，所述片段包含AAV-rh74 Cap的高度可变部分，其侧接AAV9 Cap序列片段和5'的限制位点BsiWI和3'的Eco47III(GENEWIZ)。然后，使用提及的限制位点将该片段插入包含AAV2Rep和AAV9Cap的质粒pAAV2-9中以取代AAV9 Cap对应序列。通过用GQSGRGDLGLSAQAA(SEQ ID NO：13)氨基酸序列替换AAV9-rh74衣壳中的QQNAAP六肽(SEQ ID NO：11)来进行肽植入。

AAV生产

使HEK293T细胞在250mL无血清培养基中悬浮生长。用3个质粒转染细胞：i)含有AAV2 ITR的转基因质粒，其侧翼是表达盒，ii)辅助质粒pXX6，其含有产生AAV所需的腺病毒序列，和iii)含有AAV Rep和Cap基因的质粒，其定义AAV的血清型。转染两天后，将细胞裂解以释放AAV颗粒。

通过亲和色谱法纯化病毒裂解物。使用对应于AAV载体基因组的ITR的引物和探针，通过TaqMan实时PCR分析定量病毒基因组(Rohr et al.,J.Virol.Methods,2002,106,81–88)。

体内研究

所有小鼠研究均根据法国和欧洲关于动物护理和实验的立法(2010/63/EU)进行，并经当地机构伦理委员会批准(协议号2016-002C)。将AAV载体通过尾静脉向三个月大的雄性GDE基因敲除小鼠静脉注射。注射PBS的同窝小鼠用作对照。注射载体三个月后，将组织收集并使用Fastprep管(6.5m/s；60秒)在不含DNAse/RNAse的水中匀浆。

载体基因组拷贝数(VGCN)定量

对于样品中的载体基因组拷贝数(VGCN)定量，使用MagNA Pure 96Instrument(Roche)从样品提取DNA。使用上述AAV载体滴定方案对1μL DNA进行实时PCR。肌联蛋白基因的外显子Mex5用作基因组DNA加载对照。

2.结果

通过在SEQ ID NO:3的第586位的Q和第593位的I之间的VP1、VP2和VP3之间的公共区域中插入肽来设计AAV9-rh74杂合衣壳(图1)。使用Michelfelder等公开的肽(PLoS ONE,2009,4,e5122)根据Kienle EC(Dissertation for the degree of Doctor of naturalSciences,Combined Faculties for the Natural Sciences and for Mathematics ofthe Ruperto-Carola University of Heidelberg,Germany,2014)进行AAV衣壳修饰。简言之，将杂合Cap9-rh74的VP1、VP2和VP3之间的公共区域(SEQ ID NO：3的第587-592位)中存在的六肽QQNAAP(SEQ ID NO：11)突变为八肽GQSGAQAA(SEQ ID NO：12)，并将肽P1(RGDLGLS；SEQ ID NO：8)插入4位的甘氨酸和5位的丙氨酸之间。具有插入肽P1的肽修饰的杂合Cap9-rh74具有氨基酸序列SEQ ID NO：5，并且相应的编码序列是SEQ ID NO：6。如实施例1所述，通过悬浮生长的HEK293细胞中三重转染产生载体，并通过亲和色谱法纯化。将称为AAV-肌肉传感器(AAV-MT)的由此产生的AAV载体与AAV9-rh74一起以2x 10¹²vg/小鼠的剂量同时注射到GDE敲除小鼠(GSDIII的动物模型)中。注射后三个月获得组织，并通过定量PCR测量载体基因组拷贝数(VGCN)以评估组织靶向(图2)。在肝脏中，与注射PBS的小鼠相比，注射AAV9-rh74导致载体基因组拷贝相助增加(p<0.05；图2A)，而与PBS组相比，用AAV-MT转导的肝脏未显示VGCN的显著增加。总体上，与亲本衣壳AAV9-rh74相比，AAV-MT在肌肉中显示更好的转导效率(图2B-F)。重要的是，在膈膜、四头肌和腓肠肌中，AAV-MT优于亲本衣壳(p<0.05vs.AAV9-rh74组)。最后，在心脏和趾长伸肌(EDL)中，与注射PBS的小鼠相比，注射AAV-MT衣壳后测得的VGCN显著更高，而注射AAV9-rh74则不然。这些数据表明，AAV-MT衣壳在肌肉转导方面优于AAV9-rh74，并且维持甚至改善了对亲本衣壳观察到的明显肝脏脱靶。