马来甜龙竹转基因体系的建立方法
阅读说明：本技术 马来甜龙竹转基因体系的建立方法 (Method for establishing transgenic system of dendrocalamus malabaricus ) 是由 林新春 鲁海雯 周小红 侯丹 洪彬 张慧聪 刘容秀 于 2021-08-20 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种马来甜龙竹转基因体系的建立方法,采用以下步骤：1)愈伤组织诱导；2)农杆菌培养；3)侵染及共培养；4)脱菌及筛选培养；5)抗性愈伤组织分化及抗性苗生根；6)抗性植株分子鉴定。本发明以马来甜龙竹愈伤组织为受体,通过农杆菌介导法从472块愈伤组织中成功获得34棵抗性植株,转化率为7.20%,抗性植株均有花青素积累表型,提取其中6棵抗性植株进行RNA提取,并反转录得到其cDNA进行PCR检测,结果证实玉米花青素基因已转入竹子基因组中。本发明转化效率高,步骤简单,周期短,效果显著,对其他竹种的转基因体系建立具有一定的参考作用。(The invention discloses a method for establishing a dendrocalamus margaritae transgenic system, which comprises the following steps: 1) inducing callus; 2) culturing agrobacterium; 3) infection and co-culture; 4) removing bacteria and screening culture; 5) differentiation of the resistant callus and rooting of the resistant seedlings; 6) and (5) identifying the resistant plant molecules. The method takes the dendrocalamus malabaricus callus as an acceptor, 34 resistant plants are successfully obtained from 472 callus by an agrobacterium-mediated method, the transformation rate is 7.20%, the resistant plants all have anthocyanin accumulation phenotype, 6 resistant plants are extracted for RNA extraction, and reverse transcription is carried out to obtain cDNA for PCR detection, and the result proves that the zeaxanthin gene is transferred into a bamboo genome. The method has the advantages of high transformation efficiency, simple steps, short period and obvious effect, and has a certain reference function for establishing transgenic systems of other bamboo species.)
技术领域
本发明属于植物转基因技术领域，具体涉及一种马来甜龙竹转基因体系的建立方法，该方法使用马来甜龙竹无菌苗茎段诱导的胚性愈伤组织作为转基因的受体，采用根癌农杆菌介导的转基因方法，经过农杆菌侵染、共培养、筛选培养来获得抗性愈伤组织，经过分化和生根培养后获得抗性植株，再经过分子水平的检测验证转基因并确定植株。
背景技术
马来甜龙竹（Dendrocalamus asper）为牡竹属（Dendrocalamus）大型丛生竹，作为一种重要的经济竹种在东南亚国家，尤其在菲律宾、马来西亚和泰国等地被广泛栽培。在我国香港、台湾和云南，广州和福建亦有引种栽培。马来甜龙竹开花周期长，花期难以预测，结实率低等问题一直阻碍着马来甜龙竹育种研究的进展。而使用现代生物技术，利用植物转基因技术改良马来甜龙竹能有效解决其育种困难的问题。而目前，成功建立竹子转基因研究的报道主要为麻竹，马来甜龙竹的转基因体系尚未有研究报道。
发明内容
本发明通过马来甜龙竹无菌苗腋芽诱导得到的愈伤组织为受体材料，通过农杆菌侵染、共培养和筛选培养后得到抗性愈伤组织。抗性愈伤组织在分化培养基上分化得到抗性植株，通过分子检测确定其为转基因马来甜龙竹，在生根培养基上诱导生根并驯化移栽。此发明提供了一种马来甜龙竹转基因体系的建立方法。
本发明通过以下技术方案加以实现：
所述的马来甜龙竹转基因体系的建立方法，采用以下步骤：
1）愈伤组织诱导：选用马来甜龙竹无菌苗腋芽为外植体，于愈伤组织诱导培养基中诱导培养30±2 d后得到愈伤组织，选取乳黄色，质地坚硬的愈伤组织转移至增殖培养基中进行培养，即获得用于马来甜龙竹转基因后续所用的马来甜龙竹胚性愈伤组织；
2）农杆菌培养：挑选含有目的质粒的农杆菌，在含有50 mg·L-1的卡那霉素（Kan）和50 mg·L-1利福平（Rif）的YEP固体平板上划板，28℃暗培养1~3 d，即可得到单菌落，挑取单菌落接种于1 mL含有50 mg·L-1的卡那霉素和50 mg·L-1利福平的YEP液体培养基中，28℃，200 rpm振荡培养至OD600值达到0.5~0.6之间，之后将全部1 mL菌液接种于50 mL含有50mg·L-1的卡那霉素和50 mg·L-1的利福平的YEP液体培养基中，28℃，200 rpm振荡培养至OD600值达到0.5~0.6之间，OD600达到使用标准后向菌液中添加AS至浓度达到200 μM，并继续在28℃，200 rpm的培养条件下振荡培养30 min后用于侵染；
3）侵染及共培养：将马来甜龙竹胚性愈伤组织与菌液混合，振荡15 min后倒去菌液，在无菌滤纸上吸去表面多余菌液，并转移至共培养培养基中，在25±2℃下暗培养4 d；
4）脱菌及筛选培养：共培养4 d后将愈伤组织取出进行脱菌，使用无菌水清洗愈伤组织3~4遍，至清洗后的废液不再混浊为止，再使用含有200 mg·L-1特美汀（Tim）的无菌水清洗并浸泡3~5 min，脱菌后使用无菌滤纸吸干表面水分，并在超净工作台使用无菌风吹1h，直至愈伤组织表面干燥为止，将吹干后的愈伤组织转移至筛选培养基中，在25±2℃下暗培养的条件下进行筛选培养，每4周继代一次，3次继代后得到抗性愈伤组织；
5）抗性愈伤组织分化及抗性苗生根：将经过筛选培养得到的抗性愈伤组织转移至分化培养基I中，在光强45 μmol·m-2·s-1.光周期16/8 h，温度25±2℃的培养条件下进行分化培养，待分化培养得到的再生芽后转移至分化培养基II中，待长到3~4 cm后转移至生根培养基中，在光强45 μmol·m-2·s-1.光周期16/8 h，温度25±2℃的培养条件下进行生根诱导，30 d左右生根；
6）抗性植株分子鉴定：用PCR法对上述获得的再生植株进行检测，确定外源基因已整合到马来甜龙竹基因组DNA中，并在RNA层面表达。
进一步地，步骤1）中愈伤组织诱导培养基的配方为MS + 3 mg·L-1 2，4-D + 0.5mg·L-1 NAA +500 mg·L-1 CH + 500 mg·L-1 Pro + 500 mg·L-1 Gln + sucrose 30 g·L-1 + gelrite 3.3 g·L-1，pH 5.7；增殖培养基配方为：MS + 2mg·L-1 2，4-D + 0.5 mg·L-1 6-BA + 500 mg·L-1 CH + 20 g·L-1 sucrose + 3.3 g·L-1 gelrite，pH 5.7。
进一步地，步骤2）中菌液中含有乙酰丁香酮（AS）200μM。
进一步地，步骤3）中共培养培养基的配方为MS + 2mg·L-1 2，4-D + 0.5 mg·L-1 6-BA + 200 μM AS+ 30 g·L-1 sucrose + 3.3 g·L-1 gelrite，pH 5.7。
进一步地，步骤4）中筛选培养基配方MS + 2mg·L-1 2，4-D + 0.5 mg·L-1 6-BA +150 mg·L-1Hyg + 200 mg·L-1 Tim + 30 g·L-1 sucrose + 3.3 g·L-1 gelrite，pH5.7。
进一步地，步骤5）中分化培养基I配方为MS+0.02 mg·L-1 TDZ + 20 g·L-1sucrose + 150 mg·L-1Hyg + 200 mg·L-1 Tim +3.3 gelrite g L-1，pH:6.0；分化培养基II 配方为：MS + 1 mg·L-1 6-BA + 1 mg·L-1 KT + 0.25 mg·L-1 NAA + 500 mg·L-1 CH+ 150 mg·L-1Hyg + 200 mg·L-1 Tim +20 g·L-1 + sucrose 3.3 g L-1gelrite，pH 5.7；生根培养基配方为：1/2MS+IBA 3 mg·L-1+3.3 g·L-1 gelrite，pH5.7。
本发明以马来甜龙竹愈伤组织为受体，通过农杆菌介导法从472块愈伤组织中成功获得34棵抗性植株，转化率为7.20 %，抗性植株均有花青素积累表型，提取其中6棵抗性植株进行RNA提取，并反转录得到其cDNA进行PCR检测，结果证实玉米花青素基因已转入竹子基因组中。本发明转化效率高，步骤简单，周期短，效果显著，对其他竹种的转基因体系建立具有一定的参考作用。
附图说明
图1为本发明的农杆菌侵染前愈伤组织状态图；
图2为本发明的农杆菌和胚性愈伤组织共培养状态图；
图3为本发明的愈伤组织在筛选培养基中的状态图；
图4为本发明的愈伤组织在分化培养基I中的状态图；
图5为本发明的愈伤组织在分化培养基II中的状态图；
图6为本发明的转基因植株；
图7为本发明的转基因植株PCR检测结果；
图中，DL 2000：DL 2000 Marker；WT：未转化植株；H2O：水代替DNA模板进行扩增；L1~L6：转基因株系1至6号；+：以含有Lc的质粒未模板进行扩增作为阳性对照；
图8为本发明驯化移栽的转基因植株。
具体实施方式
以下结合说明书附图，对本发明做进一步详细描述，以更好地理解本技术方案。
实施例1：愈伤组织获得
选取马来甜龙竹无菌苗，取其幼嫩腋芽接种于愈伤组织诱导培养基中，愈伤组织诱导培养基基本培养基为MS（Murashige&Skoog），添加外源激素2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）3 mg·L-1，萘乙酸（1-naphthlcetic acid，NAA）0.5 mg·L-1，再添加水解酪蛋白（CaseinHydrolysate,CH）500 mg·L-1，脯氨酸（L-Proline,Pro）500 mg·L-1，谷氨酰胺（L-Glutamine, Gln）500 mg·L-1，再添加蔗糖（sucrose）30 g·L-1，水晶洋菜（gelrite）3.3g·L-1，调节pH为5.7。在25±2℃温度中按培养，诱导30 d左右，有愈伤组织产生，随后挑选乳黄色致密胚性愈伤组织转移至愈伤组织增殖培养基中，增殖培养基的基本培养基为MS，添加有2 mg·L-12，4-D，0.5 mg·L-1 6-苄基腺嘌呤（N-(Phenylmethyl)-9H-purin-6-amine, 6-BA），500 mg·L-1CH，20 g·L-1sucrose和3.3 g·L-1gentril，pH为5.7。每4周更换一次增殖培养基，见图1。
实施例2：农杆菌培养
试验所用农杆菌菌株为EHA105，质粒为pCAMBIA1301，带有以CaMV35S启动子的潮霉素磷酸转移酶基因（HPT）及以UBI启动子的玉米花青素基因（Lc）；将带有目的质粒的农杆菌在含有50 mg·L-1卡那霉素（Kan）和50 mg·L-1的利福平（Rif）的固体YEP培养基平板上划板活化，28℃暗培养2~3 d后挑取单菌落接种于1 mL含有50 mg·L-1卡那霉素（Kan）和50mg·L-1的利福平（Rif）的液体YEP培养基中，28℃，200rpm振摇培养，当菌液OD600达到0.5~0.6后将全部1 mL菌液接种于50 mL含有50 mg·L-1卡那霉素（Kan）和50 mg·L-1的利福平（Rif）的液体YEP培养基中，28℃，200 rpm振摇培养至菌液OD600达到0.5~0.6，随后添加AS至浓度达到200μM，并继续振荡培养30 min。
实施例3：侵染及共培养
将胚性愈伤组织浸泡在准备好的侵染液中，期间不断摇动，侵染15 min左右后取出愈伤组织。用无菌滤纸吸干愈伤组织表面的菌液，随即接种于共培养培养基中，共培养培养基使用MS为基本培养基，并添加有2 mg·L-1 2，4-D，0.5 mg·L-1 6-BA，200 μM AS，30g·L-1 sucrose和3.3 g·L-1gentril。愈伤组织与农杆菌在共培养培养基中培养4 d，培养条件为25±2℃，暗培养，见图2。
实施例4：筛选培养
共培养4 d后将愈伤组织取出，使用无菌水清洗共培养后的愈伤组织3~4遍，至洗出后的废液不再浑浊为止，再使用200 mg·L-1特美汀（Tim）的无菌水清洗浸泡5 min。清洗后转移至无菌滤纸上吸干表面水分，再在超净工作台中用无菌风吹1~2 h至愈伤组织表面干燥。然后转移至筛选培养基中进行筛选培养，筛选培养基的配方为：使用MS为基本培养基，并添加有2 mg·L-1 2，4-D，0.5 mg·L-1 6-BA，150 mg·L-1 潮霉素（Hygromycin B，Hyg），200 mg·L-1 Tim，30 g·L-1 sucrose和3.3 g·L-1gentril，pH 5.7，25±2℃，暗培养。每4周继代一次，继代两次后可得抗性愈伤组织，见图3。
实施例5：抗性愈伤组织分化及抗性苗生根
使用筛选培养中得到愈伤组织，转移至分化培养基I中，分化培养基的配方为：使用MS为基本培养基，添加0.02 mg·L-1噻苯隆（thidiazuron，TDZ），200 mg·L-1 Gln，150mg·L-1 Hyg，200 mg·L-1 Tim，20 g·L-1 sucrose和3.3 g·L-1gelrite，pH 6.0，在光强45μmol·m-2·s-1，光周期16/8 h，温度25±2℃的培养条件下进行分化培养，30 d左右得到抗性苗，见图4，随即转移至分化培养基II中，见图5，分化培养基II的配方为：使用MS为基本培养基，添加1 mg·L-1 6-BA，1 mg·L-1 KT，0.25 mg·L-1 NAA，500 mg·L-1 CH，150 mg·L-1 Hyg，200 mg·L-1 Tim，20 g·L-1 sucrose和3.3 g·L-1gelrite，pH 5.7，光强45 μmol·m-2·s-1，光周期16/8 h，温度25±2℃。待抗性植株在分化培养基II中长至3~4 cm后转移至生根培养基中，生根培养基配方为：以1/2 MS为基本培养基，添加3 mg·L-1吲哚丁酸（Indole-3-Butytric acid, IBA），30 g·L-1 sucrose和3.3 g·L-1gelrite，pH 5.7，光强45 μmol·m-2·s-1，光周期16/8 h，温度25±2℃。1周左右即可看到生根，30 d后根伸长变粗，如图6所示。
实施例6：抗性植株分子鉴定
提取转基因马来甜龙竹叶片RNA，进行反转录得到其cDNA，进行PCR检测，所用的玉米花青素基因Lc的引物序列为：5'-CGACGCTTTGTTCACCCTGT-3'和5'-ACGGGAGCAGCACAGGAAAT-3'。PCR程序为：95℃预变性5 min；然后95℃变性30s，58℃退火30s，循环30次；72℃延伸5min；结果见图7，6棵转基因植株电泳结果均为阳性。
实施例7：植株驯化移栽
将经过鉴定的转基因植株从培养瓶中取出，在流水下小心冲洗去除其根上残留的培养基，待培养基冲洗干净后，种植于基质中。基质给足水分，植株使用塑封袋罩住防止失水，在光强45 μmol·m-2·s-1，光周期16/8 h，温度25±2℃条件下进行驯化，一周后在塑封袋顶部剪开2 cm左右的开口，每隔1~2 d扩大一次开口，直至塑封袋顶部完全开口，保持2~3d后植株无明显失水现象后撤去塑封袋，该方法驯化的转基因马来甜龙竹见图8。
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