小麦磷转运蛋白TaPHT1;9-4B在提高植物磷吸收能力的方法及其应用
阅读说明：本技术 小麦磷转运蛋白TaPHT1;9-4B在提高植物磷吸收能力的方法及其应用 (Method for improving plant phosphorus absorption capacity by wheat phosphorus transport protein TaPHT1 and 9-4B and application thereof ) 是由 康国章 王鹏飞 李鸽子 葛强 韩巧霞 刘国芹 王永华 郭天财 于 2021-09-26 设计创作，主要内容包括：本发明公开了小麦磷转运蛋白技术领域的小麦磷转运蛋白TaPHT1;9-4B在提高植物磷吸收能力的方法,包括以下步骤：S1、TaPHT1.9-4B磷转运蛋白编码基因的克隆；S2、TaPHT1.9-4B过表达载体的构建；S3、水稻遗传转化与转基因水稻植株的检测；S4、TaPHT1.9-4B过表达转基因水稻在水培与土培环境下的功能验证；通过测定不同磷肥处理条件下水稻根系、籽粒以及地上部分的总磷浓度发现,转基因与野生型植株根系与地上部分的磷浓度随着磷肥的增加而增加,在四种磷肥处理条件下,转基因株系根系与地上部分的磷浓度均显著大于野生型植株,而籽粒中的磷浓度在中等磷肥与高等磷肥条件下,没有显著差异；在磷供给不足的环境下,转基因植株籽粒中的磷浓度大于野生型水稻,并且,转基因株系的地上部分生物量和单株产量显著高于野生型转基因。(The invention discloses a method for improving plant phosphorus absorption capacity of wheat phosphorus transporters TaPHT1 and 9-4B in the technical field of wheat phosphorus transporters, which comprises the following steps: cloning coding genes of S1 and TaPHT1.9-4B phosphorus transport protein; constructing an over-expression vector of S2 and TaPHT1.9-4B; s3, detecting rice genetic transformation and transgenic rice plants; s4 and TaPHT1.9-4B overexpression transgenic rice function verification in water culture and soil culture environments; the phosphorus concentrations of the root system and the overground part of the transgenic and wild plants are increased along with the increase of the phosphate fertilizer by measuring the total phosphorus concentrations of the root system, the seed and the overground part of the rice under different phosphate fertilizer treatment conditions, the phosphorus concentrations of the root system and the overground part of the transgenic plant are obviously greater than those of the wild plants under the four phosphate fertilizer treatment conditions, and the phosphorus concentrations in the seed have no obvious difference under the conditions of medium phosphate fertilizer and high phosphate fertilizer; under the environment of insufficient phosphorus supply, the phosphorus concentration in the transgenic plant grains is higher than that of wild rice, and the biomass of the overground part and the single plant yield of the transgenic line are obviously higher than that of the wild transgenic line.)
技术领域
本发明涉及小麦磷转运蛋白技术领域，具体为小麦磷转运蛋白TaPHT1;9-4B在提高植物磷吸收能力的方法及其应用。
背景技术
磷是植物生长发育所必需的三大营养元素之一，磷缺乏会影响植物的生长和发育，土壤中的有效磷(Pi)不足也同样影响农作物的产量和品质的（Raghothama，2005）。并且，由于农作物对磷肥的利用效率低，会造成磷肥的浪费与流失，进而引起一系列的资源与环境问题（Sattarietal.，2012）。因此，提高农作物对磷素的利用效率，对于农业的可持续发展和对资源环境的保护具有重要意义。
植物已经进化出复杂的转运系统来执行对土壤中磷的吸收和不同植物器官中磷的分配，包括质子耦合的磷酸转运体（PT）家族蛋白和其他磷转运蛋白（杨存义等，2006；Rausch & Bucher，2002；Mlodzinska & Zboinska，2016；Wang et al.，2018）。目前已知具有磷转运活性的蛋白质包括参与对土壤中磷吸收和磷转运的PHT蛋白，参与磷通过木质部维管束从根系向地上部分转运的SPX-EXS亚家族蛋白，参与液泡中磷转运的SPX-MFS亚家族蛋白。其中PHT磷转运蛋白是植物最主要的磷素吸收运输系统，土壤中磷素主要是通过根系细胞膜上的PHT磷转运蛋白进入植物体内，并通过PHT在植物体内转运（Smith et al.，2011）。自从第一次在酵母细胞中发现编码高亲和性磷酸盐转运蛋白PHO84的基因以来，根据与酵母磷转运蛋白的氨基酸同源性和内源磷转运蛋白基因PHO84缺失的酵母突变体功能互补试验，越来越多的PHT磷转运蛋白在多种植物中得到鉴定和功能验证（Bun-Ya et al.，1991；Wang et al.，2017）。根据磷的吸收动力学常数（Km）大小，植物体内PHT磷转运蛋白可分为高亲和与低亲和磷转运蛋白，高亲和力磷转运蛋白Km值在μmol/L范围内，而低亲和力磷转运蛋白Km值在mmol/L范围内（Schachtman et al.，1998；Vance，2001；Lopez-Arredondo et al.，2014）。高亲和力磷转运蛋白受磷缺乏诱导表达，主要负责从外界环境中吸收低浓度的磷元素，是一种重要的植物低磷响应机制；低亲和磷转运蛋白属于组成型表达，不受外界环境磷浓度变化的影响，主要在正常供磷的情况下发挥作用（Poirier &Bucher，2002；Bucher，2007）。根据功能差异与亚细胞定位，植物磷转运蛋白基因主要分为四个基因家族：PHT1、PHT2、PHT3和PHT4，其中PHT1亚家族成员最多，主要定位于质膜上，PHT2蛋白定位于叶绿体，PHT3蛋白定位于线粒体，PHT4蛋白定位于质体和高尔基体（Rausch& Bucher，2002；Nussaume et al.，2011；Liu et al.，2011）；
目前大部分被鉴定的植物PHT1磷转运蛋白都属于高亲和磷转运蛋白，它们在结构上具有高度相似性，所有植物PHT1蛋白都有保守的蛋白标签（GGDYPLSATIxSE）和12个跨膜结构域（Raghothama，1999；Vance，2001；Karandashov & Bucher，2005；Nussaume et al.，2011）。第一个植物PHT1基因是从拟南芥中克隆出来的，与酿酒酵母中Pi转运体基因（PHO84）相似（Muchhal et al.，1996；Bun-Ya et al.，1991）。基于蛋白质序列同源性和保守蛋白标签分析，已经从多种植物中鉴定并克隆出多个PHT1成员，大多数PHT1基因优先在根中表达，并受到磷缺乏诱导表达，广泛参与对土壤中磷吸收和植物体内磷转运（Wang etal.，2017；Victor et al.，2019）；
拟南芥基因组中包含9个PHT1家族成员，其中8个受到磷饥饿诱导表达（Muchhalet al.，1996；Mudge et al.，2002；Aung et al.，2006）。AtPHT1;1和AtPHT1;4是两个高表达PHT1蛋白，不管在低Pi或者高Pi条件下，均负责大部分磷的吸收（Misson et al.，2004；Shin et al.，2004）；AtPHT1;1、AtPHT1;2和AtPHT1;3主要参与Pi吸收，AtPHT1;1参与Pi从根到叶的转移（Ayadi et al.，2015）；AtPHT1;8和AtPHT1;9参与了Pi的吸收和根系向地上部分的转运，并与其它AtPHT1表现出遗传互作（Remy et al.，2012；Lapis-Gaza et al.，2014）；AtPHT1;5在叶中的转录水平高于在根中的转录水平，并且在库源器官中的Pi动员过程中发挥了重要作用（Nagarajan et al.，2011）。水稻基因组中，有13个PHT1转运蛋白，其中9个已被功能验证，大部分都涉及到Pi的吸收和转运。OsPHT1;2已被证实与根冠中Pi的转移有关，而OsPHT1;6与Pi的吸收和根冠转移均有关（Ai et al.，2009）；OsPHT1;1和OsPHT1;8在磷充足条件下依然保持较高的表达水平，参与Pi的吸收和从根向地上部的转移，并且OsPHT1;8还参与植物的生长和发育（Jia et al.，2011；Sun et al.，2012）；OsPHT1;9和OsPHT1;10对Pi吸收的功能存在着冗余现象（Wang et al.，2014）；OsPHT1;4不仅影响Pi的吸收和转运，并且还影响胚的发育（Zhang et al.，2015）；OsPHT1;11a和OsPHT1;13则受丛枝菌（AM）的诱导表达，是AM真菌与水稻根系共生发展所必需的，与苜蓿中MtPHT1;4功能相似，但只有OsPHT1;11在AM参与的Pi吸收过程中起主要作用（Javot et al.，2007；Yang etal.，2012）。另外，油菜磷转运蛋白基因BnPht1；4在拟南芥植株体内异源表达，能改变转基因拟南芥的根系形态和对磷饥饿的响应（Feng et al.，2014）。烟草磷转运蛋白NtPT1在水稻中异源表达，能够显著提高转基因水稻的磷素利用效率和植物体内磷素的积累（Myounget al.，2007）；
小麦有14个PHT1磷转运蛋白，大多数TaPHT1基因均受到缺磷胁迫的诱导表达。但是与水稻和拟南芥相比，小麦PHT1基因的研究还很匮乏，PHT1蛋白的功能还知之甚少，我们通过蛋白组学分析发现了一个在缺磷小麦根系中显著上调表达的磷转运蛋白TaPHT1;9-4B，其在水稻体内的异源表达能够显著转基因水稻的磷吸收能力和利用效率，为此，我们提出小麦磷转运蛋白TaPHT1;9-4B在提高植物磷吸收能力的方法及其应用。
发明内容
本发明的目的在于提供小麦磷转运蛋白TaPHT1;9-4B在提高植物磷吸收能力的方法及其应用，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
小麦磷转运蛋白TaPHT1;9-4B在提高植物磷吸收能力的方法，包括以下步骤：
S1、TaPHT1.9-4B磷转运蛋白编码基因的克隆；
S2、TaPHT1.9-4B过表达载体的构建；
S3、水稻遗传转化与转基因水稻植株的检测；
S4、TaPHT1.9-4B过表达转基因水稻在水培与土培环境下的功能验证。
1．优选的，所述步骤S1包括以下步骤：
S1.1、小麦总RNA的提取：
a.采用Trizol法提取两叶一心期“周麦18”小麦幼苗根系的RNA，首先将0.1g新鲜采集的根系进行液氮研磨至粉末状，放入1.5 mL无酶离心管中，加入1 mL Trizol后，剧烈振荡混匀后，室温静置30 min；
b.然后12000 rpm低温（4℃）离心5 min，吸取上清于新的离心管中，再加入1/3体积的氯仿，充分混匀后静止15 min；
c.12000 rpm低温（4℃）离心5 min后，将上清液转移至新的离心管中，加入等体积的异丙醇，充分混匀，静止30 min。12000 rpm低温（4℃）离心5 min后弃上清；
d.每管加入1 mL75%乙醇（DEPC处理水配制），充分洗涤，12000 rpm低温离心5min，弃上清，重复两次。将RNA晾干后，加入40 μL无酶水，冰上溶解，取1 μL RNA溶液在紫外分光光度计测定RNA浓度与质量；
S1.2、反转录合成cDNA第一链：
e.利用反转录试剂盒（PrimeScript ™ II 1st Strand cDNA Synthesis Kit）进行反转录，合成cDNA第一链；
f.在100 μL无酶离心管中依次加入：1μL oligodT primer (50 μM)，1μL dNTPmixture (10 mM each)，2μg Total RNA，加无酶水至总体积为10 μL，65℃保温5min后冰上迅速冷却；
g.将上述反应液依次加入4μL 5× PrimeScript II Buffer，1μL PrimeScriptII RTase（200 U/μL），0.5 μL RNase Inhibitor （40 U/μL），4.5 μL无酶水。42℃ 60 min，95℃5 min失活，冰上冷却，得到小麦cDNA；
S1.3、PCR扩增TaPHT1.9-4B基因CDS：根据小麦磷转运蛋白TaPHT1;9-4B基因（GenBankno.AIZ11192.1）在最新小麦基因组数据库中所对应的基因序列（TraesCS4B02G317000），设计扩增引物TaPHT1;9-4B-CDS-F：ATGGCGACTGAACAGCTC，R：CTAAGCTTCGATGCCATCGT，引物合成由河南尚亚生物技术公司完成，以小麦cDNA为模板，PCR扩增TaPHT1；9-4B基因编码区（CDS），PCR扩增体系包括：10 μL 5×PrimeSTAR Buffer（Mg2+Plus），0.5 μL PrimeSTAR HS DNApolymeras（2.5 U/μL），4.0 μL dNTP Mixture（2.5 mMeach），TaPHT1;9-4B-CDS-F、R引物（10μM）各1.0μL，1.0 μL cDNA，加ddH2O至总体积为50 μL。PCR扩增程序为第一步：94℃ 5min；第二步：94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 2min，32个循环；第三步72℃5min，将PCR产物经过1.0%的琼脂糖凝胶电泳分离，结果如图1所示，PCR产物的条带大小为1566bp，回收PCR产物，与pMD19-T载体酶连后转化大肠杆菌DH5α感受态，氨苄青霉素（100μg/mL）平板筛选，菌落PCR检测，将阳性克隆测序并提取质粒，测序结果与中国春小麦基因组中的参考序列一样（同源性达到100%），该基因不含内含子，编码区包含1566bp核苷酸，编码521个氨基酸（如图2所示）。
优选的，所述步骤d中，当OD260/OD280的值在1.80-2.00之间，OD260/OD230>2.0，说明RNA的质量较好，可作为反转录的模板。
优选的，所述步骤S2包括以下步骤：
S2.1、根据TaPHT1.9-4B基因CDS序列与植物表达载体pCUN1301（含有Ubi启动子）的多克隆位点设计引物TaPHT1;9-4B-trangene-F：TCCCCCGGGATGGCGACTGAACAGCTC（下划线序列为SacI酶切位点），R：GCGTCGACCTAAGCTTCGATGCCATCGT（下划线序列为SalI酶切位点）；
S2.11、利用该引物对，以上述TaPHT1.9-4BCDS克隆载体为模板，PCR扩增两端分别连接SacI和SalI酶切位点的TaPHT1.9-4B CDS，回收目的片段，连接pMD19-T，转化DH5α大肠杆菌，获得阳性菌落，扩大培养，提取质粒，方法同上述描述；
S2.12、用限制性内切酶SacI和SalI对TaPHT1.9-4B CDS-T载体进行双酶切，酶切体系为：质粒1μg，10× 酶切缓冲液5 μL、SacI和SalI各1 μL （10 U/μL）、加ddH2O补充反应体系至50 μL，37℃酶切4 h；
S2.13、用1.0%琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行分离，用Takara公司的DNA凝胶回收试剂盒回收1566 bp左右的片断，用限制性内切酶SacI和SalI对植物表达载体pCUN1301质粒进行双酶切，用1.0%琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行分离，回收线性化的pCUN1301大片段；
S2.2、将6 μL TaPHT1.9-4B CDS酶切产物和2 μL pCUN1301酶切大片段、1 μL (10U/μL) T4 DNA连接酶和1 μL 10×连接酶缓冲液混合，16℃连接16 h，得到的连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经含卡那霉素（100 μg/mL）的抗性平板筛选与测序得到阳性克隆；
S2.21、提取阳性克隆中的重组质粒，并命名为pCUN1301-TaPHT1.9-4B。（载体图谱如图3a），启动子和终止子分别为玉米泛素启动子（Ubiquitin promoter）和农杆菌胭脂碱合成酶终止子（NosT）。
优选的，所述步骤S2.13中的酶切体系为：质粒10 μL、10×酶切缓冲液5 μL、BamHI1 μL（10 U/μL）、KpnI 0.8 μL（10 U/μL），加ddH2O补充反应体系至50 μL，37℃酶切4小时。
优选的，所述步骤S3包括以下步骤：
S3.1、水稻遗传转化：采用农杆菌介导浸染法将pCUN1301-TaPHT1.9-4B重组载体转入“日本晴”水稻成熟胚愈伤组织中；
S3.12首先，诱导水稻成熟胚生成愈伤组织，将pCUN1301-TaPHT1.9-4B通过热激转化法转化农杆菌EHA105，与愈伤组织共培养进行侵染转化，将侵染的愈伤组织在含有卡纳霉素与潮霉素的筛选培养基中进行培养，直至分化成苗，并在生根培养基中生根；
S3.2、阳性转基因水稻植株的鉴定：提取上述转基因与野生型水稻植株的DNA，首先使用HptII基因(KT184677.1)检测引物HptII-F：CACGGCCTCCAGAAGAAGAT，R：CCTGCCTGAAACCGAACTGC，以提取的DNA为模板，进行PCR检测；
S3.21、再使用TaPHT1；9-4B基因自身的CDS扩增引物（TaPHT1；9-4B-CDS-F：ATGGCGACTGAACAGCTC、R：CTAAGCTTCGATGCCATCGT）和载体引物（Ubi-F：AAAGGATCTGTATGTATGTG）进行PCR检测，（结果如图3b、c所示），获得6株阳性植株，均含有HptII与TaPHT1；9-4B基因。
优选的，所述步骤S3.12中，将根部和茎叶生长较为完好的试管苗挑出，向固体培养基中加入适量无菌水，炼苗一周左右，移栽至水稻营养液中。
优选的，所述步骤S3中，为了检测TaPHT1；9-4B在水稻植株内是否正常表达，对目的基因进行RT-PCR检测，首先提取阳性转基因与野生型水稻的RNA，反转录合成cDNA第一条链，以cDNA为模板，利用引物对TaPHT1；9-4B-CDS-F：ATGGCGACTGAACAGCTC/R：CTAAGCTTCGATGCCATCGT进行PCR扩增，方法同上，同时以水稻OsAction基因(AB047313)为内参对照，OsAction扩增引物为F：TATGGTCAAGGCTGGGTTCG，R：CCTAATATCCACGTCGCACT，琼脂糖电泳检测发现，TaPHT1;9-4B在这6个转基因水稻植株内成功表达（如图3d所示）。将转基因阳性幼苗移至温室栽培，按照不同株系收种，在此基础上经过繁种得到转pCUN1301-TaPHT1.9-4B水稻的纯合T2代种子。
优选的，所述步骤S4包括以下步骤：
S4.1、TaPHT1；9-4B转基因水稻在水培条件下对不同磷浓度的响应，阳性转基因水稻植株（OE1，OE3）的T2代种子和野生型水稻种子在培养室内发芽，然后水稻营养液（IRRI）中培养至两周，然后挑选大小一致的水稻植株分别在含有正常（CK，1 mM Pi）、低磷（LP，50μM Pi）、缺磷（NP，0 μM Pi）营养液中培养三周后，观察转基因水稻与野生型水稻植株的生长表型，测定株高根长和根系与地上部分的干重，每隔两天更换营养液；
S4.12、在低磷和缺磷条件下，转基因植株的株高、根干重和地上部干重均显著高于野生型植株（如图4a、b所示），在正常供磷条件下，虽然其株高根长差异不明显，但是转基因植株的根系与地上部干重则显著大于野生型，这些结果表明：小麦磷转运蛋白TaPHT1;9-4B的编码基因在水稻体内异源表达，能够促进转基因水稻在低磷和缺磷环境下的生长；
S4.13、TaPHT1;9-4B转基因与野生型水稻的根和叶组织经过浓硫酸与过氧化氢消煮后，采用钼锑抗比色法测定磷浓度。结果如图4c所示，转基因植株根系与地上部分的磷含量在正常与低磷水培条件下均显著高于野生型植株；在缺磷条件下，转基因植株地上部分的磷含量高于野生型植株，但是根系磷含量则显著低于野生型植株根系，表明TaPHT1;9基因在水稻体内异源表达能提高转基因水稻对磷素的吸收和利用，增强转基因水稻对低磷环境的适应性；
S4.2、TaPHT1;9-4B转基因水稻在不同供磷水平土培试验中的功能验证，为进一步验证TaPHT1；9-4B在水稻体内过表达对转基因水稻在土壤生长环境中对整个生育期的磷肥吸收效率与产量的影响，将TaPHT1;9-4B转基因水稻株系（OE1和OE3）与野生型水稻（WT）进行盆栽试验；
S4.21、盆栽土壤取自河南农业大学毛庄农场水稻田，分别施加氮肥（尿素）200mg/kg、钾肥（硫酸钾）50 mg/kg，施加磷肥（过磷酸钙）设置四个水平：无磷（NP：0 mg/kg Ca(H2PO4)2.H2O）、低磷（LP：50 mg/kg Ca(H2PO4)2.H2O）、中磷（MP：100 mg/kg Ca(H2PO4)2.H2O）和高磷（HP：200 mg/kg Ca(H2PO4)2.H2O），分别将不同磷肥处理的土壤混合均匀后分装，每盆10kg土壤；
S4.22、野生型与转基因水稻株系（OE1、OE3）种子经过浸种、催芽，在实验室水培育苗，30d后水稻秧苗有分蘖出现，将不同株系的水稻秧苗分别栽种在不同磷肥处理的盆栽中，每个株系每个处理各6盆，每盆两棵植株，在大田环境下生长。待成熟期观察表型并拍照，收获种子，进行考种，并测定除去籽粒的地上部分（稻草）生物量，同时测定籽粒、稻草、根系的磷浓度；
S4.23、在不施磷肥（NP）和低磷肥（LP）条件下，转基因株系的生长情况优于野生型植株，在中等磷肥（MP）条件下，转基因植株与野生型植株的生长表型并没有显著差异，而在高磷肥（HP）条件下，转基因植株与野生型植株相比，其生长甚至受到一定程度的抑制，这可能是由于高磷环境造成的磷中毒现象。
优选的，所述通过测定单株产量与地上部分的生物量发现，转基因植株与野生型植株的单株产量随着土壤中施加磷肥的增加而增加，当达到中等磷肥施用量后，不再因磷肥的施加而增加，并且转基因水稻在低磷肥条件下的单株产量即达到最大产量，地上部分的生物量呈现类似的规律（图5a、b）。千粒重测定结果表明，在缺磷与低磷条件下，转基因株系的千粒重大于野生型植株（如图5c所示），这些结果表明TaPHT1；9-4B在水稻体内的表达，能使转基因水稻在较低的磷肥水平下即可达到WT在更高供磷水平下的产量。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明通过测定不同磷肥处理条件下水稻根系、籽粒以及地上部分的总磷浓度发现，转基因与野生型植株根系与地上部分的磷浓度随着磷肥的增加而增加，并且四种供磷条件下，转基因株系根系与地上部分的磷浓度均显著大于野生型植株（如图5d和5e所示），而籽粒中的磷浓度在中等磷肥与高等磷肥条件下，没有显著差异，在磷供给不足（NP和LP）环境下，野生型水稻籽粒中的磷浓度则少于转基因植株（如图5f所示），由此认为，在磷供给不足的土壤环境中，TaPHT1；9-4B在水稻体内的过表达能够提高转基因植株对土壤中的磷素的吸收，同时促进植株生物量的增加与千粒重，增加产量，提高了磷肥的利用效率。
附图说明
图1为本发明中TaPHT1;9-4B基因编码区（CDS）的扩增结果示意图；
图2为本发明中TaPHT1;9-4B编码区核酸序列与翻译蛋白氨基酸序列的示意图；
图3为本发明中TaPHT1;9-4B异源表达转基因水稻阳性植株的鉴定示意图；
图4为本发明中TaPHT1;9-4B转基因水稻与野生型水稻植株在不同磷浓度水培条件下的功能验证示意图；
图5为本发明中TaPHT1;9-4B转基因水稻与野生型水稻植株在不同磷肥水平土培条件下的功能验证示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1、图2、图3、图4和图5，本发明提供一种技术方案：
小麦磷转运蛋白TaPHT1;9-4B在提高植物磷吸收能力的方法，包括以下步骤：
S1、TaPHT1;9-4B磷转运蛋白编码基因的克隆；
S2、TaPHT1;9-4B过表达载体的构建；
S3、水稻遗传转化与转基因水稻植株的检测；
S4、TaPHT1;9-4B过表达转基因水稻在水培与土培环境下的功能验证。
请参阅图2，所述步骤S1包括以下步骤：
S1.1、小麦总RNA的提取：
a.采用Trizol法提取两叶一心期“周麦18”小麦幼苗根系的RNA，首先将0.1g新鲜采集的根系进行液氮研磨至粉末状，放入1.5 mL无酶离心管中，加入1 mL Trizol后，剧烈振荡混匀后，室温静置30min；
b.然后12000 rpm低温（4℃）离心5 min，吸取上清于新的离心管中，再加入1/3体积的氯仿，充分混匀后静止15 min；
c.12000 rpm低温（4℃）离心5 min后，将上清液转移至新的离心管中，加入等体积的异丙醇，充分混匀，静止30 min。12000 rpm低温（4℃）离心5 min后弃上清；
d.每管加入1mL75%乙醇（DEPC处理水配制），充分洗涤，12000 rpm低温离心5 min，弃上清，重复两次。将RNA晾干后，加入40 μL无酶水，冰上溶解，取1 μLRNA溶液在紫外分光光度计测定RNA浓度与质量；
S1.2、反转录合成cDNA第一链：
e.利用反转录试剂盒（PrimeScript ™ II 1st Strand cDNA Synthesis Kit）进行反转录合成cDNA第一链；
f.在100 μL无酶离心管中依次加入：1 μL oligodT primer (50 μM)，1 μL dNTPmixture (10 mM each)，2 μg Total RNA，加无酶水至总体积为10 μL，65℃保温5min后冰上迅速冷却；
g.将上述反应液依次加入4 μL 5×PrimeScript II Buffer，1 μL PrimeScriptII RTase（200 U/μL），0.5 μL RNase Inhibitor（40 U/μL），4.5 μL无酶水。42℃60 min，95℃5 min失活，冰上冷却，得到小麦cDNA；
S1.3、PCR扩增TaPHT1.9-4B基因CDS：根据小麦磷转运蛋白TaPHT1;9-4B基因（GenBank no.AIZ11192.1）在最新小麦基因组数据库中所对应的基因序列（TraesCS4B02G317000），设计扩增引物TaPHT1；9-4B-CDS-F：ATGGCGACTGAACAGCTC，R：CTAAGCTTCGATGCCATCGT，引物合成由河南尚亚生物技术公司完成，以小麦cDNA为模板，PCR扩增TaPHT1；9-4B基因编码区（CDS），PCR扩增体系包括：10 μL 5×PrimeSTAR Buffer（Mg2+Plus），0.5 μL PrimeSTAR HS DNApolymeras（2.5 U/μL），4.0 μL dNTP Mixture（2.5 mMeach），TaPHT1；9-4B-CDS-F、R引物（10 μM）各1.0 μL，1.0 μL cDNA，加ddH2O至总体积为50μL。PCR扩增程序为第一步：94℃ 5 min；第二步：94℃30 s，56℃30 s，72℃2 min，32个循环；第三步72℃5 min，将PCR产物经过1.0%的琼脂糖凝胶电泳分离，结果如图1所示，PCR产物的条带大小为1566 bp，回收PCR产物，与pMD19-T载体酶连后转化大肠杆菌DH5α感受态，氨苄青霉素（100 μg/mL）平板筛选，菌落PCR检测，将阳性克隆测序并提取质粒，测序结果与中国春小麦基因组中的参考序列一样（同源性达到100%），该基因不含内含子，编码区包含1566 bp核苷酸，编码521个氨基酸（如图2所示）；
请参阅图2，所述步骤d中，当OD260/OD280的值在1.80-2.00之间，OD260/OD230>2.0，说明RNA的质量较好，可作为反转录的模板；
请参阅图3，所述步骤S2包括以下步骤：
S2.1、根据TaPHT1.9-4B基因CDS序列与植物表达载体pCUN1301（含有Ubi启动子）的多克隆位点设计引物TaPHT1;9-4B-trangene-F：TCCCCCGGGATGGCGACTGAACAGCTC（下划线序列为SacI酶切位点），R：GCGTCGACCTAAGCTTCGATGCCATCGT（下划线序列为SalI酶切位点）；
S2.11、利用该引物对，以上述TaPHT1.9-4BCDS克隆载体为模板，PCR扩增两端分别连接SacI和SalI酶切位点的TaPHT1.9-4B CDS，回收目的片段，连接pMD19-T，转化DH5α大肠杆菌，获得阳性菌落，扩大培养，提取质粒，方法同上述描述；
S2.12、用限制性内切酶SacI和SalI对TaPHT1.9-4B CDS-T载体进行双酶切，酶切体系为：质粒1μg，10×酶切缓冲液5μL、SacI和SalI各1 μL（10 U/μL）、加ddH2O补充反应体系至50 μL，37℃酶切4个小时；
S2.13、用1.0%琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行分离，用Takara公司的DNA凝胶回收试剂盒回收1566 bp左右的片断，用限制性内切酶SacI和SalI对植物表达载体pCUN1301质粒进行双酶切，用1.0%琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行分离，回收线性化的pCUN1301大片段；
S2.2、将6μL TaPHT1.9-4B CDS酶切产物和2 μL pCUN1301酶切大片段、1 μL (10U/μL) T4 DNA连接酶和1 μL10×连接酶缓冲液混和，16℃连接16小时，得到的连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经含卡那霉素（100 μg/mL）的抗性平板筛选与测序得到阳性克隆；
S2.21、提取阳性克隆中的重组质粒，并命名为pCUN1301-TaPHT1.9-4B。（载体图谱如图3a），启动子和终止子分别为玉米泛素启动子（Ubiquitin promoter）和农杆菌胭脂碱合成酶终止子（NosT）；
请参阅图3，所述步骤S2.13中的酶切体系为：质粒10μl、10×酶切缓冲液5 μL、BamHI 1 μL（10 U/μL）、KpnI 1 μL（10 U/μL），加ddH2O补充反应体系至50 μL，37℃酶切4小时；
请参阅图3，所述步骤S3包括以下步骤：
S3.1、水稻遗传转化：采用农杆菌介导浸染法将pCUN1301-TaPHT1.9-4B重组载体转入“日本晴”水稻成熟胚愈伤组织中；
S3.12首先，诱导水稻成熟胚生成愈伤组织，将pCUN1301-TaPHT1.9-4B通过热激转化法转化农杆菌EHA105，与愈伤组织共培养进行侵染转化，将侵染的愈伤组织在含有卡纳霉素与潮霉素的筛选培养基中进行培养，直至分化成苗，并在生根培养基中生根；
S3.2、阳性转基因水稻植株的鉴定：提取上述转基因与野生型水稻植株的DNA，首先使用HptII基因(KT184677.1)检测引物HptII-F：CACGGCCTCCAGAAGAAGAT，R：CCTGCCTGAAACCGAACTGC，以提取的DNA为模板，进行PCR检测；
S3.21、再使用TaPHT1；9-4B基因自身的CDS扩增引物（TaPHT1；9-4B-CDS-F：ATGGCGACTGAACAGCTC、R：CTAAGCTTCGATGCCATCGT）和载体引物（Ubi-F：AAAGGATCTGTATGTATGTG）进行PCR检测，（结果如图3b、c所示），获得6株阳性植株，均含有HptII与TaPHT1；9-4B基因；
请参阅图3，所述步骤S3.12中，将根部和茎叶生长较为完好的试管苗挑出，向固体培养基中加入适量无菌水，炼苗一周左右，移栽至水稻营养液中；
请参阅图3，所述步骤S3中，为了检测TaPHT1；9-4B在水稻植株内是否正常表达，对目的基因进行RT-PCR检测，首先提取阳性转基因与野生型水稻的DNA，反转录合成cDNA第一条链，以cDNA为模板，利用引物对TaPHT1;9-4B-CDS-F：ATGGCGACTGAACAGCTC，R：CTAAGCTTCGATGC- CATCGT进行PCR扩增，方法同上，同时以水稻OsAction基因(AB047313)为内参对照，OsAction扩增引物为F：TATGGTCAAGGCTGGGTTCG，R：CCTAATATCCACGTCGCACT，琼脂糖电泳检测发现，TaPHT1；9-4B在这6个转基因水稻植株内成功表达（如图3d所示）。将转基因阳性幼苗移至温室栽培，按照不同株系收种，在此基础上经过繁种得到转pCUN1301-TaPHT1.9-4B水稻的纯合T2代种子；
请参阅图5，所述步骤S4包括以下步骤：
S4.1、TaPHT1；9-4B转基因水稻在水培条件下对不同磷浓度的响应，阳性转基因水稻植株（OE1，OE3）的T2代种子和野生型水稻种子在培养室内发芽，然后水稻营养液（IRRI）中培养至两周，然后挑选大小一致的水稻植株分别在含有正常（CK，1 mM Pi）、低磷（LP，50μM Pi）、缺磷（NP，0 μM Pi）营养液中培养三周后，观察转基因水稻与野生型水稻植株的生长表型，测定株高根长和根系与地上部分的干重，每隔两天更换营养液，结果发现TaPHT1;9-4B转基因水稻植株的生长表型优于WT植株（如图4a所示）；
S4.12、在低磷和缺磷条件下，转基因植株的株高、根干重和地上部干重均显著高于野生型植株（如图4a、b所示），在正常供磷条件下，虽然其株高根长差异不明显，但是转基因植株的根系与地上部干重则显著大于野生型，这些结果表明：小麦磷转运蛋白TaPHT1;9-4B的编码基因在水稻体内异源表达，能够促进转基因水稻在低磷和缺磷环境下的生长；
S4.13、TaPHT1;9-4B转基因与野生型水稻的根和叶组织经过浓硫酸与过氧化氢消煮后，采用钼锑抗比色法测定磷浓度。结果如图4c所示，转基因植株根系与地上部分的磷含量在正常与低磷水培条件下均显著高于野生型植株；在缺磷条件下，转基因植株地上部分的磷含量高于野生型植株，但是根系磷含量则显著低于野生型植株根系，表明TaPHT1;9基因在水稻体内异源表达能提高转基因水稻对磷素的吸收和利用，增强转基因水稻对低磷环境的适应性；
S4.2、TaPHT1;9-4B转基因水稻在不同供磷水平土培试验中的功能验证，为进一步验证TaPHT1;9-4B在水稻体内过表达对转基因水稻在土壤生长环境中对整个生育期的磷肥吸收效率与产量的影响，将TaPHT1;9-4B转基因水稻株系（OE1和OE3）与野生型水稻（WT）进行盆栽试验；
S4.21、盆栽土壤取自河南农业大学毛庄农场水稻田，分别施加氮肥（尿素）200mg/kg、钾肥（硫酸钾）50mg/kg，施加磷肥（过磷酸钙）设置四个水平：无磷（NP：0 mg/kg Ca(H2PO4)2.H2O）、低磷（LP：50 mg/kg Ca(H2PO4)2.H2O）、中磷（MP：100 mg/kg Ca(H2PO4)2.H2O）和高磷（HP：200 mg/kg Ca(H2PO4)2.H2O），分别将不同磷肥处理的土壤混合均匀后分装，每盆10 kg土壤；
S4.22、野生型与转基因水稻株系（OE1、OE3）种子经过浸种、催芽，在实验室水培育苗，30 d后水稻秧苗有分蘖出现，将不同株系的水稻秧苗分别栽种在不同磷肥处理的盆栽中，每个株系每个处理各6盆，每盆两棵植株，在大田环境下生长。待成熟期观察表型并拍照，收获种子，进行考种，并测定除去籽粒的地上部分（稻草）生物量，同时测定籽粒、稻草、根系的磷浓度；
请参阅图5，所述通过测定单株产量与地上部分的生物量发现，转基因植株与野生型植株的单株产量随着土壤中施加磷肥的增加而增加，当达到中等磷肥施用量后，不再因磷肥的施加而增加，并且转基因水稻在低磷肥条件下的单株产量即达到最大产量，地上部分的生物量呈现类似的规律（图5a、b）。千粒重测定结果表明，在缺磷与低磷条件下，转基因株系的千粒重大于野生型植株（如图5c所示），这些结果表明TaPHT1;9-4B在水稻体内的表达，能使转基因水稻在较低的磷肥水平下即可达到WT在更高供磷水平下的产量；
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。