一种农杆菌介导的海大麦遗传转化方法
阅读说明：本技术 一种农杆菌介导的海大麦遗传转化方法 (Agrobacterium-mediated genetic transformation method for sea barley ) 是由 邝刘辉 李琪 吴德志 张国平 于 2021-10-25 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种农杆菌介导的海大麦遗传转化方法,步骤如下：S1、选取长度为0.5-1.0 mm的海大麦幼胚,用酒精和次氯酸钠双重表面杀菌,获得无菌外植体；S2、准确分离整个幼胚,对幼胚进行横切,以抑制实生幼芽,诱导愈伤组织的发生和增殖；S3、根据愈伤发生和农杆菌生长情况,调整预培养和农杆菌侵染时间,防止菌液过量；S4、采用弱光遮蔽法进行培养,经不定芽诱导培养和根诱导培养,获得转基因幼苗。本发明为海大麦幼胚的组培方法,绿点分化和成苗率高,且不受材料限制；建立的海大麦幼胚转化再生体系,遗传转化率和突变效率高。(The invention discloses an agrobacterium-mediated sea barley genetic transformation method, which comprises the following steps: s1, selecting young sea barley embryos with the length of 0.5-1.0mm, and performing double surface sterilization by using alcohol and sodium hypochlorite to obtain sterile explants; s2, accurately separating the whole young embryo, and transversely cutting the young embryo to inhibit seedling young buds and induce the generation and proliferation of callus; s3, adjusting the preculture and agrobacterium infection time according to the callus generation and agrobacterium growth conditions to prevent the bacterial liquid from being excessive; and S4, culturing by adopting a weak light shielding method, and obtaining the transgenic seedling through adventitious bud induction culture and root induction culture. The invention is a tissue culture method of young embryo of sea barley, the green point differentiation and seedling rate are high, and the tissue culture method is not limited by materials; the established conversion and regeneration system of the young embryo of the sea barley has high genetic transformation rate and mutation efficiency.)
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，特别涉及一种农杆菌介导的海大麦遗传转化方法。
背景技术
小麦族是禾本科中最重要的粮食作物来源之一，全球年产量高达9亿吨，占全部谷物产量的30％(FAO，2020)。土壤盐渍化严重制约土地利用与作物生产，是全球农业生产上的一种最主要的非生物胁迫(Munns and Tester,2008,Annu.Rev.Plant Biol.59:651-681)。海大麦(Hordeum marinum)是大、小麦的野生近缘种，是小麦族中耐盐性最强的物种，且与普通小麦有一定的可交配性，因此是小麦耐盐性改良的潜在基因供体(Colmer etal.,2006,J.Exp.Bot.57(5):1059-1078；Islam et al.,2007,J.Exp.Bot.58(5):1219-1229)。解析海大麦特异的耐盐分子机制对优异遗传(基因)资源的利用和小麦耐盐性改良具有重要意义。然而，由于海大麦遗传转化体系尚未建立，目前对其耐盐机理研究和基因功能解析进展仍十分缓慢。
小麦族作物的转基因体系一般采取以幼胚为外植体的农杆菌介导的转化方法，比如六倍体小麦(Hayta et al.,2019Plant Methods.15:121)和大麦(Bartlett et al.,2008,Plant Methods.4:22)。然而在海大麦中还未见有成功的报道，主要原因是一直缺乏合适的再生体系。高效遗传转化体系的建立可为深入开展海大麦优异耐盐基因的功能解析和育种提供有效途径。
发明内容
基于此，有必要针对海大麦遗传转化体系缺失的现状，本发明的主要目的是提供一种农杆菌介导的海大麦遗传转化方法，该方法实现了遗传转化技术在海大麦中的成功应用，并获得了较高的转化率，可应用于海大麦基因功能研究。
本发明的主要目的是通过以下技术方案实现的：
一种农杆菌介导的海大麦遗传转化方法，所述方法包括如下步骤：
S1、海大麦幼胚材料的选取和灭菌：选择长度为0.5-1.0mm的海大麦幼胚，用酒精和次氯酸钠双重表面杀菌，获得无菌外植体；
S2、幼胚的分离与愈伤诱导：准确分离整个幼胚，对幼胚进行横切，抑制实生幼芽，并诱导愈伤组织的发生和增殖；
S3、农杆菌侵染与选择培养：根据愈伤发生和农杆菌生长情况，调整预培养和农杆菌侵染时间，防止菌液过量；
选择培养用的培养基中添加特泯菌和潮霉素；
S4、愈伤的分化、成苗和阳性苗检测：采用弱光遮蔽法进行培养，经不定芽诱导培养和根诱导培养，对获得的组培苗进行DNA提取和PCR检测。
本发明提供一种农杆菌介导的海大麦遗传转化方法和相应的组织培养体系。
作为优选，S1、海大麦幼胚材料的选取和灭菌：选择未成熟的种子饱满、胚乳胶状，半透明，长度为0.5-1.0mm的海大麦幼胚，保留麦芒保持幼胚种皮完整，依次用70％酒精灭菌，再用现配次氯酸钠溶液浸泡，随后用灭菌水反复冲洗，获得无菌外植体。
作为优选，S2、幼胚的分离与愈伤诱导：
取S1中的灭菌种子，置于垫有双层无菌滤纸的培养皿盖上，背部朝上，麦芒末端远离操作者；
利用双镊子尖端夹持法，左手镊子尖端夹持固定种子，右手镊子尖端撕扯麦芒，扯下整个背部种皮，露出整个幼胚；
左手镊子尖端刺穿1/2胚乳处，并始终固定住种子，右手镊子尖端倾斜挤压幼胚上部胚乳，剥离整个幼胚；
将完整幼胚正面朝上，轻柔放于愈伤诱导培养基表面，每皿可放80-100个幼胚，用镊子尖端逐一对幼胚中央进行横切；
22℃黑暗培养7d，用镊子尖端去除少数实生幼芽，继续黑暗培养7d，再次去除实生幼芽和质地柔软的非胚性愈伤；更换新的愈伤诱导培养基后黑暗培养2-3周；
如需进行农杆菌侵染以获得转基因植株，则按S3操作；
如直接用于愈伤组织诱导，则取S2中黄色致密的胚性愈伤，22℃黑暗培养3-4周，每两周更换一次不含潮霉素和特泯菌的愈伤诱导培养基，而后转到S4。
作为优选，S3、农杆菌侵染与选择培养：
取S2中黄色致密的胚性愈伤，在22℃黑暗环境下预培养1周；
取直径大小为2-3mm的愈伤块，使用20μl移液枪吸取农杆菌菌液，逐个滴加在愈伤中央包裹整个愈伤，其后立即吸回多余菌液，略微倾斜培养皿置于超净工作台，待多余菌液吹干后，换至新的愈伤诱导培养基；
共培养36-48h后，减少愈伤数目至每皿20-30个，更换两轮愈伤诱导筛选培养基，黑暗培养3-4周。
作为优选，农杆菌菌液采用不含抗生素的MG基本培养液，菌液浓度OD600＝0.5-0.6。
作为优选，S4、愈伤的分化、成苗和阳性苗检测：
自愈伤见光起，分化和生根诱导阶段全程用单层A4纸遮盖培养皿盖和培养管盖，营造弱光环境；
先取S2或S3中黄色致密的愈伤块，每皿15-20个独立的愈伤块为宜，置于分化或分化筛选培养基中弱光培养2周；
剔除颜色发白和质地柔软的部分，挑选有绿点分化的小愈伤块，转移至新的分化或分化筛选培养基上，弱光培养2-4周；
待绿点成苗并长至2-3cm时，将其转移至含生根或生根筛选培养基的12ml摇菌管(2-3ml培养基)中，培养2-3周，此时根系建成；
炼苗时即开盖，加灭菌水至高出液面1-2cm，在外界环境中适应1-2d，用自来水洗净根周围的培养基，在1/5霍格兰水培培养液中培养3-4周；
若为转化后的愈伤分化与成苗，步骤如上所述，培养基则为分化筛选培养基和生根筛选培养基；
将选择培养获得的阳性苗进行DNA提取和PCR检测，根据是否扩增出目的片段，确定是否为转基因植株；
若转化用农杆菌重组菌株携带基因编辑载体，对PCR检测结果为阳性的植株进行靶点附近序列PCR扩增，Sanger法测序检测突变位点。
作为优选，潮霉素的使用量在愈伤诱导阶段保持初始用量，在分化阶段、生根阶段逐步减少用量。
作为优选，S2-S4所述的各培养基以MS为基础培养基，1L的各组分配比为：
a.愈伤诱导培养基：4.3g MS基本培养基(不含维生素)+30g麦芽糖+1.0g干酪素水解物+690mg脯氨酸+350mg肌醇+1.0mg盐酸硫胺+5mg麦草畏+1.25mg CuSO4·5H2O+3.65g植物凝胶，1M NaOH调至pH＝5.8；
愈伤诱导筛选培养基：愈伤诱导培养基+200mg特泯菌+25mg潮霉素；
b.分化培养基：2.7g MS培养基(不含NH4NO3，不含维生素)+25g麦芽糖+825mgNH4NO3+750mg谷氨酰胺+690mg脯氨酸+500mg干酪素水解物+100mg肌醇+0.4mg盐酸硫胺+0.15mg 2,4-D+5mg激动素+1.25mg CuSO4·5H2O+3.4g植物凝胶，1M NaOH调至pH＝5.8；
分化筛选培养基：分化培养基+200mg特泯菌+15mg潮霉素；
c.生根培养基：4.3g MS基本培养基(不含维生素)+30g麦芽糖+1.0g干酪素水解物+690mg脯氨酸+350mg肌醇+1.0mg盐酸硫胺+3.2g植物凝胶，1MNaOH调至pH＝5.8；
生根筛选培养基：生根培养基+160mg特泯菌+10mg潮霉素。
上述各培养基应用时，在农杆菌转化条件下的分化和生根阶段逐渐减少抗生素用量，愈伤诱导培养基植物凝胶高压灭菌，其余成分过滤灭菌，分化和生根培养基高压灭菌。
作为优选，S4中对获得的组培苗进行DNA提取和PCR检测，采用的引物包括
Cas9-F：CCTGGCCCACATGATCAAGT，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，
Cas9-R：TGTACTTCTCAGGCAGCTGC，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
作为优选，S4中对阳性植株靶点附近序列进行PCR扩增，Sanger法测序检测突变位点，测序引物为hmsos1sg1F：CCGGCATCCGCATCTGTA，其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
作为优选，海大麦幼胚材料的来源优先选择田间或网室栽培植株，自然环境下生长的幼胚生长状态一致，取材方便，再生活力强。人工气候室内海大麦幼穗材料易滋生病菌，须进行彻底灭菌。
作为优选，侵染幼胚的农杆菌菌液浓度严格控制在OD600＝0.5-0.6，不要求现摇现用，菌液在4℃环境避光存放2d内仍保持在上述浓度均可重复使用，但要确保菌液无杂菌污染。使用移液枪向幼胚中央滴加菌液时，注意不要滴过多，待菌液完全包裹幼胚时即回吸多余的菌液，避免过多菌液残留造成后续农杆菌过量。每次吸取的菌液消耗完毕，注意更换新的灭菌吸头，避免幼胚交叉污染。
作为优选，潮霉素的使用量在愈伤诱导阶段保持初始用量，有利于阳性愈伤的筛选。但在分化阶段特别是生根阶段应逐步减少用量，在确保阳性苗的基础上，有利于缩短成苗和生根的时间。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1.以幼胚为外植体，首次建立了海大麦组培再生体系，绿点分化和成苗率高；
2.本发明提供的组培体系普遍适用于不同的海大麦材料；
3.提供了一种农杆菌介导的海大麦遗传转化体系，转化率和基因编辑效率高。获得转基因海大麦植株(突变体)，可应用于海大麦基因功能解析等基础研究。
附图说明
图1是本发明的海大麦幼胚剥离操作示意图，具体为：a海大麦幼穗和初步处理后的幼胚材料；b左手镊子尖端夹持固定种子，右手镊子尖端撕扯麦芒扯下整个背部种皮，露出整个幼胚；c左手镊子尖端刺穿1/2胚乳处并始终固定住种子，右手镊子尖端倾斜挤压幼胚上部胚乳，剥离整个幼胚；d将完整幼胚正面朝上轻柔放于愈伤诱导培养基表面；e用镊子尖端逐一对幼胚中央进行横切；
图2是本发明的组培(遗传转化)体系的流程图，具体为：a海大麦幼穗和去除两侧败育小穗的幼胚材料；b剥离出的幼胚；c幼胚诱导培养(黑暗培养第1d)；d愈伤诱导(筛选)培养和增殖(黑暗培养21d)；e愈伤诱导(筛选)培养(黑暗培养60d)；f绿点形成和芽诱导分化(弱光培养14d)；g不定芽的分化和(筛选)培养(弱光培养30d)；h再生苗生根(筛选)培养；
图3是实施例1中田间自然环境(试验A)和人工环境(试验B)下栽培的海大麦marinum亚种材料H508、H559、H560和H761剥离幼胚的生长情况；
图4是实施例1中田间自然环境(试验A)和人工环境(试验B)下栽培的四个海大麦材料幼胚的胚性愈伤诱导分化率和绿点再生率情况，具体为：a)海大麦marinum亚种材料H508、H559、H560和H761在两次独立试验(A和B)中的幼胚胚性愈伤诱导分化率；b)四个材料在弱光培养30d时的绿点再生率；
图5是实施例2中用PCR分子检测方法鉴定阳性苗的琼脂糖凝胶电泳图，引物扩增长度为572bp，第一条是DL5000 marker标记，表明条带位于500和750bp之间指定位置；第二条是阳性对照，即引物扩增载体pUB-Cas9-U6-HmSOS1sgRNA01片段，揭示了目的条带位置和引物特异性，第三条是阴性对照，即以野生型H559的DNA为模板进行扩增未得到目的条带；每行第四条始L1-L23代表转化获得的23株再生苗，检测到阳性条带的共有19株，阳性率为82.6％；
图6是实施例2中获得的阳性苗中纯合突变体靶点附近序列的测序峰图比对结果，表明19株阳性苗中包括1株双等位突变体(L2)和3株纯合突变体(L11，L15和L22)。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的详细说明。应当理解，本发明的实施可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。
在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
相关试剂和药品出处为：
MS基本培养基(不含维生素)，购自美国PhytoTech(M524)；
MS培养基(不含NH4NO3，不含维生素)，购自北京酷来搏(PM1090)；
麦草畏，购自美国Sigma-Aldrich(D5417)；
2，4-D，购自美国Sigma-Aldrich(D7299)；
激动素，购自美国Sigma-Aldrich(K3378)；
潮霉素，购自上海生工(B540725)；
特泯菌，购自上海生工(A600950)；
植物凝胶，购自美国Sigma-Aldrich(P8169)；
其余所述药品和试剂均购自上海生工生物工程股份有限公司。
农杆菌AGL1化学转化感受态(CAT#:AC1020)，购自上海唯地生物有限公司。
实施例一：海大麦marinum亚种材料H508、H559、H560和H761组培再生苗的获得
1、海大麦幼胚材料的选取和灭菌：取来自田间自然环境(试验A)和人工环境(试验B)下栽培的海大麦marinum亚种材料H508、H559、H560和H761的幼穗，选择未成熟的种子饱满、胚乳胶状，半透明，长度为0.5-1.0mm的海大麦幼胚，保留麦芒保持幼胚种皮完整，收集幼胚材料置于无菌的50ml离心管，容积可至刻度20ml处。在超净工作台上对上述种子进行灭菌，操作依次为：先加入40ml 70％酒精上下颠倒30s，用灭菌水冲洗3次，再加入现配的40ml 50％(v/v)次氯酸钠溶液静置2分钟，用灭菌水冲洗2遍，再次加入现配的40ml 50％(v/v)次氯酸钠溶液静置3分钟，用灭菌水反复冲洗5遍，获得无菌外植体。
2、幼胚的分离与愈伤诱导(分解见图1和图2)：取上述步骤中的灭菌种子置于垫有双层无菌滤纸的培养皿盖上，背部朝上，麦芒末端远离操作者。左手镊子尖端夹持固定种子，右手镊子尖端撕扯麦芒扯下整个背部种皮，露出整个幼胚。左手镊子尖端刺穿1/2胚乳处并始终固定住种子，右手镊子尖端倾斜挤压幼胚上部胚乳，剥离整个幼胚。将完整幼胚正面朝上轻柔放于愈伤诱导培养基表面，每皿放80个幼胚为宜，用镊子尖端逐一对幼胚中央进行横切(图3)。22℃黑暗培养7d，用镊子尖端去除少数实生幼芽，继续黑暗培养7d，再次去除实生幼芽和质地柔软的非胚性愈伤。更换新的愈伤诱导培养基后黑暗培养2周，取黄色致密的胚性愈伤，每皿放20个愈伤为宜，22℃黑暗培养4周，每两周更换一次不含潮霉素和特泯菌的愈伤诱导培养基。
3、愈伤的分化和成苗(见图2)：自愈伤见光起，分化和生根诱导阶段全程用单层A4纸遮盖培养皿盖和培养管盖，营造弱光环境；先取步骤2中黄色致密的愈伤块，每皿15个单独的愈伤块为宜，置于分化培养基中弱光培养2周。剔除颜色发白和质地柔软的部分，挑选有绿点分化的小愈伤块转移至新的分化(筛选)培养基中弱光培养3周。待绿点成苗并长至2-3cm时，将其转移至含生根(筛选)培养基的12ml摇菌管(2ml培养基)中，培养3周后根系建成。炼苗时即开盖，加灭菌水至高出液面1cm，在外界环境中适应2d，用自来水洗净根周围的培养基，在1/5霍格兰大麦水培营养液中培养2周，再土培繁殖。
4、根据步骤(2-3)所述需提前配置培养基，其中，
愈伤诱导培养基配置步骤为：配制2×植物凝胶，121℃，20min，高压灭菌。以2×浓度添加其他培养基成分，溶解，1M NaOH调节pH＝5.8，用过滤器灭菌。将2×植物凝胶和2×培养基成分在65℃水浴锅中加热20分钟。混合2×植物凝胶和2×培养基成分。在超净台加入激素和/或抗生素储存液(1000×)，充分摇匀。用50ml无菌离心管量取20ml倒入直径9cm无菌培养皿。
分化和生根培养基配置步骤为：称取培养基成分(包括植物凝胶)于烧杯内溶解，定容，1M NaOH调至pH＝5.8，高压灭菌。在超净台加入激素和抗生素储存液(1000×)，充分摇匀。用50ml无菌离心管量取20ml倒入直径9cm无菌培养皿。若是生根培养基，则需用5ml移液枪吸取2ml培养基加入12ml摇菌管。
所需添加试剂和激素如下(1L)：
a.愈伤诱导培养基：4.3g MS基本培养基(不含维生素)+30g麦芽糖+1.0g干酪素水解物+690mg脯氨酸+350mg肌醇+1.0mg盐酸硫胺+5mg麦草畏+1.25mg CuSO4·5H2O+3.65g植物凝胶，若配置愈伤诱导筛选培养基还需在a的基础上添加200mg特泯菌和25mg潮霉素，1MNaOH调至pH＝5.8；
b.分化培养基：2.7g MS培养基(不含NH4NO3，不含维生素)+25g麦芽糖+825mgNH4NO3+750mg谷氨酰胺+690mg脯氨酸+500mg干酪素水解物+100mg肌醇+0.4mg盐酸硫胺+0.15mg 2,4-D+5mg激动素+1.25mg CuSO4·5H2O+3.4g植物凝胶，若配置分化筛选培养基还需在b的基础上添加200mg特泯菌和15mg潮霉素，1M NaOH调至pH＝5.8；
c.生根培养基：4.3g MS基本培养基(不含维生素)+30g麦芽糖+1.0g干酪素水解物+690mg脯氨酸+350mg肌醇+1.0mg盐酸硫胺+3.2g植物凝胶，若配置生根筛选培养基还需在c的基础上添加160mg特泯菌+10mg潮霉素，1MNaOH调至pH＝5.8。
最初剥离来自田间自然环境(试验A)下的海大麦marinum亚种材料H508、H559、H560和H761分别75、85、82和82个幼胚进行愈伤诱导，培养30d，除去杂菌污染，愈伤致死等坏死幼胚，分别获得24、33、33和8个完整的胚性愈伤，愈伤诱导分化率分别约为32.0％、38.8％、40.2％和9.6％。最初剥离来自人工环境(试验B)下栽培的海大麦marinum亚种材料H508、H559、H560和H761分别87、88、85和85个幼胚进行愈伤诱导，培养30d，除去杂菌污染，愈伤死亡等坏死幼胚，分别获得7、25、21和6个完整的胚性愈伤，愈伤诱导分化率分别约为8.1％、30.7％、25.9％和6.5％(图4a)，表明田间自然栽培条件下的海大麦幼胚材料相比于人工环境下再生活力更强。
分别取H508、H559、H560和H761幼胚诱导产生的22、36、48和8个完整的胚性愈伤进行分化培养，绿点分化率分别约为18.2％、100％、0％和100％(图4b)，最终成苗分别为21、73、0和36株，表明海大麦材料H508、H559和H761幼胚再生活力强。
由上述愈伤诱导率和绿点再生率结果可知，该组培体系高效，普遍适用于海大麦不同材料，marinum亚种材料H559作为优选。
实施例二：农杆菌介导的海大麦H559幼胚遗传转化获得突变体植株
1、海大麦幼胚材料的选取和灭菌：取人工环境下种植的海大麦marinum亚种材料H559的幼穗，选择未成熟的种子饱满、胚乳胶状，半透明，长度为0.5-1.0mm的海大麦幼胚，保留麦芒保持幼胚种皮完整，收集幼胚材料置于无菌的50ml离心管，容积可至刻度20ml处。在超净工作台上对上述种子进行灭菌，操作依次为：先加入40ml 70％酒精上下颠倒30s，用灭菌水冲洗3次，再加入现配的40ml 50％(v/v)次氯酸钠溶液静置2分钟，用灭菌水冲洗2遍，再次加入现配的40ml 50％(v/v)次氯酸钠溶液静置3分钟，用灭菌水反复冲洗5遍，获得无菌外植体。
2、幼胚的分离与愈伤诱导(分解见图1和图2)：取上述步骤中的灭菌种子置于垫有双层无菌滤纸的培养皿盖上，背部朝上，麦芒末端远离操作者。左手镊子尖端夹持固定种子，右手镊子尖端撕扯麦芒扯下整个背部种皮，露出整个幼胚。左手镊子尖端刺穿1/2胚乳处并始终固定住种子，右手镊子尖端倾斜挤压幼胚上部胚乳，剥离整个幼胚。将完整幼胚正面朝上轻柔放于愈伤诱导培养基表面，每皿放80个幼胚为宜，用镊子尖端逐一对幼胚中央进行横切(图3)。22℃黑暗培养7d，用镊子尖端去除少数实生幼芽，继续黑暗培养7d，再次去除实生幼芽和质地柔软的非胚性愈伤，更换新的愈伤诱导培养基后黑暗培养2周。
3、农杆菌侵染与选择培养：取步骤2中黄色致密的胚性愈伤，22℃黑暗环境，预培养1周。提前准备好含目的质粒pUB-Cas9-U6-HmSOS1sgRNA01的农杆菌菌液(MG基本培养液，不含抗生素，OD600＝0.5-0.6)，取直径大小为2-3mm的愈伤块，使用20μl移液枪吸取农杆菌菌液逐个滴加在愈伤中央包裹整个愈伤，立即吸回多余菌液，略微倾斜培养皿置于超净工作台，待多余菌液吹干后，换至新的愈伤诱导培养基，每皿愈伤数量以40个为宜。黑暗环境下共培养36-48h后，减少愈伤数目至每皿20个，更换两轮愈伤诱导筛选培养基，黑暗培养4周；
4、愈伤的分化、成苗和阳性苗检测：自愈伤见光起，分化和生根诱导筛选阶段全程用单层A4纸遮盖培养皿盖和培养管盖，营造弱光环境。先取步骤3中黄色致密的愈伤块，每皿15个单独的愈伤块为宜，置于分化培养基中弱光培养2周。剔除颜色发白、褐化和质地柔软的部分，挑选有绿点分化的小愈伤块转移至新的分化筛选培养基中弱光培养3周。待绿点成苗并长至2-3cm时，将其转移至含生根筛选培养基的12ml摇菌管(2ml培养基)中，培养3周后根系建成。炼苗时即开盖，加灭菌水至高出液面1cm，在外界环境中适应2d，用自来水洗净根周围的培养基，在1/5霍格兰大麦水培营养液中培养2周。取部分叶片提取DNA，PCR检测转基因目的条带，所用引物为
Cas9-F：CCTGGCCCACATGATCAAGT，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，
Cas9-R：TGTACTTCTCAGGCAGCTGC，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，
确定是否为阳性植株。对阳性植株靶点(GAAGACGGCCAGGAGGAGGT，核苷酸序列为SEQ ID No.3)附近序列进行PCR扩增，Sanger法测序检测突变位点，测序引物为
hmsos1sg1F：CCGGCATCCGCATCTGTA，其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，
对突变体进行土培繁殖用于后续研究。
5、培养基配置见实施例一中步骤4。
最初剥离海大麦H559共236个幼胚进行愈伤诱导，除去菌液过量、杂菌污染、愈伤致死等坏死幼胚，至见光阶段留有43个完整愈伤，绿点分化率达到100％，最终获得再生苗23株，提取基因组DNA进行PCR鉴定，共检测到阳性植株19株，阳性率高达82.6％(见图5)。对所有阳性苗靶点附近序列进行PCR扩增和Sanger法测序，峰图比对结果，表明19株阳性苗中包括1株双等位突变体(L2)和3株纯合突变体(L11，L15和L22)，其余株系均为杂合突变，编辑效率高达100％(见图6)。
如图5所示，其中，引物扩增长度为572bp，第一条是DL5000 marker标记，表明条带位于500和750bp之间指定位置；第二条是阳性对照，即引物扩增载体pUB-Cas9-U6-HmSOS1sgRNA01片段，揭示了目的条带位置和引物特异性，第三条是阴性对照，即以野生型DNA为模板进行扩增未得到目的条带；每行第四条始L1-L23代表转化获得的23株再生苗，检测到阳性条带的共有19株，阳性率为82.6％。由此推算，获得10个阳性株系所需初始幼胚约为100个。如图6所示，阳性苗靶点附近序列的测序峰图比对结果，表明19株阳性苗中包括1株双等位突变体(L2)和3株纯合突变体(L11，L15和L22)。其余株系均为杂合突变，编辑效率达100％。
由以上两个实施例实验结果可知，本发明提供的海大麦组培方法和遗传转化体系，高效普适，转化率高和基因编辑效率，可应用于海大麦基因功能研究。
最后，需要注意的是，以上所述仅是本发明的若干具体实施例，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是根据本发明的技术实质对以上实施方式所做的任何简单修改，变形与修饰，均应认为是本发明的保护范围。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 一种农杆菌介导的海大麦遗传转化方法
<130> ZJWL-WGP
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Cas9-F)
<400> 1
cctggcccac atgatcaagt 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Cas9-R)
<400> 2
tgtacttctc aggcagctgc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 阳性植株靶点(Hordeum marinum)
<400> 3
gaagacggcc aggaggaggt 20
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(hmsos1sg1F)
<400> 4
ccggcatccg catctgta 18