Irx3蛋白防治肥胖、代谢炎症及相关疾病中的应用

文档序号：1944234 发布日期：2021-12-10 浏览：7次 >En<

阅读说明：本技术 Irx3蛋白防治肥胖、代谢炎症及相关疾病中的应用 (Application of IRX3 protein in preventing and treating obesity, metabolic inflammation and related diseases ) 是由邱义福姚静斐吴冬梅于 2021-09-10 设计创作，主要内容包括：本发明涉及IRX3蛋白防治肥胖、代谢炎症及相关疾病中的应用。具体地为以巨噬细胞中的IRX3蛋白、表达所述IRX3蛋白的RNA和编码所述IRX3蛋白的基因中的至少一种作为靶点在制备用于预防和/或治疗肥胖、与肥胖相关的疾病、代谢炎症和与代谢炎症相关的疾病中的至少一种的药物中的应用,所述药物靶向巨噬细胞中的所述IRX3蛋白、表达所述IRX3蛋白的RNA和编码所述IRX3蛋白的基因中的至少一种,从而使所述IRX3蛋白在巨噬细胞中的含量降低或功能降低来预防和/或治疗肥胖、与肥胖相关的疾病、代谢炎症和与代谢炎症相关的疾病中的至少一种。(The invention relates to an application of IRX3 protein in preventing and treating obesity, metabolic inflammation and related diseases. In particular to application of at least one of IRX3 protein, RNA expressing the IRX3 protein and a gene encoding the IRX3 protein in macrophages as a target point in preparation of a medicament for preventing and/or treating at least one of obesity, obesity-related diseases, metabolic inflammation and metabolic inflammation-related diseases, wherein the medicament targets at least one of the IRX3 protein, RNA expressing the IRX3 protein and the gene encoding the IRX3 protein in macrophages, so that the content or the function of the IRX3 protein in the macrophages is reduced to prevent and/or treat at least one of obesity, obesity-related diseases, metabolic inflammation and metabolic inflammation-related diseases.)

IRX3蛋白防治肥胖、代谢炎症及相关疾病中的应用

技术领域

本发明涉及肥胖或代谢炎症病领域，特别涉及一种存在于巨噬细胞中的影响肥胖或代谢炎症的蛋白。

背景技术

炎症是机体一种重要防御反应，可以调节及清除各种作用于机体的内源性或外源性损伤因子，同时也具有修复损伤的作用。但过度或持续存在的炎症也会对组织、器官形成伤害。因各种因素所造成的代谢紊乱或者代谢产物异常，称代谢炎症，其参与并导致动脉粥样硬化、糖尿病、非酒精性脂肪肝等多种代谢性疾病的发生。

肥胖的发生发展会引起包括糖尿病，非酒精性脂肪肝病，高血压和动脉粥样硬化等多种代谢疾病，严重威胁人类健康。肥胖的发生主要是由于饮食中的能量摄入没有被完全消耗，从而以甘油三酯的形式将其储存在脂肪组织中。因此肥胖问题最主要的解决办法之一就是调节能量的摄入及输出的平衡，从而减少能量在体内堆积。在不改变能量摄入和基础代谢速率的前提下，增加整个机体的产热量，可以有效地将多余的脂质燃烧，减少脂肪的堆积，从而减轻体重。

IRX3蛋白属于易洛魁蛋白家族成员之一，以往的研究发现，其作为转录因子广泛参与到中枢神经系统、肾脏、心脏、四肢的形态建成及发育过程中。然而，IRX3在其他方面的功能仍有待挖掘。

发明内容

本发明之一提供了以巨噬细胞中的IRX3蛋白、表达所述IRX3蛋白的RNA和编码所述IRX3蛋白的基因中的至少一种作为靶点在制备用于预防和/或治疗肥胖、与肥胖相关的疾病、代谢炎症和与代谢炎症相关的疾病中的至少一种的药物中的应用，所述药物靶向巨噬细胞中的所述IRX3蛋白、表达所述IRX3蛋白的RNA和编码所述IRX3蛋白的基因中的至少一种，从而使所述IRX3蛋白在巨噬细胞中的含量降低或功能降低来预防和/或治疗肥胖、与肥胖相关的疾病、代谢炎症和与代谢炎症相关的疾病中的至少一种。

在一个

具体实施方式

中，所述与肥胖相关的疾病包括II型糖尿病、胰岛素抵抗、非酒精性脂肪肝病、动脉粥样硬化、高血糖、高血脂和高血压中的至少一种；所述与代谢炎症相关的疾病包括II型糖尿病、胰岛素抵抗、非酒精性脂肪肝病、动脉粥样硬化、高血糖、高血脂、关节炎和心肌炎中的至少一种。

在一个具体实施方式中，所述药物为通过RNAi使编码所述IRX3蛋白的基因在巨噬细胞中的表达量降低或沉默的dsRNA。

在一个具体实施方式中，所述药物为通过敲除编码所述IRX3蛋白的基因来沉默所述IRX3蛋白在巨噬细胞中的表达或通过敲低编码所述IRX3蛋白的基因来降低所述IRX3蛋白在巨噬细胞中的表达量的药物。

在一个具体实施方式中，所述药物为通过基因编辑来敲除或敲低编码所述IRX3蛋白的基因的药物。例如，所述药物可以为基于CRISPR/Cas9等系统进行基因编辑来敲除或敲低编码所述IRX3蛋白的基因的的gRNA。

在一个具体实施方式中，所述药物靶向所述IRX3蛋白的S361和/或S389位点，从而使所述S361和/或S389位点去磷酸化。

在一个具体实施方式中，所述药物靶向所述IRX3蛋白的K409位点，从而使所述K409位点泛素化或使所述K409位点的泛素化程度相比与未施用所述药物前增加。

在一个具体实施方式中，所述药物为使所述IRX3蛋白发生S361A和/或S389A突变的药物。例如，所述药物可以为基于CRISPR/Cas9等系统进行基因编辑使IRX3蛋白发生S361A和/或S389A突变的gRNA。

在一个具体实施方式中，所述药物靶向所述IRX3蛋白的聚合体(例如二聚体)，从而使所述聚合体解聚。

在一个具体实施方式中，所述IRX3蛋白为人源蛋白或鼠源蛋白。

本发明之二提供了一种筛选预防和/或治疗肥胖、与肥胖相关的疾病、代谢炎症和与代谢炎症相关的疾病中的至少一种的药物的方法，所述药物靶向巨噬细胞中的所述IRX3蛋白、表达所述IRX3蛋白的RNA和编码所述IRX3蛋白的基因中的至少一种。

在一个具体实施方式中，所述与肥胖相关的疾病包括II型糖尿病、胰岛素抵抗、非酒精性脂肪肝病、动脉粥样硬化、高血糖、高血脂和高血压中的至少一种；所述与代谢炎症相关的疾病包括II型糖尿病、胰岛素抵抗、非酒精性脂肪肝病、动脉粥样硬化、高血糖、高血脂、关节炎和心肌炎中的至少一种。

在一个具体实施方式中，所述药物为通过RNAi使编码所述IRX3蛋白的基因在巨噬细胞中的表达量降低或沉默的dsRNA。

在一个具体实施方式中，所述药物靶向所述IRX3蛋白的S361和/或S389位点，从而使所述S361和/或S389位点去磷酸化。

在一个具体实施方式中，所述药物靶向所述IRX3蛋白的K409位点，从而使所述K409位点泛素化或使所述K409位点的泛素化程度相比与未施用所述药物前增加。

在一个具体实施方式中，所述药物靶向所述IRX3蛋白的聚合体，从而使所述聚合体解聚。

在一个具体实施方式中，所述IRX3蛋白为人源蛋白或鼠源蛋白。

在本发明中，术语gRNA指的是与拟编辑的编码IRX3蛋白的基因中的靶标核酸互补配对的核酸，在设计合成时一般也称为oligos。例如，其可以对应细菌中原CRISPR/Cas9系统的间隔序列(spacer)。

本发明的有益效果：

本发明首次发现脂多糖(LPS)能够通过降低IRX3蛋白上K409位点的泛素化水平来稳定IRX3的蛋白，基于此，在需要提高IRX3蛋白的稳定性时，可以通过使用LPS实现；反之，在需要降低IRX3的蛋白稳定性时，可以通过使IRX3蛋白上K409位点的泛素化来实现。

不同蛋白质的磷酸化具有不同的路径。本发明首次发现LPS能够通过激活JNK1/2激酶的活性使IRX3蛋白中的S361及S389两个位点磷酸化。基于此，在需要提高IRX3蛋白的转录活性时，可以通过使用LPS或激活JNK1/2激酶来实现；在需要降低IRX3蛋白的转录活性时，可以对IRX3蛋白中的S361及S389两个位点进行定点突变，从而降低这两个位点的磷酸化或不再被磷酸化，例如对IRX3蛋白进行S361A及S389A的突变可以使这两个位点不再被磷酸化。

本发明首次发现IRX3相互之间可以形成聚合体，并且聚合体的形成依赖S361和S389位点的磷酸化。基于此，在需要IRX3蛋白聚合体时，可以通过使用LPS或激活JNK1/2激酶来实现；反之，在不需要IRX3蛋白聚合体时，可以通过使IRX3蛋白上S361及S389两个位点去磷酸化或失活JNK1/2激酶来实现。

本发明首次发现巨噬细胞(不论是骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)，还是脂肪组织巨噬细胞(ATM))中的IRX3蛋白能够上调炎症因子的表达，特别是在LPS刺激的情况下，IRX3蛋白能够进一步上调炎症因子的表达。因此，这为治疗因巨噬细胞中炎症因子过度激活导致的有关疾病提供新的治疗靶点。

本发明通过构建敲除巨噬细胞中IRX3基因的小鼠发现该小鼠能够抵抗饮食所诱导的肥胖及例如胰岛素抵抗和/或非酒精性脂肪肝病等与肥胖相关代谢疾病。并且敲除小鼠的体重降低主要是由于其褐色及米色脂肪的产热能力更强，能够消耗更多的能量，从而减少脂质积累。因此这一结果为研究肥胖及其相关的代谢疾病提供了新的理论基础和治疗靶点。

本发明通过使用人源巨噬细胞系THP-1及人原代巨噬细胞hMDMs，证明人源的IRX3蛋白同样能够调节巨噬细胞中炎症因子的表达，并且IRX3蛋白的磷酸化位点S361，S389和泛素化位点K409也高度保守。这说明可以基于此预防和/或治疗人类的肥胖或代谢炎症或有关疾病，并可以基于此筛选用于预防和/或治疗肥胖或代谢炎症或有关疾病的药物。

附图说明

图1.不同时间处理的LPS对IRX3蛋白表达量影响的免疫印迹检测。

图2.MG132、LPS和CHX对IRX3蛋白表达量影响的免疫印迹检测。

图3.IRX3蛋白泛素化位点的免疫检测。IP：免疫沉淀；WCL：全细胞裂解液。

图4.不同时间处理的LPS对IRX3蛋白磷酸化影响的Phos-tag检测。

图5.SP600125和LPS对IRX3蛋白磷酸化影响的Phos-tag检测。

图6.JNK1突变前后对IRX3蛋白磷酸化影响的Phos-tag检测。

图7.JNK1突变前后对炎症因子Il1b和Il6的转录水平影响的实时荧光定量PCR检测。

图8.IRX3突变前后磷酸化的Phos-tag检测。

图9 IRX3蛋白聚合体的免疫检测。IP：免疫沉淀；WCL：全细胞裂解液。

图10.IRX3蛋白突变前后对炎症因子Il1a、Il1b、Il6和Tnf的转录水平影响的实时荧光定量PCR检测。

图11.Irx3^f/f和Irx3^f/fLyz2^Cre小鼠的BMDM中的Irx3以及炎症因子Il1a、Il1b、Il6和Tnf转录水平的实时荧光定量PCR检测。

图12.Irx3^f/f和Irx3^f/fLyz2^Cre小鼠的BMDM经LPS处理后，其中的Irx3以及炎症因子Il1a、Il1b、Il6和Tnf转录水平的实时荧光定量PCR检测。

图13. 22℃和4℃的环境下饲养的Irx3^f/f和Irx3^f/fLyz2^Cre小鼠的ATM中的Irx3以及炎症因子Il1a、Il1b、Il6和Tnf转录水平的实时荧光定量PCR检测。

图14. 22℃和4℃的环境下饲养的Irx3^f/f和Irx3^f/fLyz2^Cre小鼠的scWAT中的炎症因子Il1a、Il1b、Il6和Tnf转录水平的实时荧光定量PCR检测。

图15.Irx3^f/f和Irx3^f/fLyz2^Cre小鼠褐色脂肪组织(BAT)中产热基因Ucp1、Cidea、Ppargc1a、Ppargc1b、Cox8b和Prdm16转录水平的实时荧光定量PCR检测。

图16.Irx3^f/f和Irx3^f/fLyz2^Cre小鼠皮下脂肪组织(scWAT)中产热基因Ucp1、Cidea、Ppargc1a、Ppargc1b、Cox8b和Tbx1转录水平的实时荧光定量PCR检测。

图17.Irx3^f/f和Irx3^f/fLyz2^Cre小鼠在22℃和4℃下氧气消耗量的检测。

图18. 30℃饲养4周的Irx3^f/f和Irx3^f/fLyz2^Cre小鼠在4℃下不同时间体温变化情况。

图19.高脂喂养16周的Irx3^f/f和Irx3^f/fLyz2^Cre小鼠体重变化。

图20.高脂喂养16周的Irx3^f/f和Irx3^f/fLyz2^Cre小鼠不同组织重量。

图21.高脂喂养15周的Irx3^f/f和Irx3^f/fLyz2^Cre小鼠氧气消耗情况检测。

图22.高脂喂养14周的Irx3^f/f和Irx3^f/fLyz2^Cre小鼠胰岛素耐受实验。

图23.高脂喂养13周的Irx3^f/f和Irx3^f/fLyz2^Cre小鼠葡萄糖耐受实验。

图24.高脂喂养16周的Irx3^f/f和Irx3^f/fLyz2^Cre小鼠肝脏油红染色图片。

图25.高脂喂养16周的Irx3^f/f和Irx3^f/fLyz2^Cre小鼠血液中胆固醇的含量检测。

图26.高脂喂养16周的Irx3^f/f和Irx3^f/fLyz2^Cre小鼠肝脏中甘油三酯的含量检测。

图27.人髓系白血病单核细胞系THP-1分化的巨噬细胞中IRX3以及炎症因子IL1A、IL1B、IL6和TNF的转录水平的实时荧光定量PCR检测。

图28.人髓系白血病单核细胞系THP-1分化的巨噬细胞中用shRNA敲低人IRX3后，其中的IRX3以及炎症因子IL1A、IL1B、IL6和TNF转录水平的实时荧光定量PCR检测。

图29.人原代单核细胞来源的巨噬细胞(hMDMs)中过表达人hIRX3后，IRX3及炎症因子IL1A、IL1B、IL6和TNF转录水平的实时荧光定量PCR检测。

图30.人原代单核细胞来源的巨噬细胞(hMDMs)中用shRNA敲低人IRX3后，IRX3及炎症因子IL1A、IL1B、IL6和TNF转录水平的实时荧光定量PCR检测。

图31.不同哺乳动物中IRX3蛋白的部分氨基酸序列的比对结果，其中，361和389为所鉴定的磷酸化位点，409为所鉴定的泛素化位点。

具体实施方式

以下通过优选的实施案例的形式对本发明的上述内容作进一步的详细说明，但其不构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均可通过商业途径购买。

下述实施例中涉及定量的实验，均设置三次重复，结果取平均值。

鼠源IRX3基因序列见genbank登录号NM_008393.3，其编码的氨基酸序列见genbank登录号NP_032419.2。

人源IRX3基因序列见genbank登录号NM_024336.3，其编码的氨基酸序列见genbank登录号NP_077312.2。

小鼠：

基因型为Irx3^flox/flox的小鼠(以下简写为Irx3^f/f或Irx3^flox/flox小鼠)来自于多伦多大学Chi-Chung Hui实验室。

基因型为Lyz2^cre的小鼠(以下简写为Lyz2^cre或Lyz2^cre小鼠)购自杰克森实验室(The Jackson Laboratory)。

将Irx3^flox/flox小鼠与Lyz2^cre小鼠交配，得到基因型为Irx3^flox/floxLyz2^cre小鼠(以下简写为Irx3^f/fLyz2^cre或Irx3^f/fLyz2^cre小鼠)为巨噬细胞中特异性敲除IRX3的小鼠。以与基因型Irx3^f/fLyz2^cre同窝的基因型Irx3^f/f小鼠作为野生型对照组。

所有小鼠饲养于标准独立通气笼(IVC)中，温度22±1℃，湿度40％-60％，12小时昼夜交替，自由获取水和食物，保证环境中无病原体。未进行特殊说明的情况下，喂食标准普通饲料(购自江苏省协同医药生物工程有限责任公司)。所有小鼠均按照北京大学动物管理和使用委员会的规定进行饲养。

细胞系：

RAW 264.7：小鼠单核巨噬细胞白血病细胞；购自ATCC。

HEK 293T：人胚胎肾细胞；购自ATCC。

THP-1：人髓系白血病单核细胞；购自ATCC。

所有细胞在37℃和5％CO₂的环境中生长，2-3天进行一次传代。其中，RAW 264.7和HEK 293T细胞在含有1％青霉素-链霉素，10％胎牛血清(FBS)的高糖DMEM培养基中培养；THP-1细胞在含有1％青霉素-链霉素，10％胎牛血清(FBS)，2mM L-谷氨酰胺，4.5g/L葡萄糖，1mM丙酮酸钠，0.05mM 2-巯基乙醇的1640培养基中培养。

实施例1

LPS能够通过抑制泛素-蛋白酶体途径稳定IRX3从而增加IRX3蛋白水平

1.RAW264.7/pAAV-CAG-IRX3(WT)-Flag瞬时转染细胞的获得

人工合成鼠源IRX3的核酸和与之在3’端融合的Flag标签的融合核酸，得到的融合核酸克隆到pAAV-CAG(Addgene)表达质粒载体上，得到重组表达质粒pAAV-CAG-IRX3(WT)-Flag，以用于过表达带有Flag标签的IRX3蛋白(简写为IRX3、IRX3(WT)或IRX3-Flag)。

培养RAW264.7细胞，当细胞长至>80％的时候，用含有5mM EDTA的PBS悬浮贴壁细胞，得到细胞悬浮液，800rpm离心细胞悬浮液5分钟后弃掉上清，加入培养基充分重悬，进行细胞计数后，按照5×10⁵/ml密度接种至12孔板中。12小时后，待细胞充分贴壁，用lipofectamine 8000按照说明书要求进行质粒转染，每个孔转染0.5μg的pAAV-CAG-IRX3(WT)-Flag质粒。8小时后更换新鲜培养基，得到RAW264.7/pAAV-CAG-IRX3(WT)-Flag瞬时转染细胞。

2.RAW264.7/pAAV-CAG-IRX3(WT)-Flag瞬时转染细胞被LPS处理后的蛋白印迹分析

在RAW264.7/pAAV-CAG-IRX3(WT)-Flag瞬时转染细胞转染24小时后，每个孔加入在细胞培养液中的终浓度为100ng/ml的大肠杆菌脂多糖(大肠杆菌LPS，溶于PBS)。在RAW264.7/pAAV-CAG-IRX3(WT)-Flag瞬时转染细胞被LPS分别处理1、2、4、8和12小时后分别提取总蛋白，然后利用所提取的总蛋白进行免疫印迹。以加入大肠杆菌LPS前RAW264.7/pAAV-CAG-IRX3(WT)-Flag瞬时转染细胞(即0h)为空白对照。

总蛋白的提取：弃去需要提取总蛋白的细胞所在孔内的细胞培养液后，将细胞用预冷的PBS清洗两遍，然后每个孔加入200μl添加了蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液(RIPA裂解液：50mM Tris-HCl pH＝7.5，450mM氯化钠，1％NP-40，0.1％SDS，0.5％脱氧胆酸钠；在RIPA裂解液中的蛋白酶抑制剂组分：5mM NaF，1mM Na₃VO₄，1mM PMSF，1μg/ml亮抑酶肽，0.2μg/ml抑肽酶)。用移液枪充分吹打细胞，得到细胞裂解悬浮液，将细胞裂解悬浮液转移至1.5ml管中，冰上裂解10分钟，13000rpm离心15分钟，将上清转移至新的1.5ml管中，得到总蛋白提取液。

总蛋白的定量：对总蛋白提取液用BCA试剂盒进行总蛋白的定量分析。

蛋白的免疫印迹：使用HSP90作为内参蛋白以标定各个处理下的IRX3(WT)蛋白的上样量。向总蛋白提取液中加入上样缓冲液，95℃加热10分钟，得到蛋白上样样品。待蛋白上样样品冷却后，取30μg上样至10％的聚丙烯酰胺凝胶中进行SDS-PAGE电泳，之后将蛋白电转至NC膜上，并用5％的脱脂奶粉对NC膜封闭。封闭结束后，用TBST洗膜3次，每次5分钟。洗膜结束后分别用一抗稀释液(5000倍稀释Flag抗体、2000倍稀释磷酸化JNK1/2(pJNK1/2)抗体，2000倍稀释JNK1/2，10000倍稀释HSP90抗体)在4℃孵育12小时。然后用TBST洗涤3次，每次五分钟，加入相应的山羊抗小鼠IgG(H+L)二抗或山羊抗兔IgG(H+L)二抗，室温1孵育小时。再用TBST洗膜3次，每次5分钟。最后用翌圣生物科技公司的Super ECL DetectionReagent化学发光超敏显色试剂盒孵育10秒钟，在天能科技有限公司的5200全自动化学发光/荧光图像分析系统上拍照，结果见图1。

图1的结果显示，在LPS不同时间下处理的RAW264.7/pAAV-CAG-IRX3(WT)-Flag瞬时转染细胞中，IRX3(WT)蛋白的含量随着LPS处理时间的延长明显增加，说明LPS能够稳定IRX3(WT)蛋白；此外，JNK1/2蛋白的含量不随LPS处理时间发生变化而保持恒定的量，因此，该实验结果首次证明LPS能够很好的激活RAW264.7/pAAV-CAG-IRX3(WT)-Flag瞬时转染细胞中的炎症信号通路。

3.RAW264.7/pAAV-CAG-IRX3(WT)-Flag瞬时转染细胞被处理后的蛋白印迹分析

将pAAV-CAG-IRX3(WT)-Flag瞬时转染至RAW264.7细胞中，得到RAW264.7/pAAV-CAG-IRX3(WT)-Flag瞬时转染细胞，在转染24小时后，每个孔加入在细胞培养液中的终浓度为100ng/ml的大肠杆菌LPS(溶于PBS))0.5h后，再加入在细胞培养液中的终浓度为50ng/ml的环己酰亚胺(CHX，溶于DMSO)。在RAW264.7/pAAV-CAG-IRX3(WT)-Flag瞬时转染细胞加入CHX前(即0h)以及加入CHX分别处理1、2和4小时后取样并提取总蛋白，然后利用所提取的总蛋白进行免疫印迹。

将pAAV-CAG-IRX3(WT)-Flag瞬时转染至RAW264.7细胞中，得到RAW264.7/pAAV-CAG-IRX3(WT)-Flag瞬时转染细胞，在转染24小时后，每个孔加入在细胞培养液中的终浓度为10ng/ml的蛋白酶体抑制剂MG132(溶于DMSO)0.5h后，再加入在细胞培养液中的终浓度为50ng/ml的CHX。在RAW264.7/pAAV-CAG-IRX3(WT)-Flag瞬时转染细胞加入CHX前(即0h)以及加入CHX分别处理1、2和4小时后取样并提取总蛋白，然后利用所提取的总蛋白进行免疫印迹。

以RAW264.7/pAAV-CAG-IRX3(WT)-Flag瞬时转染细胞先加入DMSO再加入CHX处理作为溶剂载体对照，以Veh表示。即将pAAV-CAG-IRX3(WT)-Flag瞬时转染至RAW264.7细胞中，得到RAW264.7/pAAV-CAG-IRX3(WT)-Flag瞬时转染细胞，在转染24小时后，每个孔加入与上述MG132等体积的DMSO 0.5h后，再加入50ng/ml的CHX。在RAW264.7/pAAV-CAG-IRX3(WT)-Flag瞬时转染细胞加入CHX前(即0h)以及加入CHX分别处理1、2和4小时后取样并提取总蛋白，然后利用所提取的总蛋白进行免疫印迹。

以上总蛋白的定量和蛋白的免疫印迹同本实施例第2小节，不同之处在于，所使用的一抗为5000倍稀释Flag抗体和10000倍稀释HSP90抗体。

免疫印迹结果见图2。

图2的结果显示，用LPS处理RAW264.7/pAAV-CAG-IRX3(WT)-Flag瞬时转染细胞0.5小时后再加入CHX，能够明显减缓IRX3(WT)蛋白的降解，进一步说明LPS能够稳定IRX3(WT)蛋白；RAW264.7/pAAV-CAG-IRX3(WT)-Flag瞬时转染细胞经蛋白酶体抑制剂MG132处理0.5小时后再加入CHX后能够更加明显的抑制IRX3(WT)的降解；RAW264.7/pAAV-CAG-IRX3(WT)-Flag瞬时转染细胞经DMSO处理0.5小时后再加入CHX后，IRX3(WT)蛋白的降解速度明显高于加入大肠杆菌LPS之后再加入CHX的IRX3(WT)蛋白的降解速度而呈现出自然降解速率。说明IRX3(WT)的降解过程主要通过泛素-蛋白酶体途径进行。

实施例2

LPS能够通过K407位点抑制泛素-蛋白酶体途径来稳定IRX3从而增加IRX3蛋白水平

人工合成绿色荧光蛋白(GFP)的核酸和与之在3’端融合的Flag标签的融合核酸，得到的融合核酸克隆到pAAV-CAG(Addgene)表达质粒载体上，得到重组表达质粒pAAV-CAG-GFP-Flag，以用于表达带有Flag标签的GFP蛋白(简写为GPF或GFP-Flag)，将其作为pAAV-CAG-IRX3(WT)-Flag的对照。

人工合成泛素蛋白的核酸(核酸Genbank登录号NM_021009.7)和与之在5’端融合的Myc标签的融合核酸，得到的融合核酸克隆到pAAV-CAG(Addgene)表达质粒载体上，得到重组表达质粒pAAV-CAG-Myc-Ub，以用于表达带有Myc标签的泛素蛋白(简写为Myc-Ub)。

使用一步法PCR定点突变IRX3中的K409R，并构建得到pAAV-CAG-IRX3(K409R)-Flag质粒，以用于表达C端带有Flag标签的K409R位点突变IRX3蛋白(简写为IRX3(K409R))。

将pAAV-CAG-GFP-Flag质粒与pAAV-CAG-Myc-Ub质粒共同转染到RAW264.7细胞中，转染操作同实施例1第1小节，得到RAW264.7/pAAV-CAG-GFP-Flag&pAAV-CAG-Myc-Ub瞬时转染细胞。

将pAAV-CAG-IRX3(WT)-Flag质粒与pAAV-CAG-Myc-Ub质粒共同转染到RAW264.7细胞中，转染操作同实施例1第1小节，得到RAW264.7/pAAV-CAG-IRX3(WT)-Flag&pAAV-CAG-Myc-Ub瞬时转染细胞。

将pAAV-CAG-IRX3(K409R)-Flag质粒与pAAV-CAG-Myc-Ub质粒共同转染到RAW264.7细胞中，转染操作同实施例1第1小节，得到RAW264.7/pAAV-CAG-IRX3(K409R)-Flag&pAAV-CAG-Myc-Ub瞬时转染细胞。

将RAW264.7/pAAV-CAG-GFP-Flag&pAAV-CAG-Myc-Ub瞬时转染细胞、RAW264.7/pAAV-CAG-IRX3(WT)-Flag&pAAV-CAG-Myc-Ub瞬时转染细胞和RAW264.7/pAAV-CAG-IRX3(K409R)-Flag&pAAV-CAG-Myc-Ub瞬时转染细胞分别在转染24小时后，分别加入在细胞培养液中的终浓度为100ng/ml的大肠杆菌LPS，4小时后收集细胞进行免疫沉淀实验，具体操作如下：用免疫共沉淀裂解液(50mM Tris-HCl，120mM NaCl，10％甘油，1％NP-40，5mM EDTA和蛋白酶抑制剂)收集细胞至1.5ml管中，在4℃进行颠倒裂解1小时。12000rpm离心5分钟，将上清转移至新的1.5ml管，取出50μl上清作为全细胞裂解液(WCL)直接进行免疫印记，以用于与免疫沉淀之后的免疫印记进行比较分析；向剩余的上清中加入1μg的Flag抗体，4℃孵育12小时。然后直接加入40μl的rProtein A/G琼脂糖凝胶继续孵育4小时，之后用免疫共沉淀裂解液清洗3次，经最后一次清洗的沉淀加入上样缓冲液后离心取上清，进行蛋白的免疫印记分析。其中，免疫印迹所用的一抗分别为5000倍稀释Flag抗体和2000倍稀释Myc抗体。结果见图3。

图3的结果显示，与RAW264.7/pAAV-CAG-GFP-Flag&pAAV-CAG-Myc-Ub瞬时转染细胞中的GFP相比，RAW264.7/pAAV-CAG-IRX3(WT)-Flag&pAAV-CAG-Myc-Ub瞬时转染细胞中的IRX3(WT)的Myc-Ub泛素化水平更高，并且在LPS处理后明显减弱；而RAW264.7/pAAV-CAG-IRX3(K409R)-Flag&pAAV-CAG-Myc-Ub瞬时转染细胞中的IRX3(K409R)-Flag的Myc-Ub泛素化明显减少，且在LPS的处理下IRX3(K409R)的Myc-Ub泛素化进一步减少。

结合实施例1的实验数据，说明LPS能够通过抑制IRX3蛋白K409位点的泛素化，从而抑制IRX3蛋白的泛素-蛋白酶体降解途径，增加IRX3蛋白量。

实施例3

LPS能够通过JNK1/2激酶磷酸化IRX3蛋白

1.磷酸化标签(Phos-tag)实验

RAW264.7/pAAV-CAG-IRX3(WT)-Flag瞬时转染细胞的获得及被RAW264.7/pAAV-CAG-IRX3(WT)-Flag瞬时转染细胞LPS处理及之后总蛋白提取同实施例1第1小节和第2小节，得到各个处理的总蛋白提取液。

磷酸化标签(Phos-tag)实验操作同实施例1第2小节的蛋白的免疫印迹,不同之处在于：在制备7％聚丙烯酰胺凝胶时，向7％的聚丙烯酰胺分离胶溶液中加入终浓度为40μMphos-tag和终浓度为100μMMnCl₂，然后进行蛋白电泳，得到电泳凝胶，然后用含有5mM EDTA的转膜液洗涤电泳凝胶3次，每次20分钟。之后的转膜、抗体孵育和显色曝光操作同实施例1第2小节的蛋白的免疫印迹，所使用的一抗为5000倍稀释Flag抗体。将Phos-tag实验蛋白分子量较大处进行长时间曝光(即长曝光)，以得到更清晰的高度磷酸化区域的图像。并对各处理的总蛋白提取液直接进行免疫印迹，以用于与phos-tag检测结果进行比较分析，所使用的一抗为5000倍稀释Flag抗体和10000倍稀释HSP90抗体，操作同实施例1第2小节。结果见图4。

根据图4的结果可知，IRX3(WT)蛋白的高度磷酸化在LPS处理的情况下有明显上升，特别在LPS处理2个小时后最为明显。

将pAAV-CAG-IRX3(WT)-Flag瞬时转染至RAW264.7细胞中，得到RAW264.7/pAAV-CAG-IRX3(WT)-Flag瞬时转染细胞，在转染24小时后，每个孔加入在细胞培养液中的终浓度为20μM的JNK1/2激酶抑制剂SP600125(溶于DMSO)处理0.5h，再加入在细胞培养液中的终浓度为100ng/ml的大肠杆菌LPS处理1h后提取总蛋白，进行Phos-tag实验，以LPS+SP600125表示；以只加入大肠杆菌LPS处理1h而未加入SP600125的RAW264.7/pAAV-CAG-IRX3(WT)-Flag瞬时转染细胞为对照，以LPS表示；以及以只加入DMSO处理1.5h而未加入SP600125的RAW264.7/pAAV-CAG-IRX3(WT)-Flag瞬时转染细胞为另外一个对照，以Veh表示。每个处理均为复孔。

蛋白提取同实施例1第1小节和第2小节，得到各个处理的总蛋白提取液。以如上Phos-tag相同的操作进行Phos-tag实验。并对各处理的总蛋白提取液直接进行免疫印迹，操作完全同实施例1第2小节。结果见图5。

根据图5的结果可知，与单独加入LPS相比，在加入20μM JNK1/2激酶抑制剂SP600125处理30分钟之后再加入LPS，IRX3(WT)高度磷酸化水平明显降低。

2.JNK1/2与IRX3蛋白磷酸化的关系

人工合成MKK7蛋白的核酸(核酸Genbank登录号NM_001042557.2)、JNK1蛋白的核酸(核酸Genbank登录号NM_001310452.1)和Flag标签以5’端到3’端融合的融合核酸，得到的融合核酸克隆到pAAV-CAG(Addgene)表达质粒载体上，得到重组表达质粒pAAV-CAG-MKK7-JNK1(WT)-Flag，以用于过表达带有Flag标签的野生型MKK7-JNK1蛋白(简写为JNK1或MKK7-JNK1(WT))。

使用一步法PCR定点突变MKK7-JNK1中的JNK1的T183A和Y185F，并构建得到pAAV-CAG-MKK7-JNK1(APF)-Flag质粒，以用于表达C端带有Flag标签的T183A和Y185F位点突变MKK7-JNK1蛋白(简写为MKK7-JNK1(APF))，其中，MKK7-JNK1(APF)突变蛋白为JNK1激酶的失活形式。

人工合成鼠源IRX3基因和与之在3’端融合的HA标签的融合核酸，得到的融合核酸克隆到pAAV-CAG表达质粒载体上，得到重组表达质粒pAAV-CAG-IRX3(WT)-HA，以用于表达带有HA标签的IRX3蛋白(简写为IRX3、IRX3(WT)或IRX3(WT)-HA)。

人工合成绿色荧光蛋白(GFP)的核酸和与之在3’端融合的HA标签的融合核酸，得到的融合核酸克隆到pAAV-CAG(Addgene)表达质粒载体上，得到重组表达质粒pAAV-CAG-GFP-HA，以用于表达带有HA标签的GFP蛋白(简写为GFP或GFP-HA)，将其作为pAAV-CAG-IRX3(WT)-HA的对照。

将pAAV-CAG-MKK7-JNK1(WT)-Flag质粒与pAAV-CAG-IRX3(WT)-HA共同转染到HEK293T细胞中，转染操作同实施例1第1小节，得到HEK 293T/pAAV-CAG-MKK7-JNK1(WT)-Flag&pAAV-CAG-IRX3(WT)-HA瞬时转染细胞。

将pAAV-CAG-MKK7-JNK1(APF)-Flag质粒与pAAV-CAG-IRX3(WT)-HA质粒共同转染到HEK 293T细胞中，转染操作同实施例1第1小节，得到HEK 293T/pAAV-CAG-MKK7-JNK1(APF)-Flag&pAAV-CAG-IRX3(WT)-HA瞬时转染细胞。

将HEK 293T/pAAV-CAG-MKK7-JNK1(WT)-Flag&pAAV-CAG-IRX3(WT)-HA瞬时转染细胞和HEK293T/pAAV-CAG-MKK7-JNK1(APF)-Flag&pAAV-CAG-IRX3(WT)-HA瞬时转染细胞在转染24小时后分别提取总蛋白。以如上Phos-tag相同的操作用各处理的总蛋白提取液进行Phos-tag实验，免疫印迹所使用的一抗为2000倍稀释HA抗体；并对各处理的总蛋白提取液直接进行免疫印迹，所使用的一抗分别为2000倍稀释HA抗体、2000倍稀释pJNK1/2抗体，2000倍稀释JNK1/2抗体和10000倍稀释HSP90抗体。结果见图6。

图6的结果显示，在HEK 293T/pAAV-CAG-MKK7-JNK1(WT)-Flag&pAAV-CAG-IRX3(WT)-HA瞬时转染细胞中能够检测到磷酸化的JNK1，而在HEK 293T/pAAV-CAG-MKK7-JNK1(APF)-Flag&pAAV-CAG-IRX3(WT)-HA瞬时转染细胞中，仅能检测到未被磷酸化的JNK1，但不能检测到磷酸化的JNK1；并且HEK 293T/pAAV-CAG-MKK7-JNK1(WT)-Flag&pAAV-CAG-IRX3(WT)-HA瞬时转染细胞中的IRX3-HA蛋白的高度磷酸化显著高于HEK 293T/pAAV-CAG-MKK7-JNK1(APF)-Flag&pAAV-CAG-IRX3(WT)-HA瞬时转染细胞中的IRX3-HA蛋白的磷酸化。

将pAAV-CAG-MKK7-JNK1(WT)-Flag质粒与pAAV-CAG-GFP-HA质粒共同转染到RAW264.7/细胞中，转染操作同实施例1第1小节，得到RAW264.7/pAAV-CAG-MKK7-JNK1(WT)-Flag&pAAV-CAG-GFP-HA瞬时转染细胞。

将pAAV-CAG-MKK7-JNK1(APF)-Flag质粒与pAAV-CAG-GFP-HA质粒共同转染到RAW264.7/细胞中，转染操作同实施例1第1小节，得到RAW264.7/pAAV-CAG-MKK7-JNK1(APF)-Flag&pAAV-CAG-GFP-HA瞬时转染细胞。

将pAAV-CAG-MKK7-JNK1(WT)-Flag质粒与pAAV-CAG-IRX3(WT)-HA质粒共同转染到RAW264.7/细胞中，转染操作同实施例1第1小节，得到RAW264.7/pAAV-CAG-MKK7-JNK1(WT)-Flag&pAAV-CAG-IRX3(WT)-HA瞬时转染细胞。

将pAAV-CAG-MKK7-JNK1(APF)-Flag质粒与pAAV-CAG-IRX3(WT)-HA质粒共同转染到RAW264.7/细胞中，转染操作同实施例1第1小节，得到RAW264.7/pAAV-CAG-MKK7-JNK1(APF)-Flag&pAAV-CAG-IRX3(WT)-HA瞬时转染细胞。

将RAW264.7/pAAV-CAG-MKK7-JNK1(WT)-Flag&pAAV-CAG-GFP-HA瞬时转染细胞、RAW264.7/pAAV-CAG-MKK7-JNK1(APF)-Flag&pAAV-CAG-GFP-HA、RAW264.7/pAAV-CAG-MKK7-JNK1(WT)-Flag&pAAV-CAG-IRX3(WT)-HA瞬时转染细胞和RAW264.7/pAAV-CAG-MKK7-JNK1(APF)-Flag&pAAV-CAG-IRX3(WT)-HA瞬时转染细胞在分别转染24小时后用TRIzol法提取RNA，最后将所提取的RNA溶于超纯水中是RNA的浓度为1μg/ml。以所提取的RNA为模板，按照abm公司的5×All-In-One RT MasterMix试剂盒说明进行反转录，得到的cDNA用100μl超纯水进行稀释。实时荧光定量PCR用96孔板，每个样品2个复孔。每个孔按照abm公司的EvaGreen 2×qPCR MasterMix-ROX试剂盒所述进行加样。用ABI公司的StepOnePlus仪器进行实时定量检测。其中，以SEQ ID No.1和SEQ ID No.2为引物对检测Il1b基因的转录水平，以SEQ ID No.3和SEQ ID No.4为引物对检测Il6基因的转录水平，以SEQ ID No.5和SEQ IDNo.6为引物对检测内参36B4的转录水平。结果见图7。

通过图7的显示的实时荧光定量PCR检测结果可知，与失活形式的MKK7-JNK1(APF)相比，野生型MKK7-JNK1(WT)能够通过激活IRX3蛋白进而促进炎症因子Il1b和Il6的转录水平。

以上数据表明，LPS能够通过激活JNK1/2，从而增加IRX3的高度磷酸化水平，即IRX3能够被LPS激活的JNK1/2激酶所磷酸化；进而IRX3能够影响炎症因子的转录与表达。

实施例4

1.IRX3的磷酸化位点

使用一步法PCR定点突变IRX3中的S361A，并构建得到pAAV-CAG-IRX3(S361A)-Flag质粒，以用于表达C端带有Flag标签的S361A位点突变IRX3蛋白(简写为IRX3(S361A)或IRX3(S361A)-Flag)。

使用一步法PCR定点突变IRX3中的S361A，并构建得到pAAV-CAG-IRX3(S361A)-HA质粒，以用于表达C端带有HA标签的S361A位点突变IRX3蛋白(简写为IRX3(S361A)或IRX3(S361A)-HA)。

使用一步法PCR定点突变IRX3中的S389A，并构建得到pAAV-CAG-IRX3(S389A)-Flag质粒，以用于表达C端带有Flag标签的S389A位点突变IRX3蛋白(简写为IRX3(S389A)或IRX3(S389A)-Flag)。

使用一步法PCR定点突变IRX3中的S389A，并构建得到pAAV-CAG-IRX3(S389A)-HA质粒，以用于表达C端带有HA标签的S389A位点突变IRX3蛋白(简写为IRX3(S389A)或IRX3(S389A)-HA)。

将pAAV-CAG-IRX3(WT)-Flag质粒、pAAV-CAG-IRX3(S361A)-Flag质粒和pAAV-CAG-IRX3(S389A)-Flag质粒分别转染到RAW264.7细胞中，转染操作同实施例1第1小节，分别得到RAW264.7/pAAV-CAG-IRX3(WT)-Flag瞬时转染细胞、RAW264.7/pAAV-CAG-IRX3(S361A)-Flag瞬时转染细胞和RAW264.7/pAAV-CAG-IRX3(S389A)-Flag瞬时转染细胞。

将RAW264.7/pAAV-CAG-IRX3(WT)-Flag瞬时转染细胞、RAW264.7/pAAV-CAG-IRX3(S361A)-Flag瞬时转染细胞和RAW264.7/pAAV-CAG-IRX3(S389A)-Flag瞬时转染细胞分别在转染24小时后，分别加入在细胞培养液中的终浓度为100ng/ml的大肠杆菌LPS(即LPS+)，4小时后收集细胞，进行总蛋白提取，同实施例1第1小节和第2小节，得到各个处理的总蛋白提取液。利用各个处理的总蛋白提取液进行Phos-tag实验，操作同实施例3，所使用的一抗为5000倍稀释Flag抗体；并利用各处理的总蛋白提取液直接进行免疫印迹，其中，所使用的一抗分别为5000倍稀释Flag抗体、2000倍稀释pJNK1/2抗体、2000倍稀释JNK1/2抗体和10000倍稀释HSP90抗体。以加入大肠杆菌LPS前RAW264.7/pAAV-CAG-IRX3(WT)-Flag瞬时转染细胞(即LPS-)、加入大肠杆菌LPS前RAW264.7/pAAV-CAG-IRX3(S361A)-Flag瞬时转染细胞(即LPS-)和加入大肠杆菌LPS前RAW264.7/pAAV-CAG-IRX3(S389A)-Flag瞬时转染细胞(即LPS-)为对照。结果见图8。

图8的结果显示，不论RAW264.7/pAAV-CAG-IRX3(S361A)-Flag瞬时转染细胞或RAW264.7/pAAV-CAG-IRX3(S389A)-Flag瞬时转染细胞是否经过LPS处理，其中的IRX3高度磷酸化水平显著降低。

将pAAV-CAG-IRX3(WT)-Flag质粒和pAAV-CAG-IRX3(WT)-HA质粒共同转染到RAW264.7细胞中，将pAAV-CAG-IRX3(S361A)-Flag质粒和pAAV-CAG-IRX3(S361A)-HA质粒共同转染到RAW264.7细胞中，将pAAV-CAG-IRX3(S389A)-Flag质粒和pAAV-CAG-IRX3(S389A)-HA质粒共同转染到RAW264.7细胞中，转染操作同实施例1第1小节，分别得到RAW264.7/pAAV-CAG-IRX3(WT)-Flag&pAAV-CAG-IRX3(WT)-HA瞬时转染细胞、RAW264.7/pAAV-CAG-IRX3(S361A)-Flag&pAAV-CAG-IRX3(S361A)-HA瞬时转染细胞和RAW264.7/pAAV-CAG-IRX3(S389A)-Flag&pAAV-CAG-IRX3(S389A)-HA瞬时转染细胞。将这三种细胞在转染24小时后，将每种细胞分为两组，其中一组均不加入LPS，即LPS-；另一组则分别加入在细胞培养液中的终浓度为100ng/ml的大肠杆菌LPS(即LPS+)，4小时后收集细胞，制备全细胞裂解液(WCL)。将所得到的全细胞裂解液分为两部分，其中一部分用于免疫沉淀及免疫沉淀之后的免疫印迹，另一部分直接进行免疫印记，以用于与免疫沉淀之后的免疫印记进行比较分析。其中，免疫沉淀实验的操作同实施例2中的免疫沉淀实验。免疫印迹同实施例1第2小节的蛋白的免疫印迹，其中，所使用的一抗分别为5000倍稀释Flag抗体和2000倍稀释HA抗体。结果见图9。

图9的免疫印迹结果显示，经LPS处理的RAW264.7/pAAV-CAG-IRX3(WT)-Flag&pAAV-CAG-IRX3(WT)-HA瞬时转染细胞，IRX3(WT)-Flag能够与IRX3(WT)-HA共沉淀，而没有被LPS处理的RAW264.7/pAAV-CAG-IRX3(WT)-Flag&pAAV-CAG-IRX3(WT)-HA瞬时转染细胞，IRX3(WT)-Flag与IRX3(WT)-HA不能共沉淀；同时，无论是否经LPS处理，IRX3(S361A)-Flag与IRX3(S361A)-HA以及IRX3(S389A)-Flag和IRX3(S389A)-HA均不能发生共沉淀。这些结果说明IRX3自身形成聚合体需要S361及S389两个位点的磷酸化且同时需要经LPS处理。

2.IRX3的转录功能

将pAAV-CAG-GFP-Flag质粒、pAAV-CAG-IRX3(WT)-Flag质粒、pAAV-CAG-IRX3(S361A)-Flag和pAAV-CAG-IRX3(S389A)-Flag分别瞬时转染到RAW264.7细胞中，转染操作同实施例1第1小节，分别得到RAW264.7/pAAV-CAG-GFP-Flag瞬时转染细胞、RAW264.7/pAAV-CAG-IRX3(WT)-Flag瞬时转染细胞、RAW264.7/pAAV-CAG-IRX3(S361A)-Flag瞬时转染细胞和RAW264.7/pAAV-CAG-IRX3(S389A)-Flag瞬时转染细胞。

将RAW264.7/pAAV-CAG-GFP-Flag瞬时转染细胞、RAW264.7/pAAV-CAG-IRX3(WT)-Flag瞬时转染细胞、RAW264.7/pAAV-CAG-IRX3(S361A)-Flag瞬时转染细胞和RAW264.7/pAAV-CAG-IRX3(S389A)-Flag瞬时转染细胞在转染24小时后用TRIzol法提取RNA，然后进行反转录及实时荧光定量PCR检测。其中，按照abm公司的5×All-In-One RT MasterMix试剂盒说明进行反转录。实时荧光定量PCR用96孔板，每个样品2个复孔。每个孔按照abm公司的EvaGreen 2×qPCR MasterMix-ROX试剂盒所述进行加样。以SEQ ID No.7和SEQ ID No.8为引物对检测Il1a基因的转录水平，以SEQ ID No.1和SEQ ID No.2为引物对检测Il1b基因的转录水平，以SEQ ID No.3和SEQ ID No.4为引物对检测Il6基因的转录水平，以SEQ IDNo.9和SEQ ID No.10为引物对检测Tnf基因的转录水平，以SEQ ID No.5和SEQ ID No.6为引物对检测内参36B4的转录水平。结果见图10。

图10的结果显示，与表达GFP的RAW264.7/pAAV-CAG-GFP-Flag瞬时转染细胞相比，表达IRX3(WT)的RAW264.7/pAAV-CAG-IRX3(WT)-Flag瞬时转染细胞中的Il1a、Il1b、Il6和Tnf症因子的转录水平明显增加了，说明IRX3(WT)能够明显促进Il1a、Il1b、Il6和Tnf炎症因子的转录；而表达IRX3(S361A)的RAW264.7/pAAV-CAG-IRX3(S361A)-Flag瞬时转染细胞和表达IRX3(S389A)的RAW264.7/pAAV-CAG-IRX3(S389A)-Flag瞬时转染细胞中的Il1a、Il1b、Il6和Tnf炎症因子的转录水平相比于RAW264.7/pAAV-CAG-IRX3(WT)-Flag瞬时转染细胞大大减弱了。

以上结果说明，JNK1/2主要对IRX3蛋白上S361及S389位点进行磷酸化修饰，并且这两个位点的磷酸化对于IRX3形成聚合体及炎症因子的调控功能至关重要。

实施例5

来源于小鼠体内巨噬细胞中的IRX3具有同样的促炎因子调节功能

通过cre-Loxp系统构建了巨噬细胞特异性敲除IRX3的小鼠模型(Irx3^f/fLyz2^cre)。首先分别分离小鼠Irx3^f/fLyz2^cre及其对照小鼠Irx3^f/f骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)来验证之前的结果，具体分离操作如下：将从小鼠股骨和胫骨分离出来的骨髓混合，用PBS充分悬浮，得到PBS骨髓悬浮液。将PBS骨髓悬浮液用GE Healthcare公司的Ficoll-Paque^TM PLUSMedia在22℃下以1800rpm的速度进行梯度离心20min，然后自然降速。得到的Ficoll层细胞悬液加入等体积PBS稀释清洗，1000rpm离心5分钟后，弃去上清，将沉淀用BMDM培养基(10％FBS，1％青/链霉素，20ng/ml MCSF的高糖DMEM)重悬，铺板至培养皿中进行培养。细胞培养箱温度设置为37℃，二氧化碳浓度设置为5％。之后分别在第3天，第5天进行换液。分化至第7天，得到巨噬细胞，此时，用含有5mM EDTA的PBS将贴壁细胞悬浮并离心，然后将细胞用BMDM培养基重悬，按照5×10⁵/ml密度接种至12孔板中，12小时后细胞充分贴壁，将细胞分为两组，一组加入100ng/ml的大肠杆菌LPS处理4个小时，另一组不加入LPS作为对照(Ctrl)。收集细胞、RNA提取、反转录及实时荧光定量PCR检测，同实施例2。其中，以SEQ IDNo.11和SEQ ID No.12为引物对检测Irx3基因的转录水平，以SEQ ID No.7和SEQ ID No.8为引物对检测Il1a基因的转录水平，以SEQ ID No.1和SEQ ID No.2为引物对检测Il1b基因的转录水平，以SEQ ID No.3和SEQ ID No.4为引物对检测Il6基因的转录水平，以SEQ IDNo.9和SEQ ID No.10为引物对检测Tnf基因的转录水平，以SEQ ID No.5和SEQ ID No.6为引物对检测内参36B4的转录水平。不加LPS的对照组(Ctrl)的结果见图11，加LPS处理组的结果见图12。

图11和图12的结果显示，Irx3在Irx3^f/fLyz2^cre小鼠的BMDM中的转录水平明显降低，说明有很好的敲除效果；并且无论是否经LPS处理，来源于敲除Irx3小鼠的巨噬细胞BMDM中的炎症因子Il1a、Il1b、Il6和Tnf的转录水平都要低于来源于Irx3^f/f小鼠的巨噬细胞。

为了进一步验证上述结果，分离了小鼠脂肪组织巨噬细胞(ATM)，具体操作如下：将Irx3^f/f和Irx3^f/fLyz2^cre小鼠随机分成两组，其中一组在22℃的环境中饲养(以RT表示)，另一组放入4℃的环境中饲养2天(以Cold表示)。两天后将两组小鼠脱颈处死，分别取出小鼠皮下脂肪组织，并分别充分剪碎，然分别加入含有2mg/ml I型胶原酶的SVF缓冲液(1.1mMCaCl₂，2.7mM KCl，118mM NaCl，0.5mM MgCl₂，0.4mM NaH₂PO₄，20mM HEPES，5.5mM Glucose，1％BSA)，37℃，100rpm消化45分钟。消化后的悬液1500rpm离心5分钟，沉淀用PBS重悬后，经过75μM的滤网过滤。离心后弃去上清，加入5ml红细胞裂解液裂解5分钟，等体积PBS稀释后经过45μM的滤网过滤。离心5分钟后用MACS缓冲液(PBS缓冲液中加入终浓度为2mM EDTA和0.5％BSA)重悬，加入抗F4/80-Biotin的一抗4℃孵育10分钟，再加入链霉亲和素微球(Streptavidin MicroBeads)孵育20分钟，然后用Miltenyi Biotec公司的MACS分选套装进行细胞分选，将得到的ATM直接加入TRIzol裂解，进行RNA提取、反转录及实时荧光定量PCR检测，同实施例2。以SEQ ID No.11和SEQ ID No.12为引物对检测Irx3基因的转录水平，以SEQ ID No.7和SEQ ID No.8为引物对检测Il1a基因的转录水平，以SEQ ID No.1和SEQ IDNo.2为引物对检测Il1b基因的转录水平，以SEQ ID No.3和SEQ ID No.4为引物对检测Il6基因的转录水平，以SEQ ID No.9和SEQ ID No.10为引物对检测Tnf基因的转录水平，以SEQID No.5和SEQ ID No.6为引物对检测内参36B4的转录水平。结果见图13。

图13的检测结果显示，无论是22℃环境饲养的小鼠的ATM还是4℃饲养的小鼠的ATM，在敲除Irx3后的Irx3^f/fLyz2^cre小鼠中，炎症因子Il1a、Il1b、Il6和Tnf的转录水平均明显低于Irx3^f/f小鼠。

将22℃饲养及4℃饲养2天的小鼠的整个皮下脂肪组织(scWAT)取出，分别加入TRIzol打碎后进行RNA提取、反转录及实时荧光定量PCR检测，同实施例2。以SEQ ID No.7和SEQ ID No.8为引物对检测Il1a基因的转录水平，以SEQ ID No.1和SEQ ID No.2为引物对检测Il1b基因的转录水平，以SEQ ID No.3和SEQ ID No.4为引物对检测Il6基因的转录水平，以SEQ ID No.9和SEQ ID No.10为引物对检测Tnf基因的转录水平，以SEQ ID No.5和SEQ ID No.6为引物对检测内参36B4的转录水平。结果见图14，同样地，敲除Irx3后的Irx3^f ^/fLyz2^cre小鼠在4℃饲养下，其scWAT中的炎症因子Il1a、Il1b、Il6和Tnf的转录水平均相应地明显低于4℃饲养下的Irx3^f/f小鼠scWAT中的炎症因子Il1a、Il1b、Il6和Tnf的转录水平；22℃环境饲养的小鼠的scWAT，敲除Irx3后的Irx3^f/fLyz2^cre小鼠在22℃饲养下，其scWAT中的炎症因子Il1a、Il1b、Il6和Tnf的转录水平相对于22℃饲养下的Irx3^f/f小鼠，也有降低的趋势。

实施例6

1.IRX3敲除的小鼠脂肪组织产热能力

脂肪组织对于维持小鼠正常的生理功能也是不可或缺的一部分。例如，在寒冷刺激下，小鼠背部的褐色脂肪组织和皮下脂肪组织，能够通过线粒体上的解偶联蛋白UCP-1消耗能量进行产热，维持寒冷条件下的机体体温。炎症因子如TNF，IL1b能够抑制脂肪细胞的UCP-1表达，从而抑制脂肪组织产热。而实施例4中敲除Irx3的脂肪组织中的炎症因子的转录水平下降。基于以上事实推测Irx3^f/fLyz2^cre小鼠的脂肪组织产热能力可能会有上升。

将Irx3^f/f小鼠(对照)和Irx3^f/fLyz2^cre小鼠于4℃环境中饲养2天，之后分别取出其肩胛处褐色脂肪组织(BAT)和皮下脂肪组织(scWAT)，并分别加入TRIzol打碎后进行RNA提取、反转录及实时荧光定量PCR检测，同实施例2。其中通过荧光定量PCR检测Ucp1(所使用的引物对为SEQ ID No.13和SEQ ID No.14)、Cidea(所使用的引物对为SEQ ID No.15和SEQID No.16)、Ppargc1a(所使用的引物对为SEQ ID No.17和SEQ ID No.18)、Ppargc1b(所使用的引物对为SEQ ID No.19和SEQ ID No.20)、Cox8b(所使用的引物对为SEQ ID No.21和SEQ ID No.22)、Prdm16(所使用的引物对为SEQ ID No.23和SEQ ID No.24)和Tbx1(所使用的引物对为SEQ ID No.25和SEQ ID No.26)产热基因的转录水平。褐色脂肪组织(BAT)中的结果见图15，皮下脂肪组织(scWAT)中的结果见图16。

图15和图16的检测结果显示，无论在褐色脂肪组织还是皮下脂肪组织中，Irx3^f/ ^fLyz2^cre小鼠中Ucp1、Cidea、Ppargc1a、Ppargc1b和Cox8b产热基因的转录水平整体要高于Irx3^f/f小鼠。

在小鼠整体水平上，更高的产热水平对应着更多的氧气消耗，因此可以用CLAMS检测小鼠氧气消耗量来反映小鼠的产热情况。将Irx3^f/f小鼠(对照)和Irx3^f/fLyz2^cre小鼠单笼单只放入CLAMS检测笼中，给予正常的饮食及饮水，22℃环境温度下适应24小时后正式记录氧气消耗量2天，其中，第一天(0-24h)设置环境温度为22℃，第二天(24h-48h)将环境温度切换到4℃。结果见图17。

图17的结果显示，无论是在22℃还是在4℃下，Irx3^f/fLyz2^cre小鼠的氧气消耗能力都要显著高于Irx3^f/f小鼠对照小鼠，说明其产热能力更强。

以上结果证实与推测结果一致。

2.通过检测小鼠的核心体温(肛温)来分析寒冷刺激的情况下产热情况

用肛温仪测量在30℃饲养4周的Irx3^f/f小鼠和Irx3^f/fLyz2^cre小鼠肛温(即作为转入4℃环境的0h的温度)，然后单笼单只的直接转移至4℃环境中，每隔1小时检测一次肛温，当小鼠体温低于30℃时停止检测并将其处死。结果见图18。

图18的结果显示，在未进行寒冷刺激时(0小时)，两种基因型小鼠肛温没有明显差别，但是在进行4℃寒冷刺激后，与对照Irx3^f/f小鼠相比，Irx3^f/fLyz2^cre小鼠核心体温下降更加缓慢，说明其产热能力更强，能够更好地维持体温。

这些结果表明，IRX3能够通过巨噬细胞调节脂肪组织的产热功能，从而维持机体在寒冷情况下的体温。

实施例7

在高脂诱导的肥胖下，IRX3敲除小鼠具有更好地抵抗肥胖及改善相关代谢疾病的能力

将Irx3^f/f小鼠和Irx3^f/fLyz2^cre小鼠从6周龄开始喂食高脂食物(HFD)，其他饲养条件不变，之后每周进行体重的测量，测量至22周龄，然后将小鼠处死后，取出包括褐色脂肪组织、皮下脂肪组织、性腺周脂肪组织在内的脂肪组织及肝脏组织分别进行称重。结果见图19至图20。

图19的结果显示，在喂食高脂后，对照Irx3^f/f小鼠的体重明显增加，而Irx3^f/ ^fLyz2^cre小鼠体重增加的幅度要显著小于Irx3^f/f小鼠。图20的结果显示，Irx3^f/fLyz2^cre小鼠体重减轻主要由于脂肪组织和肝脏组织减少导致。

将Irx3^f/f小鼠和Irx3^f/fLyz2^cre小鼠从6周龄开始，喂食15周高脂食物，其他饲养条件不变，然后将Irx3^f/f小鼠和Irx3^f/fLyz2^cre小鼠单笼单只放入CLAMS检测笼中，给予正常的饮食及饮水，22℃环境温度下适应24小时后连续记录氧气消耗量24小时。结果见图21。

图21的结果显示Irx3^f/fLyz2^cre小鼠比Irx3^f/f小鼠氧气消耗更多，说明其产热能力更强。

将Irx3^f/f小鼠和Irx3^f/fLyz2^cre小鼠从6周龄开始，喂食13周高脂食物，其他饲养条件不变，然后进行胰岛素耐受实验(ITT)，操作如下：将两种基因型的小鼠饥饿6小时，然后腹腔注射1.5U/kg体重的胰岛素，分别在注射前(即0min)以及注射后15、30、60、90和120min采集小鼠尾尖血，用血糖仪检测血糖水平变化。结果见图22。

图22的结果显示，Irx3^f/f小鼠和Irx3^f/fLyz2^cre小鼠的血糖在注射胰岛素后均有明显的降低，但Irx3^f/fLyz2^cre小鼠的血糖降低更加明显，说明其对于胰岛素的响应更好。

将Irx3^f/f小鼠和Irx3^f/fLyz2^cre小鼠从6周龄开始，喂食14周高脂食物，其他饲养条件不变，然后进行葡萄糖耐受实验(GTT)，操作如下：将两种基因型的小鼠过夜饥饿14小时，然后腹腔注射2g/kg体重的D(+)-葡萄糖，分别在注射前(即0min)以及注射后15、30、60、120和150分钟，采集小鼠尾尖血，用血糖仪检测血糖水平变化。结果见图23。

图23的结果显示，Irx3^f/f小鼠和Irx3^f/fLyz2^cre小鼠的血糖在注射葡萄糖30分钟后都有明显的上升，但是Irx3^f/fLyz2^cre小鼠的血糖上升的幅度更低，并且在60分钟后，Irx3^f/ ^fLyz2^cre小鼠更早的出现下降趋势，这一结果说明Irx3^f/fLyz2^cre小鼠具有更好地控制血糖的能力。

Irx3^f/f小鼠和Irx3^f/fLyz2^cre小鼠从6周龄开始喂食高脂食物16周后，处死小鼠，打开腹腔，取出新鲜肝脏组织，将肝脏组织切成小块放入冰冻切片包埋剂中，液氮速冻15秒，然后放入-20℃冰冻切片机中进行切片。将切片附着在载玻片上，用PBS洗去包埋剂，然后用60％异丙醇浸泡2分钟，再用油红O进行染色10分钟。染色结束后用60％异丙醇清洗3次，用显微镜进行成像。结果见图24。

图24的结果显示，与Irx3^f/f小鼠相比，Irx3^f/fLyz2^cre小鼠的肝脏组织中具有更少的脂滴累积。

Irx3^f/f小鼠和Irx3^f/fLyz2^cre小鼠从6周龄开始喂食高脂食物16周后，用采血毛细管采集小鼠眼眶血，3000g离心10分钟后，取上层血清测胆固醇的含量，结果见图25。采血后处死小鼠，打开腹腔，取出新鲜肝脏组织，加入甘油三酯提取缓冲液(250mM sucrose,50mMtris pH 7.4)进行研磨。然后13000rpm离心10分钟，取上清测甘油三脂的含量，结果见图26。其中，甘油三酯和胆固醇的检测使用中生北控公司的检测试剂盒，按照说明书进行操作。

图25和图26的结果显示，与Irx3^f/f小鼠的胆固醇含量和甘油三脂含量相比，Irx3^f ^/fLyz2^cre小鼠的胆固醇含量和甘油三脂含量均更低，说明在高脂饮食的情况下，敲除IRX3也能够减少肝脏中的脂质积累及血脂水平。

这些数据表明，巨噬细胞中的IRX3对于饮食诱导的肥胖及相关的糖脂代谢异常具有明显的调节作用。

实施例8

IRX3在人的巨噬细胞中具有类似功能

人工合成人源IRX3基因和与之在3’端融合的Flag标签的融合核酸，得到的融合核酸克隆到pAAV-CAG-GFP(来自Addgene编号#37825)表达质粒载体上，得到重组表达质粒pAAV-CAG-hIRX3-Flag，以用于表达带有Flag标签的人源IRX3蛋白(简写为hIRX3)。

用人髓系白血病单核细胞THP-1，加入丙二醇甲醚醋酸酯(PMA)处理2天将其分化成为人源巨噬细胞(THP-1-M)，然后用P3 Primary Cell 4D-Nucleofector^TM X Kit试剂盒，及Nucleofector 4D X-unit device电转仪，将pAAV-CAG-hIRX3-Flag质粒电转进入人源巨噬细胞中，得到THP-1-M/pAAV-CAG-hIRX3-Flag瞬时转染细胞。

用P3 Primary Cell 4D-Nucleofector^TM X Kit试剂盒，及Nucleofector 4D X-unit device电转仪，将pAAV-CAG-GFP-Flag质粒电转进入人源巨噬细胞中，得到THP-1-M/pAAV-CAG-GFP-Flag瞬时转染细胞，以作为对照。

将上述瞬时转染细胞在转染后培养12小时后用TRIzol法提取RNA。并以所提取的RNA为模板，按照abm公司的5×All-In-One RT MasterMix试剂盒说明进行反转录及实时荧光定量PCR实验，同实施例2。其中，荧光定量PCR检测IRX3(所使用的引物对为SEQ ID No.27和SEQ ID No.28)、IL1A(所使用的引物对为SEQ ID No.29和SEQ ID No.30)、IL1B(所使用的引物对为SEQ ID No.31和SEQ ID No.32)、IL6(所使用的引物对为SEQ ID No.33和SEQID No.34)和TNF(所使用的引物对为SEQ ID No.35和SEQ ID No.36)基因的转录水平。以GAPDH(所使用的引物对为SEQ ID No.37和SEQ ID No.38)作为内参。结果见图27。

图27的结果显示，THP-1-M/pAAV-CAG-hIRX3-Flag瞬时转染细胞中的炎症因子IL1A、IL1B、IL6和TNF的转录水平比THP-1-M/pAAV-CAG-GFP-Flag瞬时转染细胞中的相应的炎症因子的转录水平更高。可见，其与实施例3鼠源IRX3的实时荧光定量PCR的趋势一致。

敲低实验，将人源巨噬细胞THP-1-M细胞中分别电转电转入SHC001(空白对照质粒，Ctrl)、TRCN0000016899(shRNA#1)和TRCN0000016901(shRNA#2)，分别得到THP-1-M/Ctrl瞬时转染细胞，THP-1-M/shRNA#1瞬时转染细胞和THP-1-M/shRNA#2瞬时转染细胞。其中，三种质粒均购自美国Sigma-Aldrich公司，shRNA#1和shRNA#2为不同序列的hIRX3的shRNA质粒。在转染12小时后，用TRIzol法提取RNA。并以所提取的RNA为模板，进行反转录和实时荧光定量PCR，同实施例2。所用引物同实施例7，检测IRX3、IL1A、IL1B、IL6和TNF基因的转录水平。结果见图28。

图28的结果显示，与THP-1-M/Ctrl相比，在THP-1-M/shRNA#1细胞和THP-1-M/shRNA#2细胞中，即在敲低hIRX3的人源巨噬细胞中，炎症因子IL1A、IL1B、IL6和TNF的转录水平明显下降。

招募5名受试者进行采血，分别加入抗凝剂，然后用GE Healthcare公司的Ficoll-Paque^TM PLUS Media进行梯度离心(750g，20min，22℃，自然降速)，得到的外周血单个核细胞(PBMC)用Miltenyi Biotech公司的Pan Monocyte Isolation Kit试剂盒进行单核细胞的分离(monocytes)。得到的单核细胞用含有10％FBS，1％青/链霉素，2mM谷氨酰胺，1％丙酮酸钠，1％非必需氨基酸和20ng/ml human-MCSF的RPMI 1640培养基重悬，在5％二氧化碳的37℃培养箱中培养。每两天进行一次换液，第7天即可分别分化成为人外周血单核细胞来源的巨噬细胞hMDMs。将来自该5名受试者的分化好的hMDMs细胞混合之后分为五份分别电转pAAV-CAG-GFP-Flag质粒、pAAV-CAG-hIRX3-Flag质粒、SHC001(空白对照质粒，Ctrl)、TRCN0000016899(shRNA#1)和TRCN0000016901(shRNA#2)，分别得到hMDMs/pAAV-CAG-GFP-Flag瞬时转染细胞、hMDMs/pAAV-CAG-hIRX3-Flag瞬时转染细胞、hMDMs/Ctrl瞬时转染细胞、hMDMs/shRNA#1瞬时转染细胞和hMDMs/shRNA#2瞬时转染细胞。

将hMDMs/pAAV-CAG-GFP-Flag瞬时转染细胞、hMDMs/pAAV-CAG-hIRX3-Flag瞬时转染细胞、hMDMs/Ctrl瞬时转染细胞、hMDMs/shRNA#1瞬时转染细胞和hMDMs/shRNA#2瞬时转染细胞在转染12小时后用TRIzol法提取RNA。并以所提取的RNA为模板，进行反转录和实时荧光定量PCR检测，同实施例2。所用引物同实施例7，检测IL1A、IL1B、IL6和TNF基因的转录水平。结果见图29和图30。

图29的结果显示，与hMDMs/pAAV-CAG-GFP-Flag瞬时转染细胞相比，hMDMs/pAAV-CAG-hIRX3-Flag瞬时转染细胞(即过表达hIRX3的细胞)中的IL1A、IL1B、IL6和TNF炎症因子的转录水平明显提高，即过表达hIRX3能够促进炎症因子的转录。图30的结果显示，与hMDMs/Ctrl瞬时转染细胞相比，hMDMs/shRNA#1瞬时转染细胞和hMDMs/shRNA#2瞬时转染细胞(即在敲低hIRX3的细胞)中的IL1A、IL1B、IL6和TNF炎症因子的转录水平明显降低，即敲低hIRX3能够抑制炎症因子的转录。这与人源巨噬细胞THP-1-M所产生的结果一致。

以上结果证明了IRX3也在人的巨噬细胞中发挥着调节炎症因子转录与表达的功能。

通过Uniprot网站分析，发现IRX3蛋白在哺乳动物(小鼠、人、大鼠、狗、猪、牛、马)中高度保守，其中人源和鼠源的IRX3蛋白有91％的相似性。并且在本发明中所鉴定的K409，S361，S389三个重要的位点的比对结果显示于图31中，根据图31可知，基于本发明所鉴定出的三个重要位点在人和鼠中均为保守位点，表明IRX3蛋白在小鼠和人中发挥相同的功能。

序列表

<110> 北京大学

<120> IRX3蛋白防治肥胖、代谢炎症及相关疾病中的应用

<130> LHA2160508

<150> 202110997646.1

<151> 2021-08-27

<160> 38

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA