去泛素化酶otud6a在制备防治前列腺癌药物中的应用
阅读说明：本技术 去泛素化酶otud6a在制备防治前列腺癌药物中的应用 (Application of deubiquitinase OTUD6A in preparation of medicine for preventing and treating prostate cancer ) 是由 龙建纲 彭韵桦 王珍 祁红斌 刘健康 于 2021-08-20 设计创作，主要内容包括：去泛素化酶OTUD6A在制备防治前列腺癌药物中的应用,公开了去泛素化酶OTUD6A作为前列腺癌的调控分子和OTUD6A作为靶点在制备治疗前列腺癌药物中的应用,具体而言,本发明公开了OTUD6A在前列腺癌病人中的表达变化；OTUD6A对前列腺癌细胞的增殖和能量代谢过程的调控作用；OTUD6A在前列腺癌细胞成瘤过程中的调控作用；因此,本发明提供以OTUD6A作为前列腺癌分子诊断标志物,以及以OTUD6A作为靶点筛选和制备前列腺癌治疗、预防药物中的应用。(The invention discloses an application of deubiquitinase OTUD6A in preparing a medicament for preventing and treating prostate cancer, discloses an application of deubiquitinase OTUD6A as a regulation molecule of prostate cancer and OTUD6A as a target spot in preparing a medicament for treating prostate cancer, and particularly discloses expression change of OTUD6A in prostate cancer patients; the regulation effect of OTUD6A on the proliferation and energy metabolism process of prostate cancer cells; the regulatory role of OTUD6A in prostate cancer cell tumorigenesis; therefore, the invention provides the application of taking OTUD6A as a prostate cancer molecular diagnostic marker and taking OTUD6A as a target spot to screen and prepare a prostate cancer treatment and prevention medicine.)
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及去泛素化酶OTUD6A作为前列腺癌调控分子及OTUD6A作为靶点在制备防治前列腺癌药物中的应用。
背景技术
肿瘤是21世纪最重大的公共健康问题之一，根据我国国家癌症中心2017年公布的数据显示，全国恶性肿瘤发病率为270.59/10万，约占全球22％；死亡率为163.83/10万，约占全球27％。在中国，前列腺癌新增病例占男性肿瘤病例2.4％，居第七位；死亡病例占男性死亡病例1.47％，居第十位，虽然在我国前列腺癌的整体发病率不高，但前列腺癌发病率呈逐年上升趋势，已经成为我国男性肿瘤中增长率最高的肿瘤。前列腺癌发病的严峻形势使得对其发病机制的研究称为肿瘤精准治疗的核心和关键。
泛素化-蛋白酶体系统主要受到泛素化和去泛素化的平衡调节。通常，蛋白质的泛素化过程是可逆的，由去泛素化酶介导。OTU家族蛋白是一类去泛素化蛋白，通过去除蛋白质上的多泛素链、稳定蛋白质。近年来，研究表明OTU家族蛋白包括OTUD1、OTUD3、OTUD5以及OTUD7b可以调节多种原癌基因和抑癌基因的蛋白质稳定性。
然而，其他OTU家族蛋白包括OTUD6A在前列腺癌中的作用尚未见报道。
发明内容
为了克服现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供去泛素化酶OTUD6A在制备防治前列腺癌药物中的应用，即将OTUD6A作为前列腺癌的调控分子和将OTUD6A作为靶点，应用在前列腺癌防治药物中。
为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
去泛素化酶OTUD6A在制备防治前列腺癌药物中的应用。
所述的前列腺癌为c-Myc依赖的前列腺癌，防治前列腺癌药物选自包含OTUD6A敲除的基因治疗药物或OTUD6A的抑制剂。
去泛素化酶OTUD6A作为前列腺癌分子诊断标志物的应用。
去泛素化酶OTUD6A作为前列腺癌进展调控分子的应用。
以去泛素化酶OTUD6A作为靶分子筛选前列腺癌治疗药物的应用。
以去泛素化酶OTUD6A作为检测指标评价前列腺癌的应用。
以去泛素化酶OTUD6A作为靶分子筛选前列腺癌分子诊断标志物的应用。
本发明通过实验首次发现OTUD6A在前列腺癌中表达降低，并与前列腺癌的发生成正相关，并揭示OTUD6A可以作为一种新的前列腺癌调控因子，不仅为前列腺癌的发病机制提供新的理论依据。更重要的是，可以为前列腺癌药物研制提供新的途径。因此，去泛素化酶OTUD6A可以用作前列腺癌诊断的标志分子，用OTUD6A作为靶分子筛选新的前列腺癌治疗药物，同时也可以用OTUD6A作为检测指标评价前列腺癌的治疗药物。
附图说明
图1为人前列腺癌患者癌组织和癌旁组织中OTUD6A表达水平的比较，其中图1中的A为正常癌旁组织和前列腺癌组织以OTUD6A抗体做免疫组化的代表大图；图1中的B为所有被测样本的免疫组化展示图，其中包括66例前列腺癌组织和14例正常组织。
图2为OTUD6A对前列腺癌细胞成瘤的影响；其中：A.前列腺癌细胞系RV1中，免疫印迹检测的OTUD6A敲除后的表达水平；B.前列腺癌细胞系RV1中，OTUD6A敲除对前列腺癌细胞克隆形成的影响；C.前列腺癌细胞系RV1中，OTUD6A敲除对前列腺癌细胞生长的影响；D.前列腺癌细胞系C4-2中，免疫印迹检测的OTUD6A敲除后的表达水平；E.前列腺癌细胞系C4-2中，OTUD6A敲除对前列腺癌细胞克隆形成的影响；F.前列腺癌细胞系C4-2中，OTUD6A敲除对前列腺癌细胞生长的影响；G.OTUD6A敲除的前列腺癌细胞对移植瘤形成的影响；H.移植瘤重量的统计结果。
图3为OTUD6A敲除对前列腺癌小鼠成瘤恶性表型的影响；其中，A为小鼠储精囊和前列腺部位整体拍照；B为前列腺不同区域包括背外侧、腹侧和前侧的肿瘤大小的比较结果；C为前列腺不同区域包括背外侧、腹侧和前侧的肿瘤大小的统计；D为前列腺不同区域肿瘤大小的比较结果；前列腺不同区域包括背外侧、腹侧和前侧的免疫组化揭示小鼠前列腺癌病理特征差异。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
本发明公开了去泛素化酶OTUD6A在前列腺癌中的调控机制和作为药物靶点的应用。
下面给出被发明所需要的实验手段及实验操作。
1.免疫组化分析(图1A，1B和图3D)
在人前列腺组织中，人前列腺组织阵列用OTUD6A(ThermoFisher，PA5-62722，1∶500)进行免疫组化染色。该阵列包括66例前列腺癌，14例对照正常等癌旁组织。
在小鼠前列腺组织中，取小鼠前列腺，用4％多聚甲醛固定。根据标准程序将固定的前列腺包埋在石蜡中，5微米切片进行HE染色。染色的片子用Pannoramic Scannersoftware(3D HISTECH)进行扫描。
2.利用CRISPR/Cas9技术建立OTUD6A基因敲除细胞系(图2)
用CRISPR/Cas9和5′-cctggccggttcaagcg-3′的引物序列设计OTUD6A敲除细胞。将sgRNA克隆到Lenti-CRISPRv2载体中。慢病毒颗粒在HEK293T细胞中产生，用于感染RV1和C4-2细胞。48小时后，将细胞接种于96孔板中，3～4周后取单个克隆。免疫印迹法鉴定OTUD6A基因敲除的单克隆细胞。通过sanger测序进一步验证敲除，提取基因组DNA并用正向引物(tcgaagactggccaagatg)和反向引物(cgggatcgcttcatctcca)进行PCR。然后用正向和反向引物对PCR产物进行测序。
3.克隆形成实验(图2B，2E)
前列腺癌细胞在含有RPMI-1640的10％FBS培养基中培养，然后以每孔1000个细胞的数量接种到6孔板中。2～3周后，用10％醋酸/10％甲醇固定细胞10分钟，用0.4％结晶紫/20％乙醇溶液染色，光镜下计数克隆数目。
4.移植瘤实验(图2)
使用BALB/C背景下4周大的无胸腺雄性裸鼠。将OTUD6A敲除的RV1细胞和对照细胞与matrigel(v/v，1∶1)混合，接种于裸鼠腹侧(每次注射2×106细胞，每组6只)。3周后取出移植瘤比较大小。
所有动物实验均由西安交通大学生命科学与技术学院动物伦理委员会批准。
下面给出本发明的相关结果.
1、OTUD6A在前列腺癌组织中高表达(图1)。
为了确定OTUD6A在前列腺癌患者癌组织和癌旁组织样本中的蛋白丰度，我们在人类前列腺癌患者癌组织和癌旁组织芯片中对OTUD6A进行了免疫染色，该芯片包括66个前列腺腺癌，6个正常前列腺组织，7个增生组织和1个癌旁组织。值得注意的是，近70％(80例中的56例)的样本有轻度或中度的OTUD6A染色，这些结果表明，OTUD6A在前列腺癌组织中特异性扩增和过表达。
2、OTUD6A敲除可显著抑制前列腺癌的发生(图2)。
图2为OTUD6A对前列腺癌细胞成瘤的影响；其中：A.前列腺癌细胞系RV1中，免疫印迹检测的OTUD6A敲除后的表达水平；B.前列腺癌细胞系RV1中，OTUD6A敲除对前列腺癌细胞克隆形成的影响；C.前列腺癌细胞系RV1中，OTUD6A敲除对前列腺癌细胞生长的影响；D.前列腺癌细胞系C4-2中，免疫印迹检测的OTUD6A敲除后的表达水平；E.前列腺癌细胞系C4-2中，OTUD6A敲除对前列腺癌细胞克隆形成的影响；F.前列腺癌细胞系C4-2中，OTUD6A敲除对前列腺癌细胞生长的影响；G.OTUD6A敲除的前列腺癌细胞对移植瘤形成的影响；H.移植瘤重量的统计结果。
在体外前列腺癌细胞系22Rv1和C4-2细胞中，使用CRISPR/Cas9技术构建并筛选了OTUD6A敲除的细胞系。免疫印迹结果显示，OTUD6A敲除成功，且敲除后会导致c-Myc癌蛋白的丰度降低(图2A和2D)，并且会导致22Rv1和C4-2前列腺癌细胞克隆形成(图2B和2E)及肿瘤生长能力受损(图2C和2F)，这些结果表明OTUD6A敲除可显著抑制前列腺癌的发生。
3、OTUD6A敲除抑制前列腺癌小鼠肿瘤的病理发生(图3)。
图3为OTUD6A敲除对前列腺癌小鼠成瘤恶性表型的影响。A为小鼠储精囊和前列腺部位整体拍照；B为前列腺不同区域包括背外侧、腹侧和前侧的肿瘤大小的比较结果；C为前列腺不同区域包括背外侧、腹侧和前侧的肿瘤大小的统计；D为前列腺不同区域肿瘤大小的比较结果；前列腺不同区域包括背外侧、腹侧和前侧的免疫组化揭示小鼠前列腺癌病理特征差异。
前列腺癌模型动物实验发现，OTUD6A敲除的小鼠与对照组相比，前列腺肿瘤组织大小、重量、病理表征显著减轻。从图3A中我们发现，OTUD6A敲除组小鼠前列腺癌表型显著降低，我们进一步将前列腺肿瘤解剖为前列腺背外侧(DLP)，前列腺腹侧(VP)和前列腺前侧(AP)(图3B)，分别称重后发现，OTUD6A敲除组在前列腺的每个部位重量均显著降低(图3C)；组织学分析显示，Hi-Myc Otud6a+/y小鼠在整个前列腺背外侧叶中有侵袭性癌表型，缺乏正常的分泌管腔表型(图3D左侧)，相比之下，Hi-Myc Otud6a-/y小鼠的侵袭性病变显著减少，仅有轻度增生表型(图3D右侧)，同时在前列腺腹侧和前列腺前侧，均发现Hi-MycOtud6a-/y组织癌变减少，和对照相比，敲除组仅有轻微的增生病变。
基于上述检测结果，本发明提出以下应用：
去泛素化酶OTUD6A在前列腺癌发生发展过程中，对前列腺肿瘤的增殖发挥非常重要的作用，该分子可作为前列腺癌的诊断和进展标志物分子。
去泛素化酶OTUD6A为前列腺癌提供了新的发病机制理论依据和治疗靶点。
进一步的，所述抗前列腺癌药物选自包含OTUD6A敲除的基因治疗药物或者，所述抗前列腺癌药物选自OTUD6A的抑制剂。
以上给出的实施例是实现本发明较优的离子，本发明不限于上述实施例。本领域的技术人员根据本发明技术方案的技术特征所作出的任何非本质的添加、替换，均属于本发明的保护范围。