6-磷酸葡萄糖脱氢酶抑制剂的医药用途
阅读说明：本技术 6-磷酸葡萄糖脱氢酶抑制剂的医药用途 (Medical application of 6-phosphoglucose dehydrogenase inhibitor ) 是由 王逸飞 郭传瑸 王琳 郭玉兴 李睿柳 于 2021-10-15 设计创作，主要内容包括：本发明公开了6-磷酸葡萄糖脱氢酶抑制剂改善患者个体抑制性肿瘤免疫微环境,以及作为PD-L1单抗疗效增强剂的用途。6-磷酸葡萄糖脱氢酶抑制剂通过多个方面改善患者个体抑制性肿瘤免疫微环境,提高个体对免疫治疗剂,特别是PD-L1单抗的响应,从而提高抗肿瘤效果。(The invention discloses a 6-phosphoglucose dehydrogenase inhibitor for improving an individual inhibitory tumor immune microenvironment of a patient and application of the inhibitor as a curative effect enhancer of a PD-L1 monoclonal antibody. The glucose-6-phosphate dehydrogenase inhibitor improves the tumor-inhibiting immune microenvironment of individual patients in multiple aspects, and improves the response of the individual to immunotherapeutic agents, particularly the PD-L1 monoclonal antibody, thereby improving the anti-tumor effect.)
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及6-磷酸葡萄糖脱氢酶抑制剂通过改善抑制性肿瘤免疫微环境增强PD-L1单克隆抗体抗肿瘤效果的应用。
背景技术
以PD-L1为代表的免疫检查点是近年来肿瘤免疫治疗研究中的热点，以此为靶点的单克隆抗体在多种恶性肿瘤中取得了较为理想的效果，特别是在非小细胞肺癌等恶性肿瘤中可显著改善患者预后。尽管如此，在部分肿瘤患者或肿瘤类型中，免疫治疗效果欠佳，主要原因在于患者对治疗的响应率不足。
研究表明肿瘤免疫微环境对免疫治疗响应率有重要影响，肿瘤组织中CD8+T细胞的数量及功能对PD-L1单抗的抗肿瘤效果有重要影响。以PD-L1为代表的免疫检查点通过与T细胞，特别是CD8+T细胞表面的相应受体PD-1结合，抑制免疫细胞功能。对于CD8+T细胞浸润不足或功能被抑制的肿瘤组织，即使通过单克隆抗体阻断PD-L1与PD-1之间的作用，但因效应细胞数量不足或功能缺失，仍然不能发挥抗肿瘤作用，由此导致治疗无响应。因此，探究改善肿瘤免疫微环境特征的方法，对提高PD-L1单抗治疗效果具有重要意义。
6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PD)作为糖代谢磷酸戊糖途径的关键限速酶，主要生理功能为调控5-磷酸核糖和NADPH的产生，在细胞增殖和对抗氧化应激中发挥重要作用。抑制G6PD可提高肿瘤细胞内氧化应激水平(表现为ROS水平升高)，激活凋亡通路，抑制其增殖、迁移、侵袭，而抑制G6PD对肿瘤细胞免疫逃逸功能的影响尚不清楚。除此之外，在免疫细胞中，现有研究表明一定水平的ROS在T细胞活化中发挥重要作用，但尚未见相关研究探索抑制G6PD介导的ROS水平升高对免疫细胞功能有何影响。
发明内容
针对临床部分患者对免疫治疗响应率不足的问题，本发明基于对6-磷酸葡萄糖脱氢酶抑制剂能够改善抑制性肿瘤免疫微环境的发现，提供了一种6-磷酸葡萄糖脱氢酶抑制剂的新医药用途。
首先，本发明的第一方案提供了6-磷酸葡萄糖脱氢酶抑制剂在制备改善患者个体抑制性肿瘤免疫微环境的药物中的用途。
根据本发明的一些实施例，上述用途中，所述改善患者个体抑制性肿瘤免疫微环境包括提高患者个体CD8+T细胞水平、提高CD8+/CD4+T细胞比例、提高外周血CD8+T细胞中IFN-γ+细胞比例、降低CD4+T细胞中CD25+FOXP3+细胞比例和抑制B7-H4表达中的一项或多项。
本发明所述患者个体为哺乳动物。优选地，所述患者个体是人患者。
经本发明验证，6-磷酸葡萄糖脱氢酶抑制剂与抗肿瘤免疫治疗剂联用，能够提高免疫治疗的有效性。所述抗肿瘤免疫治疗剂包括但不限于细胞免疫治疗剂、PD-1单抗、PD-L1单抗等。
本发明的第二方案提供了6-磷酸葡萄糖脱氢酶抑制剂在制备药物中的用途，所述药物与PD-L1单抗联合用于肿瘤治疗。
本发明经试验研究发现，6-磷酸葡萄糖脱氢酶抑制剂(特别是DHEA)与PD-L1单抗联用，其抗肿瘤效果优于单用6-磷酸葡萄糖脱氢酶抑制剂或PD-L1单抗，6-磷酸葡萄糖脱氢酶抑制剂起到了增效作用。
本发明的第三方案提供了一种药物组合，包括6-磷酸葡萄糖脱氢酶抑制剂和PD-L1单抗，二者联合用于肿瘤治疗。
在上述的第一至第三方案中，所述6-磷酸葡萄糖脱氢酶抑制剂选自DHEA、6-AN、RRx-001中的一种或几种。
进一步地，在上述的第一至第三方案中，所述6-磷酸葡萄糖脱氢酶抑制剂为DHEA。
DHEA即去氢表雄酮，CAS号为53-43-0。
进一步地，在上述的第二至第三方案中，所述PD-L1单抗选自durvalumab、atezolizumab和Avelumab中的一种或几种。
进一步地，在上述的第二至第三方案中，6-磷酸葡萄糖脱氢酶抑制剂在PD-L1单抗使用前或同时使用。
经本发明研究发现，6-磷酸葡萄糖脱氢酶抑制剂尤其是DHEA，能够提高肿瘤浸润组织CD8+/CD4+T细胞比例、提高外周血CD8+T细胞中IFN-γ+的细胞比例、降低CD4+T细胞中CD25+FOXP3+细胞比例、抑制B7-H4，从而改善肿瘤组织的抑制性免疫微环境。将6-磷酸葡萄糖脱氢酶抑制剂与PD-L1单抗联用，对肿瘤生长的抑制作用明显强于二者单用，实现了协同增效。这对于临床使用PD-L1单抗存在响应不足、疗效欠佳的患者具有重要意义。
附图说明
图1DHEA对恶性黑色素瘤全免疫小鼠移植瘤模型肿瘤生长及肿瘤浸润淋巴细胞分型的影响。其中，(A)DHEA可显著抑制全免疫小鼠移植瘤模型的肿瘤生长；(B)DHEA处理组小鼠肿瘤浸润T细胞中CD4+细胞比例降低；(C)CD8+细胞比例升高；(D)CD8+/CD4+T细胞比值显著升高。
图2DHEA联合PD-L1单克隆抗体治疗对恶性黑色素瘤全免疫小鼠移植瘤模型肿瘤生长及肿瘤浸润淋巴细胞分型的影响。其中，(A)DHEA和PD-L1单克隆抗体均可抑制全免疫小鼠移植瘤模型的肿瘤生长，二者联用，其抑制效果更加显著；(B)DHEA和PD-L1单克隆抗体联用可显著提高小鼠外周血CD8+T细胞中分泌IFN-γ的细胞的比例；(C)DHEA和PD-L1单抗均可降低外周血CD4+T细胞中Treg细胞(CD4+CD25+FOXP3+)的比例，二者联用效果更加显著。
图3DHEA体外处理肿瘤细胞系对其免疫共抑制分子表达的影响。其中，(A-B)DHEA显著降低人舌鳞癌细胞系CAL27(A)和人恶性黑色素瘤细胞系A375(B)的B7-H4表达；(C)Western blot实验验证DHEA可抑制CAL27和A375细胞系B7-H4的表达。
图4DHEA体外处理小鼠CD8+和CD4+T细胞对其免疫功能的影响。(A)DHEA处理过的CD8+T细胞分泌IFN-γ和TNF-α的细胞比例增加；(B)DHEA处理过的CD4+T细胞CD25+FOXP3+的Treg细胞比例降低。
术语
本发明的“6-磷酸葡萄糖脱氢酶抑制剂”是指对6-磷酸葡萄糖脱氢酶能够产生具有生理生物学意义上的抑制作用的物质，通常为小分子物质，包括但不限于DHEA、6-AN、RRx-001等。
本发明的“PD-L1单抗”除特殊说明时，是指靶向人PD-L1蛋白的单克隆抗体，包括但不限于durvalumab、atezolizumab和Avelumab等。
本发明的“肿瘤”也称癌症或者恶性肿瘤，包括但不限于肾细胞癌、前列腺癌、膀胱癌、腺癌、纤维肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤、脂肉瘤、血管肉瘤、淋巴管肉瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、髓细胞白血病、红白血病、多发性骨髓瘤、神经胶质瘤、人舌鳞状细胞癌、脑膜肉瘤、叶状囊性肉瘤、肾胚细胞瘤、畸胎瘤、绒膜癌、皮肤T-细胞淋巴瘤(CTCL)、主要针对皮肤的皮肤瘤(例如基底细胞癌、鳞状细胞癌、黑色素瘤和Brower′s疾病)、乳腺瘤、波济氏癌和粘膜组织的恶化前疾病和恶性疾病，包括口腔、膀胱和直肠疾病、中枢神经系统肿瘤(恶性胶质瘤)、脑膜瘤和星形细胞瘤等。
具体实施方式
以下试验例中的DHEA购自美国Selleck公司；PD-L1单抗为购自美国Bio X cell公司的小鼠用PD-L1单抗InVivoMAb anti-mouse PD-L1(B7-H1)(RRID：AB_10949073)。
在临床应用中，PD-L1单抗可对应durvalumab、atezolizumab和Avelumab等靶向人PD-L1蛋白的单克隆抗体。
当未特殊说明时，本发明试验例中的试验条件、试验方法等均采用本领域常规通用的条件和操作方法。
试验例一DHEA对恶性黑色素瘤全免疫小鼠的抑制性免疫微环境影响试验及DHEA对PD-L1的抗肿瘤影响试验
1.1
取10只7-8周龄雌性C57BL/6J小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)，随机分为DHEA组和对照组。将B16细胞系(国家生物医学实验细胞库)注射于小鼠背部皮下，构建恶性黑色素瘤全免疫小鼠移植瘤模型。待细胞注射后第8天开始给药，根据说明书将DHEA溶于动物实验药物载体(2％DMSO+30％PEG300+5％Tween-80+蒸馏水)中，按照25mg/kg体重的剂量，通过腹腔注射，每天固定时间给药一次，对照组采用药物载体，同时通过游标卡尺测量肿瘤体积(肿瘤体积计算公式为：长径×短径^2÷2)，构建肿瘤生长曲线。
细胞注射后第12天，脱颈处死小鼠，切取肿瘤组织，通过购自浙江博真生物科技有限公司的组织单细胞制备耗材(魔滤MagicFilter魔杵MagicVajra套装)制备单细胞悬液，进行流式细胞术检测，取单细胞悬液加入PE-CD3、FITC-CD4、APC-CD8流式抗体(1:100稀释，流式抗体均购自美国Biolegend公司，下同)，室温避光孵育30min，300g离心5min，去上清，500μl PBS重悬，上机检测。
结果如图1所示：根据肿瘤生长体积变化图及其曲线可见，DHEA可显著抑制恶性黑色素瘤生长；根据T淋巴细胞中CD8+和CD4+细胞占比变化图可看出，DHEA处理组肿瘤浸润的T淋巴细胞(CD3+)中CD8+T细胞比例升高，CD4+T细胞比例降低，CD8+/CD4+T细胞比值显著升高，表明DHEA可以改善肿瘤组织的抑制性免疫微环境。
1.2
参照1.1方法构建恶性黑色素瘤全免疫小鼠移植瘤模型，模型分为DHEA组、PD-L1单克隆抗体组、DHEA联用PD-L1单克隆抗体组、和空白对照组，DHEA组给予DHEA(给药方式、剂量等同1.1)，PD-L1单克隆抗体组给予PD-L1单克隆抗体(用生理盐水稀释至1mg/ml，每只小鼠每两天腹腔注射100μl)治疗，DHEA联用PD-L1单克隆抗体组同时给予与单药组等剂量的DHEA和PD-L1单克隆抗体，空白对照组采用药物载体(给药方式、剂量等同1.1)。通过游标卡尺每两天(固定时间)测量一次肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线。
细胞注射后第14天取小鼠移植瘤组织制备单细胞悬液进行流式细胞术检测(方法同1.1)。同时取小鼠外周血，通过小鼠外周血淋巴细胞分离试剂盒(北京索莱宝公司)分离小鼠外周血淋巴细胞，加入FITC-CD4、PerCP-CD8、APC-CD25流式抗体，室温避光孵育30min，离心去除多余抗体，采用美国BD公司的Mouse Foxp3 Buffer Set进行固定破膜，加入APC/Cy7-IFN-gama、PE-FOXP3，室温避光孵育30min，300g离心5min，去上清，500μlPBS重悬，上机检测。
结果如图2所示：1、DHEA联合PD-L1单抗对肿瘤生长的抑制作用明显强于二者单用，本发明的联用起到了协同增效的作用；2、DHEA联合PD-L1单抗处理后，肿瘤浸润的T淋巴细胞(CD3+)中CD8+T细胞比例升高，CD4+T细胞比例降低；外周血CD8+T细胞中IFN-γ+细胞比例增多，CD4+T细胞中CD25+FOXP3+细胞比例降低，表明肿瘤组织中的抑制性免疫微环境得到改善。
试验例二DHEA对肿瘤细胞B7-H4表达的影响试验
通过体外细胞培养检测DHEA对肿瘤细胞免疫逃逸能力的影响。
体外培养人恶性黑色素瘤细胞系A375(国家生物医学实验细胞库)，人舌鳞状细胞癌细胞系CAL27(ATCC)。分为给药组和对照组，给药组给予50μM DHEA(将固体DHEA溶于DMSO，配置50mM储存液，使用时用DMEM细胞培养基稀释)，对照组将相同体积的DMSO加入DMEM培养基，体外处理24小时，通过Trizol试剂(Thermo Fisher)提取RNA，采用Promega公司的逆转录试剂盒获得cDNA，通过SYRB green(BD公司)进行实时定量荧光PCR检测相关免疫共抑制分子表达，相关引物序列通过Primerbank数据库(https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/)查询获取，由上海生工生物工程有限公司合成。
通过RIPA(北京华兴博创)提取经DHEA处理的两种细胞的总蛋白，通过Westernblot实验检测B7-H4的表达(B7-H4一抗购自武汉爱博泰克公司，稀释比例1:1000；二抗购自美国CST公司，稀释比例1:10000)。
结果如图3所示：图中A、B表明在两种细胞系中，给药组和对照组的PD-L1的表达无明显变化，而B7-H4表达均显著降低。图中C进一步证明DHEA可使肿瘤细胞B7-H4表达降低。现有研究[1,2]表明B7-H4通过促进Treg细胞分化抑制抗肿瘤免疫功能，上述实验提示DHEA作用于肿瘤细胞可能通过抑制B7-H4表达改善肿瘤免疫微环境。
[1]Kryczek I,Wei S,Zhu G,et al.Relationship between B7-H4,regulatoryT cells,and patient outcome in human ovarian carcinoma.Cancer Res.2007；67(18):8900-8905.doi:10.1158/0008-5472.CAN-07-1866.
[2]Kryczek I,Wei S,Zhu G,et al.Relationship between B7-H4,regulatoryT cells,and patient outcome in human ovarian carcinoma.Cancer Res.2007；67(18):8900-8905.doi:10.1158/0008-5472.CAN-07-1866.
试验例三DHEA对CD8+T细胞中分泌IFN-γ、TNF-α的细胞比例的影响试验
取7-8周龄C57BL/6J小鼠，脱颈处死后取脾脏，通过C-tube(德国美天旎公司)制备单细胞悬液，随后采用CD4+细胞和CD8+细胞磁珠分选试剂盒(均购自德国美天旎公司)，分离CD4+和CD8+T细胞，体外培养于RPMI1640培养基中(含10％FBS，1％青霉素-链霉素，均购自美国Thermo Fisher公司)。将细胞分为给药组和对照组，药物浓度及处理方法同试验例二，流式细胞术(详细实验方法同1.1)检测免疫细胞分型变化。
结果如图4所示：发现CD4+T细胞中CD25+FOXP3+细胞(Treg细胞)比例降低，CD8+T细胞中分泌IFN-γ、TNF-α(PE/Cy7标记)的细胞(CTL细胞)比例升高，该结果与小鼠移植瘤实验结果一致。