一种基因编辑载体及其编辑基因的方法和应用
阅读说明：本技术 一种基因编辑载体及其编辑基因的方法和应用 (Gene editing vector and method and application for editing gene ) 是由 许凯 张望 智海剑 于 2021-05-11 设计创作，主要内容包括：本发明涉及基因工程技术领域,尤其涉及一种基因编辑载体及其编辑基因的方法和应用；所述基因编辑载体包括顺序排列的马铃薯Y病毒属病毒从5’-UTR区至衣壳蛋白区的序列、gRNA、插入序列和3’-UTR区；所述插入序列包括：编码所述马铃薯Y病毒属病毒的病毒衣壳蛋白的核酸序列。本发明通过马铃薯Y病毒属病毒构建基因编辑系统,可以浸染现有技术涉及较少的大豆、马铃薯等多种作物,扩大了可基因编辑的对象和范围。同时,还解决了马铃薯Y病毒属的病毒由于不能产生亚基因组RNA,导致难以通过常规方式产生gRNA的技术问题,在基因工程技术领域具有重要意义。(The invention relates to the technical field of genetic engineering, in particular to a gene editing vector and a method and application for editing genes thereof; the gene editing vector comprises a sequence from a 5 '-UTR region to a capsid protein region of the potyvirus, a gRNA, an insertion sequence and a 3' -UTR region which are sequentially arranged; the insertion sequence comprises: a nucleic acid sequence encoding a viral capsid protein of said potyvirus. The gene editing system is constructed by the potyvirus, so that a plurality of crops such as soybeans, potatoes and the like in the prior art can be infected, and the object and range of gene editing can be enlarged. Meanwhile, the technical problem that the gRNA is difficult to generate in a conventional mode due to the fact that the virus of potyvirus cannot generate subgenomic RNA is solved, and the method has important significance in the technical field of genetic engineering.)
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种基因编辑载体及其编辑基因的方法和应用。
背景技术
在许多细菌和大部分古细菌中，存在一种可用于抵御外源DNA(如噬菌体)的防御系统，称为CRISPR/Cas9(Clustered Regularly Interspaced Short PalindromicRepeats/CRISPR-associated Cas9 endonuclease)系统(Bhaya et al.,2011)。CRISPR/Cas9系统包含两种基本组份，一种是核酸内切酶Cas9蛋白，另一种是gRNA(guide RNA)。在一定条件下，gRNA可与Cas9蛋白形成复合体，通过碱基互补配对，gRNA可以将Cas9蛋白引导至靶标DNA，进而Cas9蛋白可以结合并切割靶标双链DNA，从而造成靶标DNA双链断裂(double strand break)。细胞内的DNA修复机制会对受损的双链DNA进行修复，包括NHEJ(non-homologous end-joining)和HDR(homology-directed repair)(Hsu et al.,2014)。其中大部分情况下为NHEJ发挥主要作用，但是NHEJ修复机制介导的双链DNA的修复往往是不精确的，可能会在被修复的DNA双链中引入不同类型的突变，例如碱基插入，碱基缺失和碱基替换等，进而可能造成靶标DNA功能的改变或者缺失，从而达到“基因编辑”的目的。利用CRISPR/Cas9系统，人们实现了对包括动物，植物，微生物在内的多种生物的基因组的编辑，从而对目标生物的某些性状实现定向改造。例如，通过基因枪将包含CRISPR/Cas9相关组份的瞬时表达载体导入玉米胚中，对玉米的thermosensitive genic male-sterile 5(TMS5)基因进行编辑，从而在32℃时，可以得到具有雄性不育特性的玉米(Li et al.,2017)。但是这类利用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑的策略，是建立在瞬时表达载体的基础之上的，需要借助于特殊的外部设备(例如基因枪)将能够表达CRISPR/Cas9组份的质粒导入靶标组织或者细胞中。基于此类方法，能够获得CRISPR/Cas9组份的细胞数目是很有限的，而进入目标细胞的CRISPR/Cas9组份的量也是有限的。为获得目标突变体，往往需要投入大量的时间和人力进行相关操作，例如获取植物未成熟胚和进行组织培养。
近年来，为了便于将CRISPR/Cas9组份导入靶标组织和细胞，简化操作流程，提高基因编辑的效率，出现了利用植物病毒载体将gRNA导入靶标组织并大量表达，从而实现植物基因编辑目的的报道，例如利用双生病毒、烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus，TRV)、烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)和大麦条纹花叶病毒(Barley stripe mosaicvirus,BSMV)对宿主植物基因组进行编辑。
以双生病毒小麦矮缩病毒(wheat dwarf virus，WDV)为例，WDV是一种植物DNA病毒，作者利用经过改造的WDV大量表达Cas9蛋白和用于HDR修复的DNA模板，实现对內源基因的基因打靶(gene targeting)。得益于经改造的WDV复制子在靶标细胞中高效的复制，其对靶标基因的编辑效率是非病毒载体的12倍(Gil-Humanes et al.,2017)。经改造的WDV病毒的运动蛋白和衣壳蛋白均被去除，从而丧失运动能力，但是能够高效复制。由于WDV为DNA病毒，作者利用WDV复制子大量表达donor DNA，并作为同源重组修复的模板，实现对植物內源基因的基因打靶。基于作WDV复制子的基因编辑载体可以同时大量表达Cas9和gRNA，并可以对玉米，小麦，水稻等作物的内源基因进行编辑。
然而，植物双生病毒为DNA病毒，在侵染植物时，双生病毒可能与宿主细胞竞争复制、翻译等相关因子，干扰植物正常生长，同时也给植物组培再生带来困难。基于双生病毒复制子的基因编辑载体往往无法在植物中进行运动和扩散。此外，双生病毒目前仍然是对农作物威胁最为严重的病毒种类之一，可以造成严重的症状，对作物造成巨大的破坏，且双生病毒可以经由昆虫(例如烟粉虱)进行传播，一旦扩散，难以控制。
烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus，TRV)为正义单链RNA病毒，其基因组包含两条RNA链。通过对TRV RNA2进行改造，作者成功利用TRV在本氏烟中表达了gRNA并配合Cas9蛋白，实现对本氏烟内源基因的编辑(Ali et al.,2015)。作者破坏了TRV RNA2上的2b蛋白(线虫传播相关)和2c蛋白(功能未知)表达框，此改造不影响病毒在本氏烟上的系统运动。通过将gRNA克隆至TRV RNA2上CP蛋白表达框的下游，并由同属的豌豆早褐病毒(peaearly browning virus，PEBV)启动子(192bp)驱动转录。应用此策略，其成功对本氏烟的注射叶和系统叶的PDS和PCNA基因进行编辑，编辑效率在50％左右。
然而，TRV的基因组包含两条单链RNA，虽然基于TRV的基因编辑载体保持了系统运动的能力，但是TRV的寄主范围较为有限，其一般不侵染包括大麦，小麦，玉米等重要作物在内的单子叶植物，也不能感染如大豆这样的双子叶作物，从而限制了其在这些重要的农作物上的应用。
2017年，有研究者报道利用烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)实现对本氏烟內源基因的编辑(Cody et al.,2017)。TMV也是一种单链RNA病毒，作者将TMV的CP蛋白表达框进行缺失，该TMV突变体丧失了在本氏烟中系统运动的能力，但依然保留了复制能力，通过农杆菌浸润的方法可以在本氏烟的农杆菌浸润叶上进行复制。作者将gRNA克隆至MP蛋白表达框之后，并由CP的亚基因组启动子转录gRNA。CP的亚基因组启动子转录起始位点和gRNA之间尚有约60nt的多余碱基，gRNA之后也有近200bp的UTR序列，在此情况下，作者发现此基于TMV的基因编辑载体依然可以对本氏烟内源基因AGO1进行编辑，且效率可达70％。此外作者发现可以直接将多个gRNA进行串联，且它们都可以发挥作用。
然而，其在设计时，去除了病毒本身的运动蛋白，使病毒丧失了系统运动的能力，使得其发挥作用的部位较为有限。此外，TMV同样不能侵染小麦，玉米等禾本科作物，也不能通过种子进行传播，即不具有直接编辑T0代种子并快速收获靶标突变体的潜力。
大麦条纹花叶病毒(Barley Stripe Mosaic Virus，BSMV)属于植物杆状病毒科，大麦病毒属，其基因组包含三条正义单链RNA，分别称之为RNAα，RNAβ和RNAγ。已知大麦条纹花叶病毒基因组上存在多个可以插入外源片段而不影响病毒本身的复制和运动的位点，例如γb的5`端和3`端；TGB3的3`端；此外作者发现大麦条纹花叶病毒的CP序列中间部分可以替换为外源片段而不影响病毒的运动(Hu,Jiacheng,Li,et al.,2019,Molecular PlantPathology)，这些位置都可以用于插入和表达gRNA。作者优选了的其中一个位点—γb的3`端，用于插入和表达gRNA。所述gRNA包含两个部分，位于5`端的spacer部分和紧连着的位于3`端的骨架部分；spacer的核苷酸序列是可以改变的，其长度根据Cas9蛋白的不同也可以发生变化。Spacer的上游和/或骨架部分的下游除了大麦条纹花叶病毒基因组上本身序列之外，还可以带有额外的序列，可以是另一个或者多个gRNA的序列和/或者是病毒自身及gRNA以外的其他序列。基于BSMV的基因编辑载体可以大量表达gRNA，并成功对本氏烟、小麦和玉米的内源基因进行编辑。
2020年，利用植物负义链RNA病毒苦苣菜黄网弹状病毒(Sonchus yellow netrhabdovirus,SYNV)的基因编辑系统被报道出来(Xiaonan Ma,et al.,2020,NaturePlants)，在这个系统里gRNA的被放置于病毒正义链RNA中的N/P基因的中间且加上了N/P基因中间原有的序列以控制其转录，并且这个gRNA的5’和3’端加上了pre-tRNA序列帮助gRNA从病毒转录出的mRNA中剪切出来。这个系统中gRNA的下游还加入了表达Cas9蛋白的基因，这样病毒就可以不仅表达gRNA、又表达Cas9蛋白，实现了不依赖于DNA、只依赖于RNA(病毒)的基因编辑。但由于SYNV的寄主范围局限，目前此系统仅在本氏烟中被证明有效。
2020年，利用改进型的烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus，TRV)的基因编辑体系，被报道可以进入种子进行编辑(可遗传)(Evan E.Ellison,et al.,2020,NaturePlants)。这个系统基于2015年报道的TRV系统，既利用在TRV的RNA2上去掉2b和2c的表达框，但加上同属的豌豆早褐病毒(pea early browning virus，PEBV)启动子subgenomicRNA promoter(192bp)驱动gRNA的转录。但与2015年的报道不同的是，这个载体在gRNA的下游加上了开花基因Flowering LocusT(FT)的完整基因、或起始密码子突变的基因mFT、或截短突变体。由于开花基因的片段可以在植物中向生长点系统运动，因此帮助了gRNA递送到种子里，增加了种子中的编辑效率。然而TRV的寄主范围比较有限，不能感染大麦，小麦，玉米等重要作物。
总结而言，目前利用植物病毒递送guide RNA的基因编辑系统，大部分依赖于Cas9转基因植物(除了SYNV)，且寄主范围仍然不够宽泛，可以应用的寄主仍然受到局限。
发明内容
为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种基因编辑载体及基因编辑方法和应用，具体为通过寄主范围极为广泛且基因组结构相同的马铃薯Y病毒属病毒构建基因编辑系统，拓宽了可基因编辑的对象和范围。
第一方面，本发明提供一种基因编辑载体，包括：顺序排列的马铃薯Y病毒属病毒从5’-UTR区至衣壳蛋白区的序列、gRNA、插入序列和3’-UTR区；
所述插入序列任选如下任一：
i)编码所述马铃薯Y病毒属病毒的病毒衣壳蛋白的核酸序列；
ii)如i)所示核酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸后，仍可以和3’-UTR区的核酸序列形成病毒复制所需的完整RNA元件的核酸序列。
本发明在马铃薯Y病毒属病毒衣壳蛋白的终止密码子后加入gRNA、插入序列和3’-UTR区。其中插入序列和3’-UTR区一起形成了病毒复制所需的完整的RNA元件(或启动子序列)，使携带gRNA的病毒能够正常复制和系统性侵染寄主植物，从而对感染的组织进行基因编辑。
进一步地，所述衣壳蛋白区的序列经过密码子优化使其核酸序列的二级结构自由能增加；
优选地，优化后的序列和优化前的序列相比没有大于30个碱基的连续的完全一致的同源片段。
发明人针对马铃薯Y病毒属病毒中编码病毒衣壳蛋白的核酸序列进行密码子优化，目的在于避免与终止密码子之后新插入的病毒衣壳蛋白序列一致从而产生病毒介导的同源重组，从而让在两个序列中间的gRNA丢失。但根据本领域常规知识判断，不优化的病毒衣壳蛋白可能也可以起到一定效果。
进一步地，所述插入序列经过如下流程i)或流程ii)处理：
i)选取编码所述马铃薯Y病毒属病毒的病毒衣壳蛋白的核酸序列作为插入序列；
ii)将所述编码所述马铃薯Y病毒属病毒的病毒衣壳蛋白的核酸序列以100-300nt分为多段，任意去除其中至少一段核酸序列序列，将留下的核酸序列在所述载体中进行病毒复制能力和/或基因编辑效率的评估；若可以顺利进行所述马铃薯Y病毒属病毒的复制和基因编辑，则所述留下的核酸序列即为所述插入序列。
具体地，发明人根据病毒衣壳蛋白CP与3’-UTR的序列加在一起的其二级结构分析，通过其二级结构上的颈环结构的分布特征，以不破坏颈环结构的原则，将编码病毒衣壳蛋白的完整核酸序列从5’端开始逐级截短(每次截短基本上以100-300nt为单位)，根据病毒复制能力和/或基因编辑效率进行评估筛选；若可以顺利进行所述马铃薯Y病毒属病毒的复制并进行基因编辑，则所述留下的核酸序列即为所述插入序列。另外，发明人发现，通过此规则截短的序列，有些在编辑效率上高于完整的病毒衣壳蛋白序列。
进一步地，在所述衣壳蛋白区的序列和所述gRNA之间还包括可以自我切割或被细胞内核酸内切酶切割的核酸序列，优选为编码核酶的核酸序列或Pre-tRNA。
进一步地，所述核酶为突变型柱头状核酶；优选地，所述突变型柱头状核酶的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
本发明此处优选插入的核酶为突变型柱头状核酶(Hammer head ribozyme)，现有技术其他类似核酶也可以用于释放gRNA。
进一步地，所述马铃薯Y病毒属病毒包括但不限于马铃薯Y病毒(Potato virusY)、大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus)、菜豆普通花叶病毒(Bean common mosaicvirus)、菜豆黄花叶病毒(Bean yellow mosaic virus)、黑眼豇豆花叶病毒(Blackeyecowpea mosaic virus)、豇豆蚜传花叶病毒(Cowpea aphid-borne mosaic virus)、豇豆绿色脉带病毒(Cowpea green vein banding virus)、瓜尔豆无症病毒(Guar symptomlessvirus)、绿豆花叶病毒(Mungbean mosaic virus)、豌豆种传花叶病毒(Pea seedbornemosaic virus)、花生斑驳病毒(Peanut mottle virus)、花生条纹病毒(Peanut stripevirus)、玉米矮花叶病毒(Maize dwarf mosaic virus)、苜蓿花叶病毒(Alfalfa mosaicvirus)、西瓜花叶病毒(Watermelon mosaic virus)、甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaicvirus)、小麦线条花叶病毒(Wheat streak mosaic virus)、芜菁花叶病毒(Turnip mosaicvirus)、李痘病毒(Plum pox virus)或向日葵花叶病毒(Sunflower mosaic virus)。
马铃薯Y病毒属的病毒拥有相同的基因组结构(如图3中的A所示)，理论上均可适用于本发明所提供的基因编辑载体的设计思路。
本发明涉及的基因编辑载体的设计思路可以适用于所有马铃薯Y病毒属的病毒。
进一步地，所述基因编辑载体包括如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。
第二方面，本发明提供一种基因编辑方法，使用所述基因编辑载体对目标植物进行基因编辑。
进一步地，通过农杆菌浸润、基因枪轰击或摩擦接种法，将所述基因编辑载体转化至所述目标植物中。
进一步地，所述目标植物为马铃薯Y病毒属病毒能够侵染的寄主植物，包括：
大豆、菜豆、豇豆、绿豆、烟草、西瓜、马铃薯、苜蓿、甘薯、玉米、小麦或大麦中的一种或多种。
本发明进一步提供所述基因编辑载体，或所述基因编辑方法在改良植物表型中的应用；所述植物表型优选包括：产量、抗病性、抗逆性、种子品质和果实品质中的一种或多种。
本发明提供的基因编辑载体，可以通过基因枪轰击，农杆菌浸润和摩擦接种等方法导入植物组织细胞中，并可以在本氏烟中复制和运动；所述基因编辑载体中包含gRNA的序列，在瞬时或转基因表达Cas蛋白的条件下，可以实现对本氏烟等植物基因组的编辑。例如，将所述一种基于大豆花叶病毒的基因编辑载体，以农杆菌浸润的方法在本氏烟上进行接种，在spCas9蛋白存在的条件下，其可以对直接接种区域以内的和病毒系统侵染的植物组织进行基因编辑。
本发明具备如下有益效果：
本发明基于马铃薯Y病毒属病毒构建了一种基因编辑系统，相较于现有的基于TRV的基因编辑载体，本发明提供的基因编辑载体可以侵染一些重要的作物，包括大豆、马铃薯和苜蓿等；
相较于基于TMV的基因编辑载体，本发明提供的基因编辑载体保留病毒在宿主植物中的系统运动能力和复制能力，从而可以实现更大范围的植物组织细胞的进行基因编辑，而不仅仅局限于病毒在植物上的接种领域；
相较于基于双生病毒的基因编辑载体，本发明提供的基因编辑载体在实现较高编辑效率的前提下，并不会同植物细胞竞争诸如DNA复制等原件并干扰正常的植物细胞周期；另外，马铃薯Y病毒属病毒作为RNA病毒，不会整合到植物的基因组当中而在植物基因组中引入额外的外源片段；
相比较于基于BSMV的基因编辑载体，马铃薯Y病毒属的病毒寄主范围广泛，拥有编辑更广泛的寄主植物的潜力，包括大豆(soybean)、菜豆(bean)、豇豆(cowpea)、绿豆(mungbean)、西瓜(watermelon)、苜蓿(alfalfa)、甘薯(sugarcane)等。
本发明提供的基因编辑载体可以将核酶序列、gRNA序列和编码病毒衣壳蛋白的完整或部分核酸序列插入到病毒衣壳蛋白的核酸序列的终止密码子后而不影响马铃薯Y病毒属病毒在宿主植物本氏烟上的系统侵染；gRNA序列的两端可以添加额外的核苷酸序列而不破坏其正常功能；同时，由于病毒可在植物中运动，此基因编辑载体可以对接种区域之外的植物组织进行编辑。
本发明提供基因编辑载体在瞬时或转基因表达Cas9的条件下，在接种第6天通过PCR/RE实验并采用quantity one软件进行计算，其在本氏烟的接种叶上可以对瞬时表达了Cas9的16c转基因本氏烟的mGFP5基因或Cas9转基因本氏烟的PDS基因实现50％以上的编辑效率；在接种第12天通过PCR/RE实验并采用quantity one软件进行计算，其在本氏烟的上位叶上可以对瞬时表达了Cas9的16c转基因本氏烟的mGFP5基因或Cas9转基因本氏烟的PDS基因实现50％以上的编辑效率。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的，基于大豆花叶病毒的基因编辑载体构造示意图。
图2为本发明实施例1提供的利用mfold分析大豆花叶病毒原始衣壳蛋白序列加3’UTR序列RNA二级结构示意图；其中箭头为截短位置。
图3为本发明实施例1提供的改造前后马铃薯Y病毒属病毒基因组结构对比示意图；其中A为马铃薯Y病毒属病毒基因组结构示意图；B为改造后的用于基因编辑的马铃薯Y病毒属病毒基因组结构示意图；C为用于基因编辑的大豆花叶病毒基因结构示意图及构建此克隆所需引物；D为用于基因编辑的马铃薯Y病毒基因结构示意图及构建此克隆所需引物；其中，CP*为经过密码子优化的马铃薯Y病毒属病毒的衣壳蛋白区的序列，Rz指核酶或其他具有自剪切功能的核酸序列，target sequence和spCas9-gRNA scaffold是指组成了gRNA的靶向序列和骨架序列，CP sequence指插入序列(全长或截短的病毒衣壳蛋白的核酸序列)，original 3’-UTR指优化前的马铃薯Y病毒属病毒的3’UTR序列；Rz、gRNA、插入序列和original 3’-UTR一起组成了改造后的病毒的3’UTR序列(New 3’-UTR)。
图4为本发明实施例1提供的Western blotting检测不同版本插入gRNA的大豆花叶病毒与野生型大豆花叶病毒第6天注射叶CP的积累量结果示意图。
图5为本发明实施例1提供的琼脂糖凝胶电泳检测不同版本的插入gRNA的大豆花叶病毒第6天注射叶基因编辑效率的结果示意图；其中，由于基因编辑破坏了mGFP5基因片段的NdeI酶切位点，因此发生了编辑的基因片段不能被NdeI酶切。
图6为本发明实施例1提供的采用核酶的版本7(SMV-HHRz-gRNA-插入序列#3)第6天注射区域叶片细胞mGFP5编辑位点测序结果；其中CATATG为NdeI酶切位点，CGG为PAM；横杠代表缺失突变，加粗代表插入突变。
图7为本发明实施例1提供的采用核酶的版本8(SMV-HHRz-gRNA-插入序列#4)第6天注射区域叶片细胞mGFP5编辑位点测序结果；其中CATATG为NdeI酶切位点，CGG为PAM；横杠代表缺失突变，加粗代表插入突变。
图8为本发明实施例1提供的Western blotting检测不同版本插入gRNA的大豆花叶病毒与野生型大豆花叶病毒第12天系统叶中病毒CP的积累量结果示意图。
图9为本发明实施例1提供的琼脂糖凝胶电泳检测大豆花叶病毒加核酶的版本7(SMV-HHRz-gRNA-插入序列#3)和版本8(SMV-HHRz-gRNA-插入序列#4)第12天时系统性侵染的叶片细胞中基因编辑的效率结果示意图；其中，由于基因编辑破坏了mGFP5基因片段的NdeI酶切位点，因此发生了编辑的基因片段不能被NdeI酶切。
图10为本发明实施例1提供的大豆花叶病毒加核酶的版本7(SMV-HHRz-gRNA-插入序列#3)第12天系统叶片细胞mGFP5编辑位点测序结果；其中CATATG为NdeI酶切位点，CGG为PAM，横杠代表缺失突变。
图11为本发明实施例1提供的大豆花叶病毒加核酶的版本8(SMV-HHRz-gRNA-插入序列#4)第12天系统叶片细胞mGFP5编辑位点测序结果；其中CATATG为NdeI酶切位点，CGG为PAM，横杠代表缺失突变。
图12为本发明实施例2提供的基于马铃薯Y病毒的基因编辑载体构造示意图。
图13为本发明实施例2提供的Western blotting检测插入gRNA的马铃薯Y病毒与野生型马铃薯Y病毒第6天注射叶CP的积累量的结果示意图；其中，由于基因编辑破坏了PDS基因片段的NcoI酶切位点，因此发生了编辑的基因片段不能被NcoI酶切。
图14为本发明实施例2提供的琼脂糖凝胶电泳检测插入gRNA的马铃薯Y病毒第6天注射叶基因编辑效率的结果示意图。
图15为本发明实施例2提供的第6天注射叶PDS编辑位点测序结果；其中，CCATGG为NcoI酶切位点，GGG为PAM，横杠代表缺失突变；加粗代表插入突变，斜体代表点突变。
图16为本发明实施例2提供的Western blotting检测插入gRNA的马铃薯Y病毒与野生型马铃薯Y病毒第12天系统叶CP的积累量的结果示意图。
图17为本发明实施例2提供的琼脂糖凝胶电泳检测插入gRNA的马铃薯Y病毒第12天系统叶基因编辑效率的结果示意图；其中，由于基因编辑破坏了PDS基因片段的NcoI酶切位点，因此发生了编辑的基因片段不能被NcoI酶切。
图18为本发明实施例2提供的第12天系统叶PDS编辑位点测序结果；其中CCATGG为NcoI酶切位点，GGG为PAM；横杠代表缺失突变，加粗代表插入突变，斜体代表点突变。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
本实施例构建以大豆花叶病毒为载体的CRISPR/Cas9基因编辑系统，系统如图1所示，构建流程如下：
1、选取大豆花叶病毒SC7分离物(Genbank Accession#:MH919385)作为原料；
2、密码子优化大豆花叶病毒SC7分离物的编码衣壳蛋白的核酸序列。利用在线网站(https://www.vectorbuilder.cn/tool/codon-optimization.html)，物种选择普通烟一键优化，得到优化后的核酸序列，如SEQ ID NO.1所示，优化后的大豆花叶病毒衣壳蛋白核酸序列直接基因合成，用于替换读码框中的原始CP序列。(注：密码子优化的作用是避免与终止密码子之后新插入的CP序列一致从而产生病毒介导的同源重组，从而让在两个序列中间的gRNA丢失。但我们仍然推测不优化的CP可能也可以起到一定效果。)
3、将大豆花叶病毒分成6段进行PCR扩增，同时通过PCR的方式将突变体锤头状核酶、gRNA(编辑mGFP5，序列如SEQ ID NO.48所示)，插入序列整合到大豆花叶病毒的侵染性克隆中，总共有8个不同的版本。其中，插入序列为根据病毒衣壳蛋白CP与3’-UTR的序列加在一起的其二级结构分析(图2)，通过其二级结构上的颈环结构的分布特征，以不破坏主要的独立颈环结构的原则，将编码病毒衣壳蛋白的完整核酸序列从5’端开始截短(以100-300nt为单位)，截短的位置如图2箭头所示。
8个不同版本的整体构思如图3中的C所示，具体地，各不同版本构建方式如下：
(1)版本1-4不含有锤头状核酶，只含有gRNA和插入序列#1-4；
(2)版本5-8含有锤头状核酶，以及gRNA和插入序列#1-4。
其中版本1和5含有插入序列#1，版本2和6含有插入序列#2，版本3和7含有插入序列#3，版本4和8含有插入序列#4。其中，插入序列#1、插入序列#2和插入序列#3为截短了的大豆花叶病毒衣壳蛋白核酸序列，插入序列#4为全长大豆花叶病毒衣壳蛋白核酸序列。
插入的锤头状核酶序列如SEQ ID NO.2所示。插入序列#1-4的核酸序列如SEQ IDNO.44-47所示，插入的gRNA骨架序列如SEQ ID NO.48所示。
具体克隆步骤如下：
(1)以大豆花叶病毒SC7分离物的complementary DNA(cDNA)为模板，通过引物SMV/PVY-frag1-F和SMV-frag1-R扩增片段1，通过引物SMV-frag2-F和SMV-frag2-R扩增片段2，通过引物SMV-frag3-F和SMV-frag3-R扩增片段3，通过引物SMV-frag4-F和SMV-frag4-R1扩增得到中间产物，中间产物割胶回收后作为模板，通过引物SMV-frag4-F和SMV-frag4-R2扩增片段4。
(2)以基因合成的优化后的大豆花叶病毒衣壳蛋白核酸序列作为模板，通过引物SMV-frag5-F和SMV-frag5a-R1、SMV-frag5a-R2、SMV-frag5a-R3扩增片段5a；以大豆花叶病毒侵染性DNA克隆作为模板，通过引物SMV-frag6a-F和SMV/PVY-frag6-R扩增片段6a，通过引物SMV-frag6b-F和SMV/PVY-frag6-R扩增片段6b，通过引物SMV-frag6c-F和SMV/PVY-frag6-R扩增片段6c，通过引物SMV-frag6d-F和SMV/PVY-frag6-R扩增片段6d。
(3)片段5a分别与片段6a，6b，6c或6d混合作为模板，通过引物SMV-frag5-F和SMV/PVY-frag6-R分别扩增得到片段5a+6a，5a+6b，5a+6c，5a+6d。将StuI和SmaI双酶切后的pCB301-314和片段1,2,3,4分别与片段5a+6a，5a+6b，5a+6c，5a+6d混合，通过酵母同源重组得到克隆版本1到4(克隆构建示意图见图3中的C)。
(4)以基因合成的优化后的大豆花叶病毒衣壳蛋白核酸序列作为模板，通过引物SMV-frag5-F和SMV-frag5b-R1、SMV-frag5b-R2、SMV-frag5b-R3、SMV-frag5a-R2、SMV-frag5a-R3扩增片段5b.
(5)片段5b分别与片段6a，6b，6c，6d混合作为模板，通过引物SMV-frag5-F和SMV/PVY-frag6-R分别扩增得到片段5b+6a，5b+6b，5b+6c，5b+6d。
(6)将StuI和SmaI双酶切后的pCB301-314和片段1，2，3，4分别与片段5b+6a，5b+6b，5b+6c，5b+6d混合，通过酵母同源重组得到克隆版本5到8(克隆构建示意图见图3中的C)。
4、大量提取克隆版本1-8的酵母质粒，具体方法如下：挑选长出的单菌落于50mlSC-T-中，30℃，250rpm摇菌过夜。5000rpm离心5min，去上清，每1g酵母沉淀加入1.5ml山梨醇磷酸缓冲液(含有1.2M山梨醇的0.1M的PBS，PH＝7.4)，100ul蜗牛酶溶液(0.12g/ml，蜗牛酶粉末溶于含10％0.1M PBS，40％无菌水，50％甘油的混合液体)，10μl RNaseA(10mg/ml)，涡旋混匀后37℃酶解过夜。去除酵母细胞壁后即可用常规的碱裂解法提取质粒，本实施案例中使用质粒提取试剂盒(诺唯赞，南京，中国)。
5、用CaCl2处理法制备农杆菌菌株C58C1感受态，然后用液氮冻融法将酵母质粒转化新制备的C58C1感受态，具体方法如下：
将活化的C58C1于2ml LB(含50μg/ml链霉素和100μg/ml利福平)中，30℃，250rpm摇菌过夜。将此2ml菌液加入50ml LB(不含抗生素)中，30℃，250rpm摇菌至OD＝0.5。将菌液放冰上10min，然后5000rpm，4℃，10min，去上清，沉淀重悬于1ml预冷的20mM CaCl2。在事先加入酵母质粒的离心管中，加入100μl感受态，冰上放5min，液氮速冻5min，37℃放5min，冰上放5min，加入1ml LB，30℃放3h。15000rpm，30s，留100μL上清混匀沉淀，涂布于含抗生素的固体LB培养基上，30℃放4d，长出单菌落。
挑单菌落于LB培养基中摇菌过夜，离心后去上清收集菌体，菌体用MMA悬浮后注射转基因表达mGFP5的本氏烟，注射后第3天在注射区域注射转化了可表达Cas9的pKSE401-Cas9载体的农杆菌，注射后第6天取注射叶Western blotting检测SMV CP的积累(图4)，发现所有版本都能复制，含有插入序列#3的版本3和7复制能力最强，能达到与野生型病毒一致的复制水平。
取注射叶提取DNA，用引物mGFP5/F和mGFP5/R PCR扩增mGFP5后产物用限制性内切酶NdeI酶切过夜，酶切后的产物通过酚仿抽提和乙醇沉淀后，琼脂糖凝胶电泳检测基因编辑效率(图5)发现含有锤头状核酶和插入序列#3的版本7(SMV-HHRz-gRNA-插入序列#3)基因编辑的效率最高，含有锤头状核酶和插入序列#4的版本8(SMV-HHRz-gRNA-插入序列#4)次之；将酶切过后的产物割胶纯化后连接T载体测序，测序结果与原始基因序列进行序列比对(图6，图7)，验证注射叶mGFP5确实被基因编辑。
注射后第9天在上位叶片注射转化了可表达Cas9的pKSE401-Cas9载体的农杆菌，再过3天后(注射后第12天)取注射了Cas9的上位叶进行Western blotting检测SMV CP的积累(图8)，发现所有1-8版本都能进行系统移动，含有锤头状核酶和插入序列#3的版本7(SMV-HHRz-gRNA-插入序列#3)的病毒积累量最高，版本8(SMV-HHRz-gRNA-插入序列#4)次之。
提取克隆版本7和8的上位叶的DNA，PCR扩增mGFP5后产物用限制性内切酶NdeI酶切过夜，酶切后的产物通过酚仿抽提和乙醇沉淀后，琼脂糖凝胶电泳检测基因编辑效率(图9)；将此酶切过后的产物割胶纯化后连接T载体测序，测序结果与原始基因序列进行序列比对(图10，图11)，验证版本7和8的系统叶mGFP5确实被基因编辑。
本发明同时针对大豆进行和实施例1类似的实验流程，得到类似的结果，成功实现对大豆的基因编辑。
本实施例中所用引物如下表所示：
表1实施例1所用引物序列
实施例2
本实施例构建以马铃薯Y病毒为载体的CRISPR/Cas9基因编辑系统，系统如图12所示，构建流程如下：
1、选取马铃薯Y病毒ZT5分离物(Genbank Accession#:MF960848)作为原料；
2、密码子优化马铃薯Y病毒ZT5分离物的编码衣壳蛋白的核酸序列。利用在线网站(https://www.vectorbuilder.cn/tool/codon-optimization.html)，物种选择普通烟一键优化，得到优化后的核酸序列(SEQ ID NO.49)，优化后的马铃薯Y病毒衣壳蛋白核酸序列直接基因合成。
3、将马铃薯Y病毒分成5段进行PCR扩增，同时通过PCR的方式将锤头状核酶、gRNA(编辑PDS)，插入序列整合到马铃薯Y病毒的侵染性克隆中，具体克隆步骤如下：
(1)以马铃薯Y病毒侵染性DNA克隆作为模板，通过引物SMV/PVY-frag1-F和PVY-frag1-R扩增片段1，通过引物PVY-frag2-F和PVY-frag2-R扩增片段2，通过引物PVY-frag3-F和PVY-frag3-R1扩增得到中间产物，中间产物割胶回收后作为模板，通过引物PVY-frag3-F和PVY-frag3-R2扩增片段3；
(2)以基因合成的优化后的马铃薯Y病毒衣壳蛋白核酸序列作为模板，通过引物PVY-frag4-F和PVY-frag4-R1、PVY-frag4-R2、PVY-frag4-R3、PVY-frag4-R4、PVY-frag4-R5、PVY-frag4-R6扩增片段4；以马铃薯Y病毒侵染性DNA克隆作为模板，通过引物PVY-frag5-F和SMV/PVY-frag6-R扩增片段5；
(3)片段4与片段5混合作为模板，通过引物PVY-frag4-F和SMV/PVY-frag6-R扩增得到片段4+5。
(4)将StuI和SmaI双酶切后的pCB301-314和片段1，2，3，4+5混合，通过酵母同源重组得到插入gRNA的马铃薯Y病毒侵染性DNA克隆(克隆构建示意图见图3中的D)。
4、提取酵母质粒和转化农杆菌C58C1的程序和构建以大豆花叶病毒为载体的CRISPR/Cas9基因编辑系统(实施例1)相同。
5、长出单菌落后挑单菌落于LB培养基中摇菌过夜，离心后去上清收集菌体，菌体用MMA悬浮后注射转基因表达spCas9的本氏烟，注射后第6天取注射叶Western blotting检测PVY CP的积累(图13)，插入锤头状核酶和gRNA的PVY能达到与野生型PVY一致的复制水平。
取注射叶提取DNA，用引物PDS/F和PDS/R PCR扩增PDS后产物用限制性内切酶NcoI酶切过夜，酶切后的产物通过酚仿抽提和乙醇沉淀后，琼脂糖凝胶电泳检测基因编辑效率(图14)，结果显示从PVY-HHRz-gRNA-完整CP侵染的植物组织中扩增出的部分PDS基因片段无法被酶解，提示这部分PDS基因被编辑；将此酶切过后的产物割胶纯化后连接T载体测序，测序结果与原始基因序列进行序列比对(图15)，验证注射叶PDS确实被基因编辑；
注射后第12天取系统叶Western blotting检测PVY CP的积累(图16)；提取系统叶的DNA，PCR扩增PDS后产物用限制性内切酶NcoI酶切过夜，酶切后的产物通过酚仿抽提和乙醇沉淀后，琼脂糖凝胶电泳检测基因编辑效率(图17)；将此酶切过后的产物割胶纯化后连接T载体测序，测序结果与原始基因序列进行序列比对(图18)，验证系统叶PDS确实被基因编辑。本发明同时针对马铃薯进行和实施例2类似的实验流程，得到类似的结果，成功实现对马铃薯的基因编辑。
本实施例所用引物序列如下表所示：
表2实施例2所用引物序列
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 南京师范大学
<120> 一种基因编辑载体及其编辑基因的方法和应用
<130> KHP211111584.4
<160> 49
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 798
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tctggtaaag aaaaagaggg tgatatggac gctgacaagg accctaaaaa atctacatct 60
tcttcaaaag gtgccgggac ctctagtaag gacgttaacg tgggttctaa gggtaaagtt 120
gtcccaagac tccaaaaaat aaccagaaaa atgaacttac ctatggtcga aggaaaaatt 180
atactgtcat tagatcattt actcgaatac aagccaaacc aagtggacct ctttaacaca 240
agggctacta ggactcaatt tgaggcatgg tataacgctg tgaaggacga gtacgaatta 300
gacgacgagc aaatgggagt tgtgatgaac ggatttatgg tctggtgtat agataacgga 360
acctcacctg acgctaacgg agtttgggtt atgatggacg gtaaggagca aatcgagtac 420
cccttgaagc ctatcgtgga gaacgccaag cccacattac gacagattat gcatcatttt 480
agcgacgccg ctgaggccta tatcgaaatg aggaacagtg agtcccctta catgcccagg 540
tacggcttgc ttcgtaacct cagggacagg gaacttgctc gatacgcatt cgacttttac 600
gaagtcacaa gtaagactcc taatagagcc cgtgaggcta tcgcacaaat gaaagccgct 660
gcattgtctg gcgtaaataa taaattattc gggttggacg gaaatatttc tacaaattca 720
gagaacacag agcgtcatac agctagagac gtcaaccaga atatgcatac actcctcggg 780
atgggtcctc aacaataa 798
<210> 2
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
caagcactga tgagtccgtg aggacgaaaa gagtaagctc ttctgcttgg gctgcg 56
<210> 3
<211> 10950
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aaattaaaac aactcataaa gacaacaacg attacaaacg cattcaagac ttctatttct 60
cactttcaag caattcaagc cttacgtaaa cttctaaaca attcactatt ttctcaagga 120
aaatcaactg aaatggcaac aatcatgttt ggagacttta ctgtgcagct gaagcataac 180
acaaagactg agaagagaaa gcgggtggtg gaaaccacca agcttgaaaa ggaggtgcgc 240
atggaaactg tccacgtgca agttatggag agtattactg taggttgctc agcacgctgt 300
gcgggcttga gcgcgtacac aaagtcgtcc cttaggaaag caatgaagga aggggatctg 360
agcgcgtcag ggggatgcca ttattgcggt cttcgggcat tggttggtga gggtcgcaaa 420
agggtgattt ctgtacccag gttggtggcg caacagaagg aagtggttgt cactaaggaa 480
gttcctcatt tctatgagga ggaatatgaa gttgaaatac catgtgtgac cactgagata 540
gcgcaaccag tagtggctgt cacttctatg agcaatgttt gcggaactgc tatgcagaca 600
aaggtgacaa gcactatcgt caccaaagat atgatggcga catctaagcc atcattgaag 660
caagtcagtc gtgctcttgt actgactggt aagaaagagg ttggtagcta tgacttggct 720
atcaagaaga tggatgaggc aatgcagcaa aattctgcgc tgcaaaaaca gctgttcatt 780
caacagcaaa gcaccattca acagaaacct aaaggagctg ttcaactgag gttatgctcg 840
tacgaacaag caaagaaacg tgttgaattg gcgcgtaaga gacaagaaga agaggaagat 900
tttctcaatg ggaagtatga acaacaattc tacgctggcg catccactcc aaagcctatg 960
aaatttgaag gagggagtgt tggttttaga acaaagtact ggagaccaac tccaaagaag 1020
attacagaaa ggcgtgcaac accacagtgt agaaaactaa catatgtctt ggaggaggtt 1080
ctctctttag cttccaagag tggcaagctg gttgaattta tcacaggagg caaaggaaag 1140
agtgtcaaag tttgttacat gcggaagcat ggcgcaatat tgcccaagtt ctctcttccg 1200
catgaagaag gtaggtatat ccatcaggag ctccagtatg aaagcatata cgagtttctt 1260
ccttatattt gcatgtttgc aaagtataag agcataagtg cggatgatat aacttatgga 1320
gatagtggtt tactgtttga tgagcgatca tctttaacca caaatcatac taaattaccg 1380
tactttgttg tccggggaag agagaatggg aaacttatta acgctcttga gatggttgtg 1440
agcatgaggg acatccagca ttattcccaa aatcctgagg ttcagttttt ccgtggttgg 1500
aaaaaggtgt tcgacacaat gcttccacat gtggagaatc atgaatgcac cattgatttc 1560
acaaatgagc agtgtggtga attggcagca gcaattaatc aatcaatctt tccagttaag 1620
aagctatcat gtaatcaatg tcgacagcac attaagaatc ttagttggga ggagtacaaa 1680
caattccttt tagcccacat gagttgtcat aggactgaat gggaagactt ccagaaagtt 1740
gatggcatga ggtatgtgaa gaaagtgatt gagacatcaa ctgcggaaaa cgcaagtctt 1800
cagacatcaa tggagattgt gcgtttaaca caaaactata agagtactca catgcttcaa 1860
atacaggata ttaataaggc tcttatgaag ggtccgtcgg ttacacaggg tgagctggag 1920
caagcttcca agcagctact agcaatgaca cagtggtgga aaaatcacat ggctttaact 1980
gatgaggatg cacttaaagt gttcaggaac aagagatctt ccaaagcact acttaaccca 2040
agtttgcttt gtgataatca gttggacaag aatggtaatt tcgtctgggg agagcgtggc 2100
aggcattcaa agcgattctt ttcgaattac tttgaagagg ttgttccttc tgaagggtac 2160
agtaagtatg tgattagaaa gaatccaaac ggacaaagag agttggcaat tgggtctctt 2220
attgtgccgc tagattttga gcgtgctcga atggcactgc agggcaaaag tgtaacaaga 2280
gagccaatta caatgtcatg tatctcaaga caagatggga actttgtgta tccttgctgt 2340
tgcgtcacac atgatgatgg aaaagctttc tattctgagc ttaagagtcc tacaaagcgc 2400
cacttggtta ttggaacatc tggtgatcca aaatacattg atctgccagc cactgatgca 2460
gataggatgt atataactaa agaaggattt tgctacctca acatcttctt ggcaatgttg 2520
gtcaatgtaa atgaagatga agccaaagac ttcacgaaga tggtaaggga tgttattgtg 2580
ccaaggctag gaaagtggcc gacaatgtta gatgtagcaa cagctacata catgctaaca 2640
gtttttcatc ctgaaaccag aaatgctgag cttccacgta ttttagttga ccatgcgtgt 2700
caaaccatgc atgtaataga ctcttttggg tccctcacag ttgggtacca tgttcttaaa 2760
gctggcacag tgaaccaatt gattcaattt gcttccaatg accttcagag cgagatgaaa 2820
ttttacagag ttggtggcga agtgcagcaa aggatgaagt gtgaaacagc acttataaca 2880
agtattttca aacctaagag gatgattcaa atccttgaga atgatccata cattcttttg 2940
atgggcctgg tttcaccttc tatcctgatt cacatgtatc gcatgaagca tttcgagaaa 3000
ggggtggagt tgtggataag taaggaacat agtgtggcaa agatcttcat tatattggaa 3060
cagctcacca agagggttgc tgcaaatgac gtgctacttg agcagcttga aatgatttca 3120
gagacttcag agagattcat gagcatatta gaggactgtc cccaagtacc accgtcatac 3180
aagacagcaa aagatttgtt aacaatgtat atagaaagaa aagcatccaa cagccagctt 3240
gttgagaatg gttttgtgga tatgaatgac aagttgtaca tggcatatga aaaaatctat 3300
tcagatcgct tgaagcagga atggcgcgca ttaagctggt tggaaaaatt ttctataaca 3360
tggcagttga aaagatttgc tccacatacg gagaaatgtt tgacaaagaa agttgtagaa 3420
gaaagcagcg catcttcagg aaactttgcg agtgtgtgct tcatgaatgc ccagtcacac 3480
ctcagaaatg taagaaatac actttttcaa aaatgtgacc aggtttggac tgcatcggtg 3540
cgagcttttg tgaggctcat aatttcgaca cttcataggt gctacagtga tattgtttat 3600
ctggtgaaca tctgtataat cttttcattg cttgtccaaa tgactagtgt actgcaaggc 3660
attgtcaaca cagcaaggag agataaagca ctcttaaata gatggaaaag gaaagaagat 3720
gaagaggccg tgatccattt gtatgaaatg tgtgaaaaga tggaaggtgg acacccaagg 3780
cttgagaaat ttttagacca tgtcaagggt gttagacctg atctactccc catagcagtg 3840
agcatgacag gacaatcaga agatgtctcc gcacaggcca aaacagcaac tcaattgcaa 3900
cttgagaaaa ttgtggcatt catggctttg ttgaccatgt gtattgataa tgaaaggagt 3960
gatgcggttt tcaaaatatt gagcaagtta aaggcatttt tcagcacaat gggtgaggat 4020
gttaaagtgc agagtcttga tgagattcaa aacattgatg aagacaagag gctcacaatt 4080
gatttcgacc ttgaaacaaa taaggagtct tccagtgttt cttttgatgt taaatttgag 4140
gcctggtgga atagacagtt ggaacagaat agagtaattc cacactacag gtcgacaggt 4200
gagtttcttg agttcacaag agaaacagca gccaaagttg caaatttgat agcaacatca 4260
agccacacag aatttttgat tcgaggtgca gttggctcag ggaaatcaac aggtttacca 4320
catcacctct caaagaaggg caaagttctg ctactagagc caactagacc gttagcggag 4380
aatgttagta agcagttgag ctttgaacct ttctatcata atgtaacact gagaatgaga 4440
ggattgagca agtttggctc aagtaacata gttgtcatga caagtgggtt tgcgtttcat 4500
tactatgtca acaatccaca acagctatct gatttcgatt ttatcataat agatgagtgc 4560
catgttcaag atagcccaac gattgcattc aactgtgcgc ttaaagaatt tgaatttagt 4620
ggcaaactta taaaagtgtc tgcaacacct ccaggaagag agtgcgaatt cacaacacaa 4680
catccagtga agttgaaagt tgaagaccat ttgtcttttc agaactttgt gcaagctcag 4740
ggtacaggat caaatgctga tatgatccaa catgggaaca atttactcgt atacgttgca 4800
agttacaatg aagttgacca attgtcacga ctattaactg agaaacatta caaggtgaca 4860
aaggttgatg ggagaacaat gcaaatggga aatgtagaga ttgcaaccac aggcacggaa 4920
gggaaaccac acttcatagt cgcaacaaat atcattgaga atggagtgac tcttgatatt 4980
gattgcgtaa ttgattttgg acttaaagtg gtggcaaccc ttgacacaga taaccggtgt 5040
gtgcgttaca acaaacagtc agtttcttat ggggagcgga tccagagact tggcagagtt 5100
ggtcgttgta aacctggatt tgcgctaagg attggacaca cgggaaaagg agttgaggaa 5160
gttcccgagt tcatagctac agaggcagcc tttctatcct ttgcttatgg gttgccagtt 5220
acaacacaaa gtgtctcgac caacatactg tcccgttgca cagtgaaaca agctcgagta 5280
gctctgaatt ttgagctaac tccatttttc accactaact tcataaagta tgatggtagc 5340
atgcacccag aaattcacag actgctcaag tcctacaaac taagggagtc cgagatgtta 5400
ttgaccaagt tagccatacc atatcagttt gttgggcagt gggtgacagt caaggagtat 5460
gaacgtcaag gtatccacct caattgtcca gagaaagtga aaataccttt ctatgtgcat 5520
ggaataccag ataagttgta cgagatgttg tgggacacag tttgtaaata caagaatgat 5580
gctggatttg gctcaattaa gagtgtgaat gcaacgaaga ttagttacac tctaagcact 5640
gacccgacag caattcctcg cacacttgca atactggacc atttgttgag tgaggagatg 5700
actaagaaga gtcattttga cacaattggc tctgctgtta ctgggtattc cttttctctt 5760
gcaggcatag ctgatggatt tagaaagagg tatttaaagg actacacaca gcataatata 5820
gccgtcctac aacaggctaa agcacagctg ctagagttcg actgcaacaa agttgacatc 5880
aacaacctgc acaatgttga gggtataggt attttaaatg cagtccaact acagagcaaa 5940
catgaggtga gcaaattttt gcagcttaaa ggaaagtggg atggaaagaa attcatgaat 6000
gatgctgttg tggctatctt cactttagtg ggcggtggtt ggatgctatg ggattacttc 6060
acaagagtca tacgtgaacc agtatcaact caaggaaaga agaggcagat acaaaagctc 6120
aaatttaggg atgcctttga cagaaaagta ggccgtgagg tgtatgcaga tgattacacc 6180
atggagcaca cctttgggga ggcatatacc aagaaaggaa agcagaaagg cagcactcgt 6240
acaaaaggaa tgggtcgcaa atcgaggaac ttcatacatc tatatggagt tgagccagag 6300
aattacagca tgattaggtt tgtagaccct ctaactgggc acacaatgga tgaacacccc 6360
agagttgata tcagaatggt tcaacaagag tttgaggata taaggaagga catgattggg 6420
gagggtgaat tggatcggca aagagtttac cataaccctg gtttacaggc ttatttcatt 6480
gggaagaata cagaggaagc actcaaagtt gacctcacac cacacagacc cacacttctc 6540
tgtcaaaaca gcaatgctat agcgggtttt ccagagaggg aggatgaatt gcgtcagaca 6600
ggcttgccac aagtagtttc caggtcagac gttccacgtg ccaaagaaag ggttgaagtg 6660
gaaagcaaat ctgtttacaa aggactcaga gattatagtg gcatttccac attaatatgt 6720
caacttacaa attcatcaga tggacacaaa gaaacaatgt ttggggttgg ctatggttct 6780
ttcattatca caaatgggca cttgtttagg aggaacaatg gaatgctcac agtcaagaca 6840
tggcatggtg agtttgtgat acacaacact acacagctca agatacattt tattcaaggg 6900
aaggatgtga ttctgattcg catgccaaag gactttcctc catttgggaa gcgcaatctc 6960
tttagacaac caaagcgtga ggaacgggtt tgtatggttg gaacaaactt tcaagagaag 7020
agcttgcgtg caacagtttc agaatcttct atgatattgc cagaggggaa aggttctttt 7080
tggatacatt ggattacaac ccaagatggt ttttgtgggt tgcctcttgt ttctgttaat 7140
gatgggcaca ttgttggaat acatggatta gcatctaatg attcagagaa gaactttttc 7200
gttccactca ctgatggatt tgagaaggaa tatctggaga atgctgataa cttgtcatgg 7260
gataagcact ggttttggga accaagcaag atagcatggg gctctttgaa tttagttgag 7320
gaacaaccaa aagaggagtt caaaatatca aagcttgtat cggatctctt tggaaacaca 7380
gtgacagtac aagggagaaa ggaaagatgg gttttagatg caatggaagg caacttagtg 7440
gcttgtgggc aagctgacag tgcattggta acaaagcatg ttgttaaagg aaagtgcccc 7500
tatttcgcac aatacctttc agtgaatcaa gaagcaaagt ccttctttga accacttatg 7560
ggtgcgtatc aaccaagccg attaaacaaa gatgcattca aacgagattt cttcaaatac 7620
aacaaaccag ttgttttgaa tgaagttgat ttccagtctt ttgagagggc agtggctgga 7680
gtgaagctga tgatgatgga atttgatttc aaggagtgtg tgtatgtgac tgatcctgat 7740
gaaatatacg actccttgaa catgaaagct gcagttggtg cacaatacaa agggaagaag 7800
caagattact tctctggaat ggatagtttt gacaaggaac gcttgcttta cctcagttgc 7860
gaaaggttat tttatgggga aaaaggagtg tggaatggat ctctgaaagc agagctaagg 7920
ccaattgaaa aagtgcaagc aaacaaaact agaacattca cagcagcacc aattgacaca 7980
ctacttggag caaaagtttg tgttgatgat ttcaacaatc aattttacag tctcaatctt 8040
acatgtccat ggacagttgg aatgaccaaa ttttatagag gttgggacaa gttgatgaga 8100
agtttacccg atggatgggt gtactgtcat gcagatggct cacagtttga tagttccctg 8160
acacctttac tactgaatgc agttcttgat gtcaggagct ttttcatgga agactggtgg 8220
gttggaagag aaatgctaga aaacctctat gctgagatag tctacacacc aatcttagca 8280
cctgatggca caatttttaa aaagttcaga ggaaacaaca gtgggcaacc atctacagtt 8340
gtggataaca ctttgatggt agtcattgcc atgtactatt cttgttgtaa gcatgggtgg 8400
tcagaggagg atattcagga aagattagtg tttttcgcca atggcgatga catcattctt 8460
gcagttagtg ataaggatac atggctatat gacactctta gcacttcgtt cgctgaactt 8520
ggtctcaatt acaactttga ggaacggaca aagaagaggg aggaattgtg gttcatgtct 8580
cacaaagcca tgttagttga tggaatttat attccaaaac ttgaacctga gagaattgtc 8640
tctattctag agtgggacag gagcaaagag cttatgcatc gcactgaggc aatatgtgca 8700
tcaatgattg aggcatgggg atacactgaa ttactgcaag agatccgcaa attttatttg 8760
tggcttttga acaaggatga gtttaaggag ctcgcttcgt ctggaaaagc accatatatt 8820
gcagagacag ctttgagaaa gctgtacaca gatgtcaatg cacaaacaag tgagctacaa 8880
agatatcttg aagtgttgga ctttaatcat attgatgact gttgtgaatc agtgtctcta 8940
caatctggta aagaaaaaga gggtgatatg gacgctgaca aggaccctaa aaaatctaca 9000
tcttcttcaa aaggtgccgg gacctctagt aaggacgtta acgtgggttc taagggtaaa 9060
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
aaaaaagcac cgactcggtg ccactttttc aagttgataa cggactagcc ttattttaac 60
<210> 18
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gcttactctt ttcgtcctca cggactcatc agtgcttgtt attgttgagg acccatcccg 60
<210> 19
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
cttcatatga tctgggtatc cgcagcccaa gcagaagagc ttactctttt cgtcctcacg 60
<210> 20
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
tagccttatt ttaacttgct atttctagct ctaaaacctt catatgatct gggtatccgc 60
<210> 21
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
caccgagtcg gtgctttttt gaggttactt ccaaaacacc aaac 44
<210> 22
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
caccgagtcg gtgctttttt attgagatga gaaattctga aagtccg 47
<210> 23
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
caccgagtcg gtgctttttt ttggaccact tgcttgagta taaacc 46
<210> 24
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
caccgagtcg gtgctttttt tcaggcaagg agaaggaagg ag 42
<210> 25
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
accggcaaca ggattcaatc ttaagaaac 29
<210> 26
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
taaaattatt gcctgacaca ctgccac 27
<210> 27
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
gaatctttag gcgtttgcca ac 22
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
acagggaaat cctttggcat c 21
<210> 29
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
gttttaccga tcaaaggcag agac 24
<210> 30
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
tagaagaacc accagcgtca atagtatcgt tagcttgatg gtgtacttca taagtatcgc 60
<210> 31
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
attgaataga atcctgttca ggcttagcgt cctttttaga agaaccacca gcgtcaatag 60
<210> 32
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
tgaatttgag tgcgatactt atgaagtaca ccatcaagct aacgatacta ttgacgctgg 60
<210> 33
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
ttttcgtcct cacggactca tcagtgcttg ttacatattt ttaacaccca aaagtgtgtg 60
<210> 34
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
gcttactctt ttcgtcctca cggactcatc 30
<210> 35
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
atggagtcgc tactaccaaa cgcagcccaa gcagaagagc ttactctttt cgtcctcacg 60
<210> 36
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
actagcctta ttttaacttg ctatttctag ctctaaaaca tggagtcgct actaccaaac 60
<210> 37
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
gttgataacg gactagcctt attttaactt gctatttcta g 41
<210> 38
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
aaaaaagcac cgactcggtg ccactttttc aagttgataa cggactagcc ttattttaac 60
<210> 39
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
caccgagtcg gtgctttttt gcaaatgaca caatcgatgc ag 42
<210> 40
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
atgagtaaag gagaagaact tttcactgga g 31
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
ttatttgtat agttcatcca tgccatgtgt aatccc 36
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
ttaggttcac aagtgggaca atcttc 26
<210> 43
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
cagcatcaca ctttcgcatt caaaac 26
<210> 44
<211> 198
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
gaggttactt ccaaaacacc aaacagggca agggaagcaa tagcgcagat gaaggctgca 60
gctctttcgg gagttaacaa caagttgttt ggacttgatg ggaacatctc aactaactcc 120
gaaaatactg aaaggcacac tgcaagggat gtgaatcaaa acatgcacac tcttttgggt 180
atgggcccac agcagtaa 198
<210> 45
<211> 297
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
attgagatga gaaattctga aagtccgtat atgcctagat atggactact gaggaatttg 60
agagatagag agctagcccg ctatgctttt gatttctatg aggttacttc caaaacacca 120
aacagggcaa gggaagcaat agcgcagatg aaggctgcag ctctttcggg agttaacaac 180
aagttgtttg gacttgatgg gaacatctca actaactccg aaaatactga aaggcacact 240
gcaagggatg tgaatcaaaa catgcacact cttttgggta tgggcccaca gcagtaa 297
<210> 46
<211> 609
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
ttggaccact tgcttgagta taaacctaat caggttgatt tattcaatac ccgggcaacg 60
agaacacagt tcgaagcgtg gtacaatgca gttaaagatg aatatgagct tgatgatgaa 120
cagatgggtg tggttatgaa tggtttcatg gtatggtgca ttgacaatgg cacatctcca 180
gatgcaaatg gcgtgtgggt gatgatggat ggagaagaac agattgaata tccgctgaaa 240
cccattgttg aaaatgcaaa accaactttg agacaaatca tgcaccactt ctcagatgca 300
gcagaagctt acattgagat gagaaattct gaaagtccgt atatgcctag atatggacta 360
ctgaggaatt tgagagatag agagctagcc cgctatgctt ttgatttcta tgaggttact 420
tccaaaacac caaacagggc aagggaagca atagcgcaga tgaaggctgc agctctttcg 480
ggagttaaca acaagttgtt tggacttgat gggaacatct caactaactc cgaaaatact 540
gaaaggcaca ctgcaaggga tgtgaatcaa aacatgcaca ctcttttggg tatgggccca 600
cagcagtaa 609
<210> 47
<211> 798
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
tcaggcaagg agaaggaagg agacatggat gcagataaag atccaaagaa gagcaccagt 60
agtagcaagg gagctggaac aagtagcaaa gatgtaaatg ttggatcaaa aggaaaggtg 120
gttccgcgtt tgcagaagat tacaaggaag atgaatcttc caatggttga agggaagatc 180
attctcagtt tggaccactt gcttgagtat aaacctaatc aggttgattt attcaatacc 240
cgggcaacga gaacacagtt cgaagcgtgg tacaatgcag ttaaagatga atatgagctt 300
gatgatgaac agatgggtgt ggttatgaat ggtttcatgg tatggtgcat tgacaatggc 360
acatctccag atgcaaatgg cgtgtgggtg atgatggatg gagaagaaca gattgaatat 420
ccgctgaaac ccattgttga aaatgcaaaa ccaactttga gacaaatcat gcaccacttc 480
tcagatgcag cagaagctta cattgagatg agaaattctg aaagtccgta tatgcctaga 540
tatggactac tgaggaattt gagagataga gagctagccc gctatgcttt tgatttctat 600
gaggttactt ccaaaacacc aaacagggca agggaagcaa tagcgcagat gaaggctgca 660
gctctttcgg gagttaacaa caagttgttt ggacttgatg ggaacatctc aactaactcc 720
gaaaatactg aaaggcacac tgcaagggat gtgaatcaaa acatgcacac tcttttgggt 780
atgggcccac agcagtaa 798
<210> 48
<211> 82
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt 60
ggcaccgagt cggtgctttt tt 82
<210> 49
<211> 804
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
gctaacgata ctattgacgc tggtggttct tctaaaaagg acgctaagcc tgaacaggat 60
tctattcaat ctaatccaaa taagggtaag gacaaagacg ttaacgcagg aacttcagga 120
actcacacag ttccaaggat taaagcaatt acttctaaga tgaggatgcc aaagtctaaa 180
ggtgctactg ttcttaatct tgagcatctt ttggaatacg cacctcagca gatcgacatc 240
tctaacacaa gagctacaca gtctcaattc gacacttggt acgaagctgt tagaatggct 300
tatgatattg gtgagacaga aatgcctaca gttatgaacg gattgatggt gtggtgtatc 360
gagaacggta cttctcctaa cgttaatggt gtgtgggtga tgatggacgg agacgagcag 420
gttgaatatc cacttaagcc tattgtggaa aacgctaagc ctactttgag acagattatg 480
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atgcctagat acggacttat cagaaacctt agagacgttg gacttgctag atacgctttc 600
gatttctacg aagttacttc tagaactcct gttagagcaa gagaggctca tatccagatg 660
aaagctgctg ctcttaagtc tgctcagcca agattgtttg gacttgatgg aggaatttct 720
actcaggaag aaaatactga aagacatact actgaagacg tttcaccttc tatgcacaca 780
cttttgggtg ttaaaaatat gtaa 804
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