一种FoMV病毒介导的GFP-ATG8表达载体及其应用
阅读说明：本技术 一种FoMV病毒介导的GFP-ATG8表达载体及其应用 (FoMV virus-mediated GFP-ATG8 expression vector and application thereof ) 是由 王华忠 岳洁瑜 胡蕊洁 于 2020-11-05 设计创作，主要内容包括：本发明构建了一种FoMV病毒介导的GFP-ATG8表达载体及其应用。该方法以TaATG8a作为监测自噬的靶标,采用基于FoMV的VOX技术在小麦植株上表达了GFP-TaATG8a融合蛋白,通过荧光观察融合蛋白在叶片和根组织的中表达情况和亚细胞定位情况,建立了在小麦活体植株上以过表达GFP-TaATG8为靶标进行自噬水平监测的技术平台,并成功应用于饥饿和药物处理下叶表皮和叶肉细胞和根细胞中表征自噬小体和自噬小泡的观察,表明通过该载体可以应用于小麦生长发育过程中或环境因素响应过程中的自噬水平监测和自噬功能研究。研究结果为深入探索重要农作物小麦的自噬调控机制和生理功能提供了技术支撑。(The invention constructs a GFP-ATG8 expression vector mediated by a FoMV virus and application thereof. According to the method, TaATG8a is used as a target for monitoring autophagy, a FoMV-based VOX technology is adopted to express GFP-TaATG8a fusion protein on a wheat plant, the expression condition and the subcellular localization condition of the fusion protein in leaf and root tissues are observed through fluorescence, a technical platform for monitoring autophagy level on a wheat living plant by taking over-expressed GFP-TaATG8 as a target is established, and the carrier is successfully applied to the observation of autophagy corpuscles and autophagy vesicles in starvation and drug treatment of leaf epidermis, mesophyll cells and root cells, and the carrier can be applied to the autophagy level monitoring and autophagy function research in the growth and development process of wheat or the environment factor response process. The research result provides technical support for deeply exploring the autophagy regulation mechanism and physiological function of wheat of important crops.)
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种FoMV病毒介导的GFP-TaATG8a表达载体及在监测小麦自噬水平上的应用。
背景技术
细胞自噬（autophagy，简称自噬）与植物生长、发育、衰老、细胞死亡和逆境响应等过程密切相关。细胞内自噬水平的监测是开展自噬调节机制和生理功能研究的必要手段。在自噬过程中，细胞质内待降解底物被包裹进双层膜结构的自噬小体，随着自噬小体外膜与液泡（动物是溶酶体）膜的融合，内膜及包裹的底物（此时称为自噬小泡）进入液泡腔被分解。多种自噬相关（autophagy-related，ATG）因子参与到自噬小体组装、底物选择、自噬小体与液泡的融合及这其中的信号调控等过程。自噬过程和ATG因子在包括酵母、动物和植物在内的真核生物中非常保守。
ATG8是自噬核心机制中研究得最清楚的ATG因子，其在被蛋白酶ATG4加工后通过一个类泛素化过程与脂类分子磷脂酰乙醇胺（PE）连接定位于自噬小体内、外膜表面，继而以互作的方式募集其他ATG因子共同作用于自噬小体的组装及与液泡的融合等过程，内膜上的ATG8随自噬小泡进入液泡腔。鉴于ATG8对自噬膜的标志性装饰作用，其与GFP或RFP的融合蛋白定位到自噬膜上后所呈现的点状荧光可作为细胞内自噬小体和自噬小泡存在的证据，点状荧光数量的鉴定可用来监测细胞内的自噬水平。细胞内自噬水平的监测是开展自噬调节机制和生理功能研究的必要手段。定位于自噬膜上的ATG8是检测细胞内自噬水平的重要靶标。
得益于遗传转化方法的成熟，拟南芥、烟草和重要农作物水稻上比较容易获得稳定过表达GFP/RFP-ATG8的转基因材料用于自噬水平的活体监测。重要农作物小麦属于遗传转化最为困难的作物，至今没有获得此类材料的报道，极大地限制了小麦上的自噬调节机制和生理功能研究。近年来，由基因枪、农杆菌、PEG或病毒介导的基因瞬时表达技术在植物基因功能研究上得到广泛应用。病毒是转运外源基因的天然载体，可通过高效的侵染过程将携带在其基因组上的目的基因导入到被感染细胞中进行表达，还可以通过病毒粒子的增殖和移动过程将目的基因导入到宿主个体的其他位置。植物上被开发为载体的病毒主要是RNA病毒，利用此类载体的具体技术包括病毒介导的过表达（Virus-medi- atedoverexpression，VOX）和病毒诱导的基因沉默（Virus-induced gene silen- cing，VIGS）两类，后者利用了RNA病毒的复制中间体dsRNA诱发的RNAi效应。病毒的宿主种属特异性决定了以特定病毒开发出来的VIGS/VOX技术只能应用于特定范围的宿主植物。小麦上，大麦条斑花叶病毒BSMV（Barley stripe mosaic virus）唯一被广泛应用于VIGS的病毒。BSMV也能应用于VOX，但其载体能稳定携带的基因片段较小（小于450-500 bp），而且目的基因只能以与病毒γb基因融合的形式进行表达。最近，马铃薯X病毒属单分子正义RNA病毒——狗尾草花叶病毒FoMV（Foxtail mosaic virus）也被开发为可在小麦上应用的VIGS /VOX载体，该载体采用农杆菌介导的转化方法在烟草叶片中表达病毒基因组RNA和组装病毒粒子，随后使用含有病毒粒子的烟草汁液摩擦接种小麦叶片，采用FoMV-VOX技术可在小麦上介导长达1800 bp的基因以非融合的形式进行表达。FoMV-VOX技术的成功为在小麦植株上表达GFP/RFP- ATG8进行自噬水平的监测提供了可能。
高等生物ATG8则是由多个成员构成的基因家族。本实验室在小麦上已鉴定出9个ATG8基因（TaATG8a-8i），证实它们参与了小麦的细胞自噬过程。本申请选择TaATG8a作为监测自噬的靶标，采用基于FoMV的VOX技术在小麦植株上表达了GFP-TaATG8a融合蛋白，通过荧光观察对融合蛋白在叶片和根组织的中表达情况进行了鉴定，建立了在小麦活体植株上以过表达的GFP-ATG8为靶标进行自噬水平监测的技术平台，可应用于深入探索重要农作物小麦的自噬调控机制和生理功能。
发明内容
针对现有技术存在的技术问题，本发明提出了一种FoMV病毒介导的GFP-TaATG8a表达载体，并将其应用于监测小麦自噬水平，为深入探索重要农作物小麦的自噬调控机制和生理功能提供技术支撑。
为实现上述目的，本发明公开如下技术方案如下：
本发明公开了一种FoMV病毒介导的GFP-TaATG8a表达载体，它是采用基于FoMV的VOX方法表达的GFP-TaATG8a，能够在激活自噬的细胞中定位于自噬膜，可用于根和叶细胞中自噬活性的监测。
本发明进一步公开了GFP-TaATG8a融合基因的VOX载体构建方法，其特征在于使用基于FoMV的VOX载体构建GFP-TaATG8a融合基因的VOX载体，设计合成引物Fo-G8a-F和Fo-G8a-R，使用该引物对，以GFP-TaATG8a融合基因表达载体pGFP-G8a为模板，扩增GFP-TaATG8a片段，将扩增片段替换基于FoMV的VOX载体上ClaI和XbaI之间的GFP片段，从而构建GFP-TaATG8a融合基因的VOX载体pFo-GFP-TaATG8a，通过插入片段的PCR扩增和DNA测序对构建载体的正确性进行确认；所述的引物序列为：
Fo-G8a-F ACAGTCGACAGCTATATGGTGAGCAAGGGCGAG和
Fo-G8a-R GCGGTCGTTGAGTG TCTAGAGCAATCCGAAGGTGT，
下划线序列是引物5’端添加的目标载体插入位点两侧的同源臂。
本发明更进一步公开了FoMV病毒介导的GFP-TaATG8a表达载体在监测小麦自噬水平上的应用。实验结果显示：通过FoMV-VOX方法获得的GFP-TaATG8a过表达植株可以应用于小麦生长发育过程中或环境因素响应过程中的自噬水平监测和自噬功能研究。为了放大反应自噬水平的信息，可使用液泡蛋白酶抑制剂E-64D或液泡酸化抑制剂ConA抑制自噬小泡降解这一终端环节，达到积累自噬结构以方便监测自噬水平的目的。本研究中，E-64D的使用可有效地在饥饿处理的小麦叶组织细胞中积累结构自噬，方便了自噬水平的监测；而ConA的使用在饥饿处理的小麦根组织上却并非必须，在未经ConA处理的根细胞中也能观察到大量的饥饿诱导的自噬结构积累。
本发明公开的监测小麦自噬水平的方法包括以下步骤：
（1）GFP-TaATG8a融合基因的VOX载体构建：使用基于FoMV的VOX载体构建GFP-TaATG8a融合基因的VOX载体，设计合成引物Fo-G8a-F和Fo-G8a-R，使用该引物对，以GFP-TaATG8a融合基因表达载体pGFP-G8a为模板，扩增GFP-TaATG8a片段，将扩增片段替换基于FoMV的VOX载体上ClaI和XbaI之间的GFP片段，验证插入片段的正确性后，将构建好的载体转化的农杆菌GV3101（pSoup-p19）的化学感受态细胞中；
（2）烟草叶片agroinfiltration：将固体培养基上生长的农杆菌单菌落接种于3 ml含50 μg/ml卡那霉素和25 μg/ml利福平的LB液体培养基，29 ℃震荡培养过夜，按1%的比例接种到扩大培养液中培养，继续震荡培养12 h，离心收集菌体后将菌体悬浮于适量MMA溶液，菌体浓度调至OD600值约为0.5，29℃条件下静置3 h，使用1 ml去掉针头的无菌注射器将农杆菌悬浮液从背面注射至烟草叶片中，注射后的烟草于黑暗条件下保存24 h后转移到正常条件下生长，注射农杆菌7 d后，将注射过的烟草叶片在研钵中用液氮研磨成粉末，按1:2（W/V）的比例加入预冷的20 mM PBS缓冲液（pH=7.2）制备成含病毒的烟草汁液，烟草汁液可直接用于小麦接种或保存于- 80℃冰箱；
（3）小麦植株的病毒摩擦接种：按1%（W/V）的比例在烟草汁液中添加灭菌的硅藻土配成病毒接种液，将接种液摩擦接种于两叶期小麦幼苗第二叶，接种后对幼苗进行超纯水喷雾处理和套袋保湿24 h，随后置于正常条件下培养；
（4）饥饿和药物处理：使用无针头的1 ml注射器将100 μM E-64D或1% DMSO（溶剂对照）直接从烟草叶片背面或从小麦叶片背面主脉切口处注射到组织中，然后将叶片剪下置于蒸馏水中并保存于黑暗条件下进行离体饥饿处理，将小麦根部剪下置于蒸馏水中并保存于黑暗条件下进行离体饥饿处理，蒸馏水中添加终浓度1 μM刀豆素A（concanamycin A）或1%DMSO（溶剂对照）；
（5）自噬小体观察：使用体式荧光显微镜、普通荧光显微镜或激光共聚焦荧光显微镜观察叶片和根组织中的GFP荧光。
所述步骤（1）中所述的VOX载体上含有35S启动子驱动的FoMV基因组RNA对应的 cDNA，病毒基因组上设计因两个重复的亚基因组启动子，并且在它们之间克隆有报告基因GFP。所述的引物序列为：Fo-G8a-FACAGTCGACAGCTATATGGTGAGCAAGGGCGAG和
Fo-G8a-RGCGGTCGTTGAGTG TCTAGAGCAATCCGAAGGTGT，
下划线序列是引物5’端添加的目标载体插入位点两侧的同源臂。所述的GFP-TaATG8a片段扩增使用的是高保真聚合酶。所述的验证插入片段的正确性是通过插入片段的PCR扩增和DNA测序对构建载体的正确性进行确认。
步骤（2）中扩大培养液为10 ml，是含50 μg/ml卡那霉素、25 μg/ml利福平、及20 mMMES、20 μM乙酰丁香酮的LB液体培养基。MMA溶液含10 mM MES，100 μM 乙酰丁香酮，10 mMMgCl2，pH=5.7。步骤（4）中，小麦叶片背面主脉切口处需提前用刀片制备
本发明更加详细的描述如下：
1.本氏烟草（Nicotiana benthamiana）和小麦幼苗常规培养。其中4-5周龄的本氏烟草植株叶片用于农杆菌agroinfiltration，两叶期的小麦幼苗用于病毒接种。
2. GFP-TaATG8a融合基因的VOX载体构建。使用基于FoMV的VOX载体构建GFP-TaATG8a融合基因的VOX载体。设计5’端添加了目标载体插入位点两侧的同源臂的引物。使用该引物对，以GFP-TaATG8a融合基因表达载体pGFP-G8a为模板，扩增GFP-TaATG8a片段。通过无缝克隆将扩增片段替换基于FoMV的VOX载体上ClaI和XbaI之间的GFP片段，从而构建GFP-TaATG8a融合基因的VOX载体pFo-GFP-TaATG8a。将构建载体转化的农杆菌化学感受态细胞。
3.烟草叶片agroinfiltration。将固体培养基上生长的农杆菌单菌落接种于含卡那霉素和利福平的LB液体培养基，29 ℃震荡培养过夜。按1%的比例接种到扩大培养基10 ml含相同抗生素及20 mM MES、20 μM乙酰丁香酮的LB液体培养基，继续震荡培养12 h。离心收集菌体后悬浮于适量MMA溶液，29℃条件下静置3 h。使用无菌注射器将农杆菌悬浮液从背面注射至烟草叶片中。注射后的烟草于黑暗条件下保存24 h后转移到正常条件下生长。注射农杆菌7 d后，将注射过的烟草叶片在研钵中用液氮研磨成粉末，加入预冷的20 mM PBS缓冲液（pH=7.2）制备成含病毒的烟草汁液。烟草汁液可直接用于小麦接种或保存于- 80℃冰箱。
4.小麦植株的病毒摩擦接种。在烟草汁液中添加灭菌的硅藻土（Celite 545）配成病毒接种液，摩擦接种于两叶期小麦幼苗第二叶，接种后对幼苗进行超纯水喷雾处理和套袋保湿24 h，随后置于正常条件下培养。
5.饥饿和药物处理。饥饿处理是将小麦叶片剪下置于蒸馏水中并保存于黑暗条件下进行离体饥饿处理。药物处理所用的是液泡蛋白酶抑制剂E-64D或液泡膜质子泵抑制剂刀豆素A（concanamycin A）抑制液泡腔的酸化以阻断自噬小泡的降解。
6.荧光观察。使用体式荧光显微镜、普通荧光显微镜或激光共聚焦荧光显微镜观察叶片和根组织中的GFP荧光。在发生自噬的细胞中，荧光蛋白标记ATG8的自噬膜定位呈现点状荧光模式，可用于表征自噬小体和自噬小泡的存在和数量（图1和图2）。但正常表皮和叶肉细胞中的GFP-TaATG8a荧光呈现与GFP类似的弥散分布，点状荧光很少见，说明正常生长植株的叶片组织具有较低水平的自噬活性。对小麦叶片进行离体黑暗诱导的饥饿处理以激活自噬，同时使用液泡蛋白酶抑制剂E64-D阻断自噬小泡的降解以积累自噬小体和自噬小泡。处理后24 h观察发现，在小麦的表皮细胞以及小麦的叶肉细胞中均存在大量的点状荧光，表明采用基于FoMV的VOX方法表达的GFP-TaATG8a能
够在发生自噬的叶表皮细胞和叶肉细胞中定位于自噬膜，可用于这两类细胞中自噬活性的监测（图3和图4）。
液泡膜质子泵抑制剂刀豆素A（concanamycin A）可以抑制液泡腔的酸化以阻断自噬小泡的降解、积累自噬小体和自噬小泡。离体黑暗诱导的饥饿处理24 h观察，在同时施加饥饿和刀豆素A处理以及单独饥饿处理的根细胞中均存在大量的点状荧光。这一结果表明采用基于FoMV的VOX方法表达的GFP-TaATG8a能够在激活自噬的根细胞中定位于自噬膜，可用于根细胞中自噬活性的监测（图5）。
本发明公开的一种FoMV病毒介导的GFP-ATG8表达载体及其应用与现有技术相比所具有的积极效果在于：
（1）本发明方法操作简单，快速简便可行，可代替常规的稳定转化技术。
（2）建立的FoMV-VOX技术可在小麦上介导长达1800 bp的基因以非融合的形式进行表达。
（3）本发明FoMV-VOX技术对小麦叶和根组织的基因功能研究都适用。
（4）本发明应用液泡蛋白酶抑制剂E-64D或液泡酸化抑制剂ConA抑制自噬小泡降解，可达到积累自噬结构以方便监测自噬水平的目的。
附图说明
图1 为GFP或GFP-TaATG8a在小麦叶片扩展情况。使用烟草叶片的汁液摩擦小麦叶片，观察小麦叶片中被病毒携带的目的基因的表达。摩擦后7 d，在摩擦的第二叶上观察到成片GFP或GFP-TaATG8a绿色荧光；摩擦后20 d，在新长出的未摩擦的第三叶上也观察到同样的绿色荧光。这一结果表明烟草汁液中含有活性FoMV病毒粒子，病毒粒子能够在小麦叶片中增殖和扩展，也能介导其携带的目的基因在小麦叶片中表达；
图2 为GFP或GFP-TaATG8a在小麦根部扩展情况。摩擦叶片后20 d，在小麦植株根部根尖以上的组织中也观察到大片的GFP或GFP-TaATG8a绿色荧光，表明FoMV病毒粒子能够移动到小麦根部非根尖组织中，并且在这些组织中介导其携带的目的基因的表达。与根尖以上的组织不同，在旺盛分裂的根尖细胞中没有观察到GFP或GFP-TaATG8a的表达；
图3和图4分别是小麦表皮和叶肉细胞中的GFP-TaATG8a荧光呈现与GFP类似的弥散分布，点状荧光很少见，说明正常生长植株的叶片组织具有较低水平的自噬活性。饥对小麦叶片进行离体黑暗诱导的饥饿处理以激活自噬，同时使用液泡蛋白酶抑制剂E64-D阻断自噬小泡的降解以积累自噬小体和自噬小泡。处理后24 h观察发现，在小麦的表皮细胞以及小麦的叶肉细胞中均存在大量的点状荧光，表明采用基于FoMV的VOX方法表达的GFP-TaATG8a能够在发生自噬的叶表皮细胞和叶肉细胞中定位于自噬膜，可用于这两类细胞中自噬活性的监测；
图5为使用液泡膜质子泵抑制剂刀豆素A（concanamycin A）抑制液泡腔的酸化以阻断自噬小泡的降解、积累自噬小体和自噬小泡。离体黑暗诱导的饥饿处理24 h观察发现，在同时施加饥饿和刀豆素A处理以及单独饥饿处理的根细胞中均存在大量的点状荧光，而未经过饥饿处理的细胞中点状荧光很少。这一结果表明采用基于FoMV的VOX方法表达的GFP-TaATG8a能够在激活自噬的根细胞中定位于自噬膜，可用于根细胞中自噬活性的监测。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所述百分含量如无特别说明均为体积百分含量，所用到的农杆菌GV3101、烟草、E-64D、DMSO、刀豆素A、卡那霉素、利福平、MES、乙酰丁香酮、 MgCl2、硅藻土、PBS缓冲液、小麦品种扬麦158种子等均由市售。
实施例1
FoMV病毒介导的GFP-ATG8表达载体用于监测饥饿和药物处理后小麦自噬水平
首先用本发明的方法构建FoMV病毒介导的GFP-TaATG8a表达载体，用于监测饥饿和药物处理后小麦自噬水平，包括以下步骤：
1.本氏烟草（Nicotiana benthamiana）和小麦幼苗常规培养。本氏烟草（Nicotiana benthamiana）和小麦品种扬麦158种子播种于装有营养土和蛭石的盆钵中，置于23℃、16 h光照/8 h黑暗条件的光照培养箱中生长。4-5周龄的本氏烟草植株叶片用于农杆
菌agroinfiltration，两叶期的小麦幼苗用于病毒接种。
2. GFP-TaATG8a融合基因的VOX载体构建。使用基于FoMV的VOX载体构建GFP-TaATG8a融合基因的VOX载体，该载体上含有35S启动子驱动的FoMV基因组RNA对应的 cDNA，病毒基因组上设计因两个重复的亚基因组启动子，并且在它们之间克隆有报告基因GFP。设计合成引物Fo-G8a-F（ACAGTCGACAGCTATATGGTGAGCAAGGGCGAG）和Fo-G8a-R（GCGGTCGTTGAGTG TCTAGAGCAATCCGAAGGTGT），引物5’端添加了目标载体插入位点两侧的同源臂（下划线序列）。使用该引物对，以GFP-TaATG8a融合基因表达载体pGFP-G8a为模板，使用高保真聚合酶Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase （诺唯赞）扩增GFP-TaATG8a片段。使用无缝克隆试剂盒pEASY-Basic Seamless Cloning and Assembly Kit（全式金）将扩增片段替换基于FoMV的VOX载体上ClaI和XbaI之间的GFP片段，从而构建GFP-TaATG8a融合基因的VOX载体pFo-GFP-TaATG8a，通过插入片段的PCR扩增和DNA测序（生工）对构建载体的正确性进行确认。
将构建载体转化的农杆菌GV3101（pSoup-p19）的化学感受态细胞（上海唯地）中，转化过程参考感受态细胞的使用手册进行。
3.烟草叶片agroinfiltration。将固体培养基上生长的农杆菌单菌落接种于3 ml含50μg/ml卡那霉素和25 μg/ml利福平的LB液体培养基，29 ℃震荡培养过夜。按1%的放大培养至10 ml含相同抗生素及20 mM MES、20 μM乙酰丁香酮的LB液体培养基，继续震荡培养12h。离心收集菌体后将菌体悬浮于适量MMA溶液（10 mM MES，100 μM 乙酰丁香酮，10mMMgCl2，pH=5.7）并将菌体浓度调至OD600值约为0.5，29℃静置3 h。使用1 ml去掉针头的无菌注射器将农杆菌悬浮液从背面注射至烟草叶片中。注射后的烟草于黑暗条件下保存24 h后转移到正常条件下生长。注射农杆菌7 d后，将注射过的烟草叶片在研钵中用液氮研磨成粉末，按1:2（W/V）的比例加入预冷的20 mM PBS缓冲液（pH=7.2）制备成含病毒的烟草汁液。烟草汁液可直接用于小麦接种或保存于-
80℃冰箱。
4.小麦植株的病毒摩擦接种。按1%（W/V）的比例在烟草汁液中添加灭菌的硅藻土（有市售）（Celite 545，Sigma）配成病毒接种液，将接种液摩擦接种于两叶期小麦幼苗第二叶，接种后对幼苗进行超纯水喷雾处理和套袋保湿24 h，随后置于正常条件下培养。
5.饥饿和药物处理
使用无针头的1 ml注射器将100 μM E-64D或1% DMSO（溶剂对照）直接从烟草叶片背面或从小麦叶片背面主脉切口处（提前用刀片制备）注射到组织中，然后将叶片剪下置于蒸馏水中并保存于黑暗条件下进行离体饥饿处理。将小麦根部剪下置于蒸馏水中并保存于黑暗条件下进行离体饥饿处理，蒸馏水中添加终浓度1 μM刀豆素A（concanamycin A）或1% DMSO（溶剂对照）。
6.荧光观察
使用体式荧光显微镜、普通荧光显微镜或激光共聚焦荧光显微镜观察叶片和根组织中的GFP荧光。在发生自噬的细胞中，荧光蛋白标记ATG8的自噬膜定位呈现点状荧光模式，可用于表征自噬小体和自噬小泡的存在和数量。如图3和图4所示，表皮和叶肉细胞中的GFP-TaATG8a荧光呈现与GFP类似的弥散分布，点状荧光很少见，说明正常生长植株的叶片组织具有较低水平的自噬活性。对小麦叶片进行离体黑暗诱导的饥饿处理以激活自噬，同时使用液泡蛋白酶抑制剂E64-D阻断自噬小泡的降解以积累自噬小体和自噬小泡。处理后24 h观察发现，在小麦的表皮细胞以及小麦的叶肉细胞中均存在大量的点状荧光，表明采用基于FoMV的VOX方法表达的GFP-TaATG8a能够在发生自噬的叶表皮细胞和叶肉细胞中定位于自噬膜，可用于这两类细胞中自噬活性的监测。
如图5所示，使用液泡膜质子泵抑制剂刀豆素A（concanamycin A）抑制液泡腔的酸化以阻断自噬小泡的降解、积累自噬小体和自噬小泡。离体黑暗诱导的饥饿处理24 h观察发现，在同时施加饥饿和刀豆素A处理以及单独饥饿处理的根细胞中均存在大量的点状荧光，而未经过饥饿处理的细胞中点状荧光很少。这一结果表明采用基于FoMV的VOX方法表达的GFP-TaATG8a能够在激活自噬的根细胞中定位于自噬膜，可用于根细胞中自噬活性的监测。
SEQUENCE LISTING
<110> 天津师范大学
<120> 一种FoMV病毒介导的GFP-ATG8表达载体及其应用
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
acagtcgaca gctatatggt gagcaagggc gag 33
<210> 2
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
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gcggtcgttg agtgtctaga gcaatccgaa ggtgt 35
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