甜瓜蚜传黄化病毒侵染性克隆重组载体
阅读说明：本技术 甜瓜蚜传黄化病毒侵染性克隆重组载体 (Melon aphid yellowed virus infectious clone recombinant vector ) 是由 刘莉铭 古勤生 彭斌 康保珊 吴会杰 于 2020-12-01 设计创作，主要内容包括：本发明提供了甜瓜蚜传黄化病毒侵染性克隆重组载体,涉及生物领域。该重组载体中含有MABYV病毒的基因组全长序列,所述MABYV病毒可为能侵染瓠瓜、甜瓜、西瓜和/或黄瓜的病毒,如,所述基因组全长序列的克隆如SEQ ID NO.1所示。本发明克服了现有技术的不足,发现：MABYV基因组基因难以一步克隆至质粒,发明人设计采用同源重组和定点插入相结合的策略才成功；本发明克隆病毒基因组载体侵入植物后,通过观察植物数周,最终鉴定其能侵染植物、使其发病。本发明可用于甜瓜蚜传黄化病毒致病性相关研究,也可用于瓜类作物甜瓜蚜传黄化病毒抗性鉴定,推进了该病毒相关的致病机理和瓜类抗病机理的研究。(The invention provides a melon aphid yellowed virus infectious clone recombinant vector, and relates to the field of biology. The recombinant vector contains a full-length genome sequence of a MABYV virus, wherein the MABYV virus can be a virus capable of infecting bottle gourds, melons, watermelons and/or cucumbers, and the full-length genome sequence is cloned as shown in SEQ ID No. 1. The invention overcomes the defects of the prior art and discovers that: the MABYV genome gene is difficult to clone to a plasmid in one step, and the inventor designs a strategy of combining homologous recombination and site-specific insertion to succeed; after the cloned virus genome vector disclosed by the invention invades a plant, the plant is finally identified to be capable of infecting the plant and causing the disease of the plant by observing the plant for a plurality of weeks. The invention can be used for researching the pathogenicity of melon aphid-borne yellowed viruses and identifying the resistance of melon aphid-borne yellowed viruses, which promotes the research on the pathogenesis and the disease-resistant mechanism of melons related to the viruses.)
技术领域
本发明涉及生物领域。
背景技术
甜瓜蚜传黄化病毒(MABYV)主要局限于寄主的韧皮部细胞内，不能通过机械方式接种，只能通过蚜虫以持久、非增殖方式进行传播，这极大地限制了它们在致病性和寄主抗病性方面的研究。
发明内容
本发明克服了现有技术的不足，发现：MABYV基因组全长序列难以一步克隆至质粒，发明人设计采用同源重组和定点插入相结合的策略才成功；本发明的病毒基因组载体导入植物后，继续实验数周，才鉴定其能侵染植物、使之发病。
第一方面，本发明提供了一种MABYV的侵染性克隆重组载体，该重组载体中含有MABYV病毒的全长cDNA(即将病毒基因组全长序列克隆为cDNA)，所述MABYV病毒可为能侵染瓠瓜、甜瓜、西瓜和/或黄瓜的病毒(侵染部位可为叶)，如，所述cDNA全长序列如SEQ IDNO.1所示。所述侵染性克隆重组载体指，该载体可侵染MABYV的天然宿主，如瓜类(瓠瓜、甜瓜、西瓜或黄瓜)。具体地，所述重组载体是以植物表达载体为骨架载体而构建成的，所述植物表达载体中含有CaMV35S启动子(数量可为2个)、核酶基因和/或终止子，所述核酶基因可为HDV-RZ或TRSV-RZ，所述终止子可为Nos终止子或CaMV35S终止子；如，所述植物表达载体为pXT1、pCASS-4Z或pJL89。
第二方面，本发明提供了上述侵染性克隆重组载体的构建方法，包括：将MABYV基因组全长序列的cDNA，以植物表达载体为骨架载体而构建得到重组载体，所述植物表达载体中可含有CaMV35S启动子(数量可为2个)、核酶基因和/或终止子，所述核酶基因可为HDV-RZ或TRSV-RZ，所述终止子可为Nos终止子或CaMV35S终止子；如，所述植物表达载体为pXT1、pCASS-4Z或pJL89。
可选地，所述重组载体的构建包括如下步骤：
4)以MABYV病毒基因组全长序列的cDNA为模板进行PCR扩增，获得扩增片段，利用同源重组策略将所述扩增片段与pXT1无缝连接(亦称无缝克隆技术)，得到pXT1-MABYV(D)(本发明人测序发现其中病毒基因组序列有缺失突变，特称为缺陷载体)；
5)根据MABYV病毒基因组全长序列中富含碱基“C”的区域的序列信息，结合缺陷载体pXT1-MABYV(D)中对应区域的序列重组情况，设计定点修复引物，以修复pXT1-MABYV(D)中对应于MABYV所述基因组全长序列的碱基突变；
6)以pXT1-MABYV(D)为模板、以所述定点修复引物为引物进行PCR扩增，获得修复产物，转化入细菌(如大肠杆菌)中，经筛选获得含有MABYV病毒基因组全长序列的侵染性克隆重组载体pXT1-MABYV。
可选地，转化入细菌前，先除去可能残留的pXT1-MABYV(D)，如用Dpn I消化。
可选地，无缝连接前，可用Stu I和Sma I双酶切处理pXT1；
可选地，同源重组可使用New England Biolabs(NEB)的试剂NEBuilderHiFi DNAAssembly Master Mix(NEBuilder高保真DNA组装预混液)。
可选地，所述富含碱基“C”的区域位于病毒基因组4129-4162nt处。
可选地，所述定点修复引物包括如下引物对：
MABYV-S：5＇-GGGTTGGTGTTGGTGCTGGGGGGGGGGAGGTGCTT-3＇
MABYV-X：5＇-AGCACCAACACCAACCCCCCCCCCACCGGCC-3＇。
可选地，所述重组载体的构建还包括步骤3)：选定步骤4PCR所需的三对引物，引物对的序列依次为：
1F：5＇-gttcatttcatttggagaggACAAAAGATACAAGCGGGGGATGC-3＇
1R：5＇-GTCGAAGAATCGCTGGAAGTC-3＇；
2F：5＇-GACTTCCAGCGATTCTTCGAC-3＇
2R：5＇-GTTGTGGTTGGCCAGTGG-3＇；
3F：5＇-CCACTGGCCAACCACAAC-3＇
3R：5＇-tggagatgccatgccgacccACACCGAAATGCCAGGGGGAG-3＇。
可选地，所述步骤4所用cDNA的制备包括：
(1)从感染MABYV病毒的瓜类作物的组织(如叶片)中提取植物总RNA，瓜类作物可为瓠瓜、甜瓜、西瓜或黄瓜；
(2)将所述总RNA反转录合成cDNA。
作为更具体的示例，本发明的一种甜瓜蚜传黄化病毒侵染性克隆重组载体的构建方法，包括：
(1)从感染甜瓜蚜传黄化病毒的瓠瓜叶片中提取植物总RNA；
(2)将总RNA反转录合成cDNA；
(3)根据病毒基因组和植物表达载体pXT1的序列信息，设计三对引物，引物序列为：
1F：5＇-gttcatttcatttggagaggACAAAAGATACAAGCGGGGGATGC-3＇
1R：5＇-GTCGAAGAATCGCTGGAAGTC-3＇
2F：5＇-GACTTCCAGCGATTCTTCGAC-3＇
2R：5＇-GTTGTGGTTGGCCAGTGG-3＇
3F：5＇-CCACTGGCCAACCACAAC-3＇
3R：5＇-tggagatgccatgccgacccACACCGAAATGCCAGGGGGAG-3＇
(4)以cDNA为模板、以上步的3对引物为引物进行PCR扩增，获得长度不等的三个片段，利用同源重组策略将它们与经StuI和SmaI双酶切处理的pXT1载体进行连接，获得重组载体pXT1-MABYV(D)；
(5)本发明人测序发现本发明的病毒基因组有富含“C”区域(位于基因组4129～4162nt处)，根据其序列信息，结合重组载体pXT1-MABYV(D)中该区域序列的重组情况，设计定点修复引物：
MABYV-S：5＇-GGGTTGGTGTTGGTGCTGGGGGGGGGGAGGTGCTT-3＇
MABYV-X：5＇-AGCACCAACACCAACCCCCCCCCCACCGGCC-3＇
(6)以重组载体pXT1-MABYV(D)的质粒为模板、以MABYV-S/MABYV-X为引物进行PCR扩增，获得修复产物，将其经Dpn I消化后直接转入大肠杆菌中，经筛选获得含有甜瓜蚜传黄化病毒全长序列的侵染性克隆重组载体pXT1-MABYV。
第三方面，本发明公开了任一在先方面所述重组载体的重组体，即采用基因工程技术将所述重组载体导入受体中。
可选地，所述重组体的宿主细胞为农杆菌，该农杆菌能侵染MABYV所能侵染的作物，如为农杆菌GV3101或C58C1。
可选地，采用电转化或液氮冻融法将含有pXT1-MABYV的重组载体转入农杆菌菌株GV3101中。
第四方面，本发明公开了任一在先方面所述重组载体的重组体，用于侵染瓜类作物(如瓠瓜、甜瓜、西瓜和/或黄瓜)的用途。可用注射器将其接种于作物，如其植株叶片中。
需指出的是，基于本专利的简单变形，亦在本专利保护范围内，如参照本发明方法构建本专利载体的突变体、缺陷体(如pXT1-MABYV(D))，或对本发明的载体进行缺失、插入、突变等操作，获得一系列不同类型的突变体。
有益效果：
1、本发明人发现，本发明的病毒基因组全长序列难以一步克隆至质粒，设计采用同源重组和定点插入相结合的策略才成功。本发明经反复筛选、验证，通过观察植物数周，才鉴定MABYV基因组经克隆至载体后，能实现侵染植物、使其发病。
2、本发明的侵染性克隆重组载体使用农杆菌介导的方式接种，为甜瓜蚜传黄化病毒提供了一种新的接种方式或植株获毒方式，与传统的介体传毒相比，操作简单且高效，特别适用于韧皮部限制类病毒的接种。
3、本发明侵染性克隆重组载体的获得使得人们可以通过保存菌源的方式、随时获得甜瓜蚜传黄化病毒的毒源，既保证了病毒遗传信息的稳定性，也使得获得的病毒毒源不涉及多种病毒复合侵染情况，保证了病毒的唯一性，提高病毒接种相关实验的可信度，可用于甜瓜蚜传黄化病毒致病性相关研究，也可用于瓜类作物甜瓜蚜传黄化病毒抗性鉴定，推进该病毒相关的致病机理和瓜类抗病机理的研究。
4、本发明所使用的方法可对构建的载体进行缺失、插入、突变等操作，获得一系列不同类型的突变体，用于该病毒致病性相关研究，也为其他在侵染性克隆构建方面有技术瓶颈的病毒提供参考。
附图说明
图1表示对MABYV基因组全长序列富C区及pXT1-MABYV(D)对应区域测序的结果；
图2示范甜瓜蚜传黄化病毒侵染性克隆接种后能诱导产生症状；
图3为瓠瓜、甜瓜、西瓜和黄瓜接种植株的系统叶片RT-PCR检测结果。
具体实施方式
一种甜瓜蚜传黄化病毒侵染性克隆重组载体的构建方法，包括以下步骤：
(1)植物总RNA的提取
从感染甜瓜蚜传黄化病毒的瓠瓜叶片中提取植物总RNA，具体操作参考RNAsimple总RNA提取试剂盒(TIANGEN，DP419)说明书；
(2)cDNA的合成
以(1)中提取的植物总RNA为模板、以Random Primer为引物进行cDNA的合成，具体如下：先加入1μLRandom Primer(50μmol/L)、1μL dNTP(10mmol/L each)、1μL RNA和7μLRNase free dH2O，混匀，将体系置于65℃保温5min后立即置于冰上；再往体系中加入4μL 5×PrimeScriptII RT Buffer、1μLPrimeScript II Reverse Transcriptase(200U/μL)、0.5μL RNase Inhibitor(40U/μL)和4.5μL RNase free dH2O，混匀，将体系置于30℃保温10min、42℃保温1h、70℃保温15min后获得cDNA模板；
(3)侵染性克隆重组载体的初次构建
①首先根据病毒基因组和植物表达载体pXT1的序列信息，设计三对引物，引物序列为：
1F：
5＇-gttcatttcatttggagaggACAAAAGATACAAGCGGGGGATGC-3＇
1R：5＇-GTCGAAGAATCGCTGGAAGTC-3＇
2F：5＇-GACTTCCAGCGATTCTTCGAC-3＇
2R：5＇-GTTGTGGTTGGCCAGTGG-3＇
23F：5＇-CCACTGGCCAACCACAAC-3＇
3R：5＇-tggagatgccatgccgacccACACCGAAATGCCAGGGGGAG-3＇
②以cDNA为模板、以上步的3对引物为引物进行PCR扩增，获得长度不等的三个片段。其中，PCR扩增体系为：2×Q5 Hot Start Mix，10μL，上游引物(10mM)1μl，下游引物(10mM)1μl，cDNA，1μL；最后用ddH2O补足至20μl。反应程序为：98℃30s；98℃10s，60℃20s，72℃2min，35cycles；72℃5min。
③最后利用同源重组策略将这三个片段与经Stu I和Sma I双酶切的pXT1载体进行无缝连接，获得重组载体pXT1-MABYV(D)。其中，同源重组体系为：NEBuilderHiFi DNAAssembly Master Mix(NEB)，5μL，pXT1酶切产物，2μL；回收产物1、2和3各1μL，总体积共计10μL，将体系混匀，置于50℃保温1h后即可进行转化、筛选。
(4)侵染性克隆重组载体的定点修复
①根据病毒基因组富含“C”区域(位于基因组4129～4162nt处)的序列信息，结合重组载体pXT1-MABYV(D)中该区域序列的重组情况(图1)，设计定点修复引物：
MABYV-S：5＇-GGGTTGGTGTTGGTGCTGGGGGGGGGGAGGTGCTT-3＇
MABYV-X：5＇-AGCACCAACACCAACCCCCCCCCCACCGGCC-3＇
②以重组载体pXT1-MABYV(D)的质粒为模板、以MABYV-S/MABYV-X为引物进行PCR扩增，获得修复产物，将其经Dpn I消化后直接转入大肠杆菌中，经测序筛选获得含有甜瓜蚜传黄化病毒全长序列的侵染性克隆重组载体pXT1-MABYV。其中，PCR扩增体系为：2×Q5Hot Start Mix 10μL，上游引物(10mM)1μl，下游引物(10mM)1μl，质粒1μL；最后用ddH2O补足至20μl。反应程序为：98℃30s；98℃10s，60℃20s，72℃4min，35cycles；72℃5min。消化体系为：Cutsmart 5μl，Dpn I 1μl，PCR产物5μl，用ddH2O补足至50μl，置于37℃保温6h后进行转化、筛选。
(5)侵染性克隆重组载体的农杆菌转化
取1μLpXT1-MABYV的质粒加入到50μL融化的GV3101感受态细胞中，于冰水浴上静置10min，再经液氮速冻5min、37℃温浴5min、冰上静置2min后，加500μL不加抗生素的LB液体培养基于28℃、200rpm复苏培养2h后涂布在LB平板(50ng/μlKan、50ng/μl Rif)上。将平板置于28℃培养48h后，长出的单胞经PCR检测后筛选获得阳性克隆。
侵染性克隆重组载体的接种和侵染性检测：
将含有pXT1-MABYV的农杆菌转至50mL LB液体培养基(50ng/μlKan、50ng/μl Rif)中培养过夜，经6,000g离心6min收集菌体，将菌体用接种缓冲液(10mM MgCl2、10mM MES和100μMAS)悬浮诱导2h后，用1mL注射器将其注射接种瓠瓜、甜瓜、西瓜和黄瓜植株的子叶，接种后将植株置于温室(25℃～28℃条件下)中继续培养。
培养至三周左右，接种pXT1-MABYV的瓠瓜植株最下部叶片开始褪绿、黄化，之后黄化症状逐渐明显，它的上部相邻叶片也开始显症，而瓠瓜未接种植株均未出现褪绿黄化症状(图2)。采集瓠瓜系统叶片，设计引物进行RT-PCR检测，发现在瓠瓜显症叶片中可以检测到甜瓜蚜传黄化病毒的侵染(图3)。甜瓜、西瓜和黄瓜植株在接种1～2个月时可以显症，同样地，在它们的系统叶片中也均能检测到甜瓜蚜传黄化病毒的侵染(图3)。以上说明，甜瓜蚜传黄化病毒侵染性克隆构建成功，它能系统侵染瓠瓜、甜瓜、西瓜和黄瓜等瓜类作物。
序列表
<110> 中国农业科学院郑州果树研究所
<120> 甜瓜蚜传黄化病毒侵染性克隆重组载体
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 5677
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acaaaagata caagcggggg atgcaaattg agactgtaaa acaacaactt gttttcagac 60
caacccgtcg agcaagcaca gacgatcgca gactatcaat atcttcattt ttagtcgatt 120
acgtctttct gtatcaattt acaaggcagt atggtgaaaa ttatctacgc ctttttcttg 180
ctcgcttgcc tctgctcatc agtgagcagc tatcagggga ctatgtttac acccctggag 240
tcaccagacg catcatggtg gctcgattcc accgccactg cggtgctccc ctcccctctt 300
caagcgcagt tgatttacga ctgcccgcca caaaagacgt tgcgcgattt ttcctcgcgc 360
gatattattc aagagttatg ggagaggggc tgcaacgacg ccagacagac ctctttagag 420
gttatgcaga atttcgaaaa tttcttactg tctggtgctc gtcgatttcg cgcaggctta 480
gggagcctac tccacacgct tttccagttg accgcatatt tgtggagctc tctaatctgg 540
gcatcggcct gcgcggtatg gcacttacta cgggagtaca ctatcgagat gctctcgctc 600
gcgtcgctct acatgtgcac cgtatatatg gtgaagacgg cggcttggat ttttggcgac 660
ttgccaattt tccttctaaa agctggcctt tcagcagcga gcggtatctc gcgggttctg 720
tggttcaaag ggaattacaa agctgagaaa tccgtggaag gatttctctc attcaaaatc 780
ccacagaccc ctcccggtaa aagcgtgttg caagtgcagc accaggatgg atcccacgca 840
ggttatgcaa cctgcgttgc acttttcaat ggatcaacag ggctcataac agcccaccat 900
gtgatcactc ctggtgctaa aatagtctcc actcggaatg gctctaaaat cccagcctcc 960
gagtttcaaa ttaaattaga aaactccaag agagacttga tactgatgac cggcccacca 1020
aattgggaag gggccttggc ttgcaaagcg tcacaaatcc agactgctaa caatttatgc 1080
aagtccaagg cgaccttttt cgcctggaac ggtgaagatt gggagtcatc aaatgctgaa 1140
attgtcgggg tttcagcatg tagaaattat gtatcagtgc ttagcaacac gaatcccggc 1200
cacagcggca ccccgtactt caatggaaaa acattgttgg gtgtccatat tgggggcgca 1260
aacgatgaaa atgccaatta cttagccccc atccctgccg tgcccggtct cacgtcacca 1320
aaatacgttt tcgagaccac agcaccccaa ggccgcttgt ttaacgatga agaaatcgcg 1380
gcgttagtag aggagttcag catgtccgag gtcgcctcaa ttatgagggc ccggaaaggt 1440
aaacaagtat atgttgaaga ggctgctcct aagcagggaa acgacgacgc ggcggcgacc 1500
gcgcaaacaa ccggcccaca cttagccacc cagggcaacg gaggaagcag tacaaaagag 1560
ccatcaacaa ttgctgctcc ttcttcaccg aaggaaccct tgccccaaga accatcgcga 1620
gccacgagca cgaaccatgg aatgatgaaa aaccgcgatg cttctgtgca atccccggac 1680
acaactgctt cttcagaaac tttatcagag atcaagaatg caatactgga gagaataaac 1740
ctccagtcaa tagagaagca ggttgtggaa gccttgatga agaaggccac gaggaatcga 1800
ggaaagaggc aacaaaaaga caagccgaag acttccagcg attcttcgac tcccaataca 1860
catgggagcc gggaagtgga aaagaagccc ctggattcaa acaggtcggc cgcctccccg 1920
agttttacca ccccaagcaa aagacggggt cgaaatgggg ggccaagata tgccgacagc 1980
acccagagat ggatgcctac acccagggct tcgggtggcc acagttcggt gcccaggccg 2040
aactgaaatc cttgcggcta caagccgcca ggtggctgga gcgcgcccag ttcgttaaaa 2100
tcccctcatc tgaggagcgg gagcgcgtaa tcaggaaatg ctgtgaggcc tacaggaatg 2160
ccaaaactat agggcccaac gcaacaagag gagatagctt atcctgggaa ggattccttg 2220
aagattttaa gcaagctgtc ttctcgctcg aatttgatgc aggcatcggc gtaccataca 2280
ttgcttatgg aaggccaacc caccgggggt gggttgaaga tccaaaatta ttgccgatct 2340
tagctcgcct gacctttaac cggctacaga agatgttaga ggttaggttt gagcatctaa 2400
gccctgcgga gcttgtgcag gcgggtctct gtgacccgat acgtgtgttt gttaaaggtg 2460
aaccgcacaa gcagagcaaa ttagatgaag gccgctaccg cctcatcatg agcgtttcct 2520
tgatagatca attggtagcc cgggttttat tccagaacca gaataaaaga gaaatcactc 2580
tgtggagggc agtaccctct aaacccggtt ttggcttgtc tacggatgag caagtcgtgg 2640
agttcatgga aatactctcc gcgcaggtgg gggttgcacc caaagaatta ataggcaatt 2700
ggcaacacca ccttattgcg accgactgct ccggctttga ctggagcgtt tcggactggc 2760
tccttgaaga tgatatggaa gtccgaaacc gcctgacgct ggacattaat aagaccacca 2820
agcgcttaag atcagcttgg ttgaagtgca tctcgaatag cgtcctcagc ctctccgatg 2880
ggaccctcct gtcacaacag gtccccggag tacagaaatc tggcagctac aatacctcat 2940
cctccaattc taggattcga gtgatggctg cttatcattg cggggctgag tgggcaatgg 3000
cgatgggcga tgacgccctc gagtcagtcg gatcaaacct agcgaaatac gctaagctgg 3060
gttttaaagt cgaggtttcc tcaaaactgg aattttgctc acatatcttt gaacgtgagg 3120
acctcgccat tccggtcaac aaagccaaaa tgatatacaa gttgatacat ggctatgaac 3180
cggaatgtgg caatgctgag gtcttgatta actatctgac cgcctgtttc gcagttctca 3240
acgaattgcg gtcggatcct cagcttgtct cgactctcca tcagtggctg gttcttccag 3300
tgcagccaca aaagatataa ggggagtata aagaacacta gccggaaata cgttgttgca 3360
attgccggaa gtttaagcca actacaaaat aggccaagcg gacttcagat tcgtagcagg 3420
attcacatcg ggcttcctgg cagctatacc actttgcgca ctaggcctat acctaatcta 3480
cctaaagatt tcagcccacg ttcgatcaat tgttaatgaa tacggtcgcg gctaggaatc 3540
aaaatggcat gggaaggagg agacggaacc gtcgacgcac ttcaaagagt aaccgcgtgg 3600
ttgtggtcca aaccactggc caaccacaac gcggaagacg acgacgacga aatccaagac 3660
gttctcctcg aggaggcaga gctggaggac gcccaggtga aacatttgta ttcagcaaag 3720
acaatctcac gggcagttcc tccggagcaa tcactttcgg gccgtctcta tcagagagcc 3780
cagcattcag ctctggaata ctcaaggcct accatgagta taaaatctca atggtcaagt 3840
tggagttcat ctccgaggcc tcttccacct cctcaggttc catctcttat gagctggacc 3900
cccactgcaa gcttaacgcc ctccaatcca cggttaataa attcggaatc acgaagagtg 3960
gatctagaac atggagcgcg aagctcatca acgggctgga atggcacgac gccacggaag 4020
atcaattccg catcctatac aaaggaaacg ggagctcttc aacggcggga tcgttcaggg 4080
tcaccatcaa gtgccaggtc cagaacccga aataggtaga aagcacctcc ccccccccag 4140
caccaacacc aacccccccc ccaccggccc cctcacccga gcccacacct tgtaaaggcg 4200
ctcgtttctg gggctatgag ggcaatccac aaagcaagat acaaacggca gaaaacaata 4260
gaaacattga ttcaaggccg ttgaattatg tatccatgta ccggtgggaa gatgagaaat 4320
gggatcaagt taatctgcaa gctggctact caagaaatga tagacgatgt atggaaacgt 4380
acttcgtgat accggcaaac aagggaaagt ttcacgtgta ccttgaagcc gatggagaat 4440
tcgtcgtaaa acacataggc ggcgatctcg atggtagctg gcttggaaac atcgcgtatg 4500
atgtatccca gcgaggttgg aatattggaa attacaaagg ttgcagcatt aagaattacc 4560
agtcgaaaac gacctttgta gctggacacc ctgacgcatc catgaatgga aagaactttg 4620
atgcggctag ggcagtggaa gttgactggt tcgcctcatt tgaactagaa tgtgatgatg 4680
acgaaggcag ttggaggatc tatcctcccc ccatccagaa ggacagttca tataattaca 4740
ctgtctcgta cggaaactac acagagaaat actgtgaatg gggagccgtt tccatctcta 4800
ttgatgagga caacgccaca gggagggtgc tacagagaat taaaccacgt aagggggtaa 4860
tgacgtggtc aacgcccgag ccggaaagac aaccggttga acaaactccg gttcaagaac 4920
cgtccgagac atctgggctc gatgccccgc ctacgacaaa acaagaagac gaaacaaccg 4980
acgacctagg cgggacgttt aaagaacccc aaatccctga gttttcgacg ccaatgcata 5040
tgctagcgcg agatttgggc gggctcacgg aatcttcttc cagagcgccc gagggagtgg 5100
ctagctgggt ccagctagaa gcggatccag tgaatgaaag tgaatattcc tcagataatg 5160
agacgatcgc gagccctccc accacaaccg tttcctctcc cttcacttcg attccgaaca 5220
cggaaagggt gcttcaaatg cccggagtgt accaaggtga ccgacagatc gcttcaagcg 5280
tgttggatga acaccgtaaa aggtccttcg caaagcgcct cctcccgagt ttgggaggat 5340
ctagagcttc agctctcagt ggagggactc ttcgccaaaa gcattcagat ttgattaagc 5400
aatatatgac ggcggcagag catgcggaag cgcagaggat ccggaaccaa ctcggcaaag 5460
gtgctcaaac tcgatacatc gagtctttaa acttgcacga ccgagtataa agaaccgctt 5520
tgtggagacg cgcgtgactc cacccggcta caggtgcccg accaaagacc tgatgacatc 5580
aagccaaaga tgtaaaattg gaacgactcc gaaaggatag gcaacgaatg ttctcactct 5640
tgtgagtaca gggggactcc ccctggcatt tcggtgt 5677
<210> 2
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gggttggtgt tggtgctggg gggggggagg tgctt 35
<210> 3
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
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<210> 4
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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<210> 5
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<210> 9
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<212> DNA
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<400> 9
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