一种多通道集成式阵列光电化学传感电极及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种多通道集成式阵列光电化学传感电极及其制备方法和应用 (Multi-channel integrated array photoelectrochemical sensing electrode and preparation method and application thereof ) 是由 李迎春 孙誉东 刘江 杨娇 于 2021-09-16 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种多通道集成式阵列光电化学传感电极及其制备方法和应用,所述多通道集成式阵列光电化学传感电极的基底为石英玻璃,基底上设置有阵列式相互间隔排列设置的工作电极、工作电极导电层、绝缘层、对电极和参比电极,结构简单,检测快速,制作低成本,高灵敏度,具有普适性,其作为基础电极能够在进一步常规纳米/生物材料修饰后应用于蛋白、核酸、化学小分子等生物、环境污染物的检测,故而具有广阔的市场应用前景。(The invention discloses a multichannel integrated array photoelectrochemical sensing electrode and a preparation method and application thereof, wherein the substrate of the multichannel integrated array photoelectrochemical sensing electrode is made of quartz glass, and the substrate is provided with a working electrode, a working electrode conducting layer, an insulating layer, a counter electrode and a reference electrode which are arranged at intervals in an array manner.)
技术领域
本发明属于光电化学分析技术领域，具体涉及一种多通道集成式阵列光电化学传感电极的制备方法，且还涉及所制备的多通道集成式阵列光电化学传感电极及所述多通道集成式阵列光电化学传感电极的应用。
背景技术
随着分析科学的不断发展，新的分析方法不断涌现。自20世纪60年代光电化学过程阐明到21世纪初，光电化学分析方法作为一种新的分析方法开始出现并不断快速发展。光电化学分析方法是基于电极/溶液界面的光诱导电子转移过程的光学-电化学分析方法。该方法的基本原理是：电极表面的光电转换材料被光信号激光从基态跃迁到激发态，从而产生激发态电子-空穴对，当溶液中存在电子受体时，电子-空穴对中的激发态电子可以转移给电子受体，产生光还原电流，而当溶液中存在电子给体时，电子-空穴对中的空穴可以从电子给体夺取电子，产生光氧化电流。光电化学分析方法的激发能量(光)与检测信号(电)分属于不同的表现形式，故其具有较低的背景影响和更高的灵敏度，其中光电化学生物传感器因其对生物分子具有良好的检测能力而备受关注。与荧光、化学发光、电化学发光等光学检测技术相比，这种基于光电流的光电化学检测方法能够简化设备、降低成本，因此光电化学分析方法具有更灵敏的检测能力和更广泛的应用前景。
然而，目前围绕光电化学分析技术进行的研究大都依赖于传统的三电极体系，其包含工作电极，参比电极和对电极。基于此，光电化学分析体系操作前需要对不同电极进行不同的前处理且研究过程中需要定期分别清洗及更换溶液，溶液使用体积较大，存在使用重复率低、产生大量废液且步骤繁琐等缺陷。
CN 113138212 A公开了一种低成本高通量电化学与光电化学传感器及其制备方法，所述制备方法包括以下步骤：步骤1)：将导电材料和/或光电材料的分散液构筑大面积、高均匀、高导电的薄膜电极和/或光电薄膜；步骤2)：构筑微孔阵列；步骤3)：采用胶粘或热压方式将步骤2)得到的微孔阵列薄膜电极和/或光电薄膜组装成两电极微孔阵列传感器；步骤4)：在步骤3)得到的绝缘封装后的可寻址两电极微孔阵列传感器表面滴加测试溶液形成液滴检测池阵列，基于电或光激发信号对液滴检测池阵列的寻址激发，即得到低成本高通量电化学与光电化学传感器。该专利申请的传感器为单通道，不能同时检测多个目标，且通过过滤喷墨法制备的工作电极在使用过程中极易脱落。
CN 111812171 A公开了一种集成式光电化学传感电极制备方法及其应用，所述电极基底为导电玻璃，基底上设置有工作电极、第一绝缘层、对电极、参比电极、第二绝缘层，通过下列方法制备而成：(1)制备工作电极，采用丝网印刷技术，以导电银浆为材料，将其印刷于导电玻璃表面，烘干；(2)制备第一绝缘层，采用丝网印刷技术，以绝缘油墨为材料，将其印刷于整个导电玻璃表面，工作电极触点处不印刷，烘干；(3)制备对电极，采用丝网印刷技术，以导电金属/碳浆料为印刷材料，在第一层绝缘层表面印刷对电极及导线与触点，烘干；(4)制备参比电极，采用丝网印刷技术，以银/氯化银浆料为印刷材料，在第一层绝缘层电极表面印刷参比电极与导线与触点，烘干；(5)制备第二绝缘层，采用丝网印刷技术，以绝缘油墨为材料，覆盖除对电极、工作电极、参比电极及其触点以外的其他区域，烘干。很显然，该集成式光电化学传感电极仅能测定一种物质，无法实现多种检测物的同时分析。
综上所述，如何能够简单且环保地检测多种目标物成为了光电化学分析
技术领域
的研究重点。
发明内容
鉴于上述问题，本发明对现有光电化学传感器件进行，提供了一种多通道集成式阵列光电化学传感电极，其结构简单，检测快速，制作低成本，高灵敏度，具有普适性，其作为基础电极能够在进一步常规纳米/生物材料修饰后应用于蛋白、核酸、化学小分子等生物、环境污染物的检测，目前国内外并没有该类多通道光电极报道与售卖，故而具有广阔的市场应用前景。
为了实现上述目的，本发明的第一方面提供一种多通道集成式阵列光电化学传感电极的制备方法，其包括以下步骤：
(1)制备工作电极：在石英玻璃的表面制备阵列式相互间隔排列设置的工作电极；
(2)印刷工作电极导电层及连接点：采用丝网印刷技术，以导电银浆为材料，将其印刷于整个石英玻璃表面，烘干；
(3)制备绝缘层：采用丝网印刷技术，以绝缘油墨为材料，将其印刷于整个玻璃表面，工作电极触点及工作电极区域不印刷，烘干；
(4)印刷对电极：采用丝网印刷技术，以导电银浆料为印刷材料，在绝缘层表面印刷对电极及导线与触点，烘干；
(5)印刷参比电极：采用丝网印刷技术，以银/氯化银浆料为印刷材料，在绝缘层电极表面印刷参比电极与导线与触点，烘干，即获得多通道集成式阵列光电化学传感电极。
目前光电化学传感电极以普通玻璃为主，其主要成分为硅酸钠、二氧化硅和硅酸钙，含有较多杂离子，在形成集成式多通道传感电极时各工作电极在测试过程极易形成干扰，无法精确实现测量，故而不能用作多通道电极。而石英玻璃是由二氧化硅制造的特种玻璃，硬度和透明性很高，非常适合用作电化学电极。
此外，在本发明的多通道集成式阵列光电化学传感电极的制备过程中，首先制备工作电极，在石英玻璃表面溅射ITO导电层并激光刻蚀出图案，作为工作电极，而现在市场上的电极均是不透明基底，限制了其光电化学方面的应用。
优选地，在上述制备方法中，所述步骤(1)的具体过程是：在石英玻璃表面镀上一层氧化铟锡(ITO)，然后采用激光刻蚀技术在石英玻璃表面刻蚀阵列式相互间隔排列设置的工作电极，清洗即可。
优选地，在上述制备方法中，所述导电银浆是通过以下方法制备而成，将银粉与添加剂混合均匀即得，所述银粉为粒径为400-500nm的超细银粉。
更优选地，在上述制备方法中，其中所述银粉与添加剂的质量之比为9:1，更优选地，在上述制备方法中，所述添加剂为环氧树脂、四氢呋喃、树脂固化剂和聚乙二醇，所述添加剂环氧树脂、四氢呋喃、树脂固化剂、聚乙二醇各组分质量比为1：(2-3)：(0.2-0.3)：(0.05-0.1)。同时，当银粉粒径为400-500nm时，能混合更充分，电导率更好，更容易通过网板，完成印刷。
作为优选地，所述步骤(2)到(5)中，印刷所述导电银浆的丝网印刷的目数均为200目。
所述银/氯化银浆料的制备方法与所述导电银浆的制备方法相同，将银替换为银和氯化银的混合粉末即可，所述银与氯化银的粉末质量比为1:1，所述混合粉末的粒径为400-500nm，通过添加氯化银制备参比电极。
最优选地，在上述制备方法中，所述步骤(3)中的绝缘油墨为加热固化型油墨。特别地，所述步骤(3)中的绝缘油墨为购自马来宾环保油墨有限公司的9061。
作为优选地，在上述制备方法中，所述步骤(3)中印刷所述导电层的丝网印刷次数3次-6次，每次烘干时间为20-30分钟。
作为优选地，在上述制备方法中，所述步骤(5)中印刷所述参比电极的丝网印刷次数3-6次，每次烘干时间为20-30分钟。
此外，根据本发明的第二方面，还提供一种通过上述方法制备多通道集成式阵列光电化学传感电极的方法制备的多通道集成式阵列光电化学传感电极，所述电极的基底为石英玻璃，基底上设置有阵列式相互间隔排列设置的工作电极、工作电极导电层、绝缘层、对电极和参比电极。
本发明多通道集成式阵列光电化学传感电极以石英玻璃为基底，其表面印刷有工作电极、工作电极导电层、绝缘层、对电极和参比电极，所述工作电极为阵列式相互间隔排列布置，可见多个工作电极共用一套对电极和参比电极。
优选地，在上述多通道集成式阵列光电化学传感电极中，所述工作电极的个数为2个以上。
之外，根据本发明的第三方面，还提供上述多通道集成式阵列光电化学传感电极的应用，其中所述应用包括将所述多通道集成式阵列光电化学传感电极作为基础电极在光电化学传感器方面的应用。
所述电极进行常规纳米/生物材料修饰后，可用于蛋白、核酸、化学小分子等生物、环境污染物检测。
本发明制备的多通道集成式阵列光电化学传感电极目前尚无报道以及商品化，将多通道集成式光电化学传感电极引入到光电化学传感或光电化学检测领域，使光电化学传感或光电化学检测更容易微型化，使光电化学传感或光电化学检测的取样量减少等，并能够在一块电极上进行多种物质/不同物质进行同时分析等优点，而且检测过程更容易实现自动化，操作方便并且减少了人为因素对分析结果的影响，具有重要的学术意义和实用价值。本发明制备的多通道集成式阵列光电化学传感电极能够对遗传基因核酸进行高灵敏、高特异性检测。
优选地，所述应用为通过光电化学检测HPV分型，所述具体的检测过程为：
(1)制备传感器：在多通道集成式阵列光电化学传感电极滴加TiO2/Au修饰材料并烘干，在修饰材料上滴上1％的Nafion溶液的方式固定材料，随后将9种的ssDNA探针用TCEP进行还原处理以减少S-S键，随后将还原的ssDNA探针溶液修饰在工作电极上，并将修饰的电极孵育过夜，之后去除电极表面上过量的探针溶液。然后连接有ssDNA探针的电极于CdS溶液中并在30-45℃下孵育30-90分钟，然后用PBS缓冲溶液冲洗电极以去除多余的CdS；然后将电极在含有1mM MCH的PBS缓冲溶液中于30-45℃下孵育30-90分钟以钝化表面阻断任何非特异性结合位点，然后用PBS缓冲溶液冲洗电极。然后将清洁的电极用惰性气体干燥并用作检测目标序列的传感器；
(2)绘制标准曲线：将一系列不同浓度的HPV亚型核酸序列的标准溶液通过步骤(1)制备的传感器采用电化学工作站进行光电化学测量，获取光电流信号，通过得到的光电流响应信号与标准溶液浓度的线性关系绘制标准曲线；
(3)检测待测样品：将含有HPV亚型核酸序列的检测样品经扩增通过步骤(1)制备的传感器采用电化学工作站进行光电化学测量，获取光电流信号，将待测样品的光电流信号与步骤(2)获得的标准曲线比较进行计算，获得待测样品中的HPV亚型核酸序列的浓度。
DNA探针主要由两部分组成：1)近5’端和近3’端的核苷酸由长度为5-8对碱基序列互补而形成的茎干区(Stem)；2)能与目标核酸按照碱基互补配对发生特异性结合的环状区(Loop)，包含约20个碱基的寡核苷酸序列。在自由状态下，DNA探针通过茎干区互补的碱基相互杂交形成发夹型结构，这时近3’端修饰的信号分子靠近电极表面，产生较强的光电信号；当有互补的目标核酸序列存在时，该核酸探针环状区的碱基与之杂交形成稳定性与刚性更强的双螺旋结构，使3’末端的信号分子远离电极而发生信号减弱，溶液中目标核酸越多，信号分子的光电信号减弱的程度越强，通过检测杂交前后信号分子的变化可实现对目标核酸的定量分析。
在本发明中，所述MCH为6-巯基己醇，为钝化剂，所述PBS缓冲溶液成分包含NaCl136.89mM；KCl 2.67mM；Na2HPO4 8.1mM；KH2PO4 1.76mM，且pH为7.4。
优选地，在上述检测过程中，将连接有ssDNA探针的电极于CdS溶液进行孵育可通过将CdS溶液滴加到连接有ssDNA探针的电极的表面进行孵育。
优选地，在上述检测过程中，检测条件为：10W发光二极管灯作为激发光源，365nm波长作为激发波长，光强为20mW cm-2，每10秒打开和关闭一次灯，电位为0.0V。
在上述检测过程中，CdS需要通过20mg/mL EDC和10mg/mL NHS进行处理过程，EDC/NHS作为Zero-length crosslinker活化硫化镉量子点表面羧基，进而与探针上氨基反应，是用来枝接氨基和羧基是在电化学领域修饰电极常用的一对试剂。
优选地，所述应用为同时检测不同HPV分型，所述具体的检测过程为：
(1)制备传感器：在多通道集成式阵列光电化学传感电极上滴加TiO2/Au修饰材料并烘干，在修饰材料上滴上1％的Nafion溶液的方式固定材料，随后将9种的ssDNA探针用TCEP进行还原处理以减少S-S键，随后将还原的ssDNA探针溶液分别修饰在不同的工作电极区域上，并将修饰的电极孵育过夜，之后去除电极表面上过量的探针溶液。然后连接有ssDNA探针的电极于CdS溶液中并在30-45℃下孵育30-90分钟，然后用PBS缓冲溶液冲洗电极以去除多余的CdS；然后将电极在含有1mMMCH的PBS缓冲溶液中于30-45℃下孵育30-90分钟以钝化表面阻断任何非特异性结合位点，然后用PBS缓冲溶液冲洗电极。然后将清洁的电极用惰性气体干燥并用作检测目标序列的传感器；
(2)绘制标准曲线：，将一系列不同浓度的HPV亚型核酸序列的标准溶液扩增后通过步骤(1)制备的传感器采用电化学工作站进行光电化学测量，获取光电流信号，通过得到的光电流响应信号(I)与原始信号差值(I0)的比值(I0-I/I0)对标准溶液浓度(lgc)进行绘制线性关系标准曲线；
(3)检测待测样品：将含有九种HPV亚型核酸序列的检测样品扩增后通过步骤(1)制备的传感器采用电化学工作站进行光电化学测量，获取光电流信号，将待测样品的光电流信号与步骤(2)获得的标准曲线比较进行计算，获得待测样品中的HPV亚型核酸序列的浓度。
本发明通过简单的多步、多层印刷操作，将对电极及参比电极直接制备与工作电极同在石英玻璃的表面，实现了多通道光电化学体系的集成，构建了一种新型的多通道集成式阵列光电传感电极。该传感器能够对多种待分析物质进行高灵敏、高特异性检测，本发明以HPV为例，采用在电极上修饰光电活性材料以及多种核酸探针对目标核酸进行检测，结果表明检测灵敏度达10fmol/L，能够进行九种HPV亚型基因进行分型，具有超高的检测灵敏度和准确性，高于其他传统光电化学电极。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明通道集成式阵列光电化学传感电极构造简单，无需复杂的制备工艺，易组装，成本低廉，且重量轻、可便携，制作简单，无需专业人员和复杂的仪器设备；
(2)本发明通道集成式阵列光电化学传感电极制备的传感器能够在一块电极上的不同工作电极区域修饰不同的材料如适配体，酶等，以便进行多种物质/不同物质进行同时分析等优点，而且检测过程更容易实现自动化，检测重复性强，操作方便并且减少了人为因素对分析结果的影响，具有重要的学术意义和实用价值；
(3)本发明制备的电极能够对遗传基因核酸进行高灵敏、高特异性检测，可以应用于医学辅助诊断，环境监控，食品安全等检测领域，比如检测小分子，蛋白，病毒核酸等；
(4)本发明通道集成式阵列光电化学传感电极允许高密度检测，并整合到一个微型期间中，结合小型的电化学工作站和手机可实现野外和家庭诊断，可见本发明具有特别好的应用前景。
附图说明
图1是本发明通道集成式阵列光电化学传感电极的一个实施例的制备流程图；
图2是图1所示的制备流程制备的通道集成式阵列光电化学传感电极的实物照片；
图3是本发明通道集成式阵列光电化学传感电极制备的传感器对不同HPV分型检测的光电流-时间曲线；
图4是图3所示的不同HPV分型检测出来的光电流信号与标准溶液浓度之间的线性拟合；
图5是本发明通道集成式阵列光电化学传感电极制备的传感器对不同HPV分型选择性检测的结果对比图；
图6为本发明通道集成式阵列光电化学传感电极制备的传感器对HPV(6,11,16,18,31,33,45,52,58)分型连续循环光照稳定性检测的光电流-时间曲线。
具体实施方式
为使本发明技术方案和优点更加清晰明了，下面结合附图和应用实施例对本发明的技术方案进行更清楚完整的说明。在所述实施例中，所用设备如无做特殊说明的，即同常规岩板所用生产设备相同。
如图1和图2所示，本发明的多通道集成式阵列光电化学传感电极以石英玻璃为基底，基底上设置有阵列式相互间隔排列设置的工作电极、工作电极导电层、绝缘层、对电极和参比电极。所述工作电极的数量为9个，阵列式相互间隔排列布置，多个工作电极共用一套对电极和参比电极。
本发明多通道集成式阵列光电化学传感电极在制备过程中根据基底的大小，可以同时在一块基底上制备多个电极，在图1和图2中，一次性在石英基底上制备了8个多通道集成式阵列光电化学传感电极。
另外，在上述多通道集成式阵列光电化学传感电极中，所述工作电极的个数可以为任意多个，如2个，3个，4个等等，均可以依使用者的要求而进行定制，包括阵列排布的图案都可以根据使用者的要求而进行布置。
如图1所示，本发明多通道集成式阵列光电化学传感电极的制备过程如下：
(1)制备工作电极：在石英玻璃的表面制备阵列式相互间隔排列设置的工作电极；
(2)印刷工作电极导电层及连接点：采用丝网印刷技术，以导电银浆为材料，将其印刷于整个石英玻璃表面，烘干；
(3)制备绝缘层：采用丝网印刷技术，以绝缘油墨为材料，将其印刷于整个玻璃表面，工作电极触点及工作电极区域不印刷，烘干；
(4)印刷对电极：采用丝网印刷技术，以导电银浆料为印刷材料，在绝缘层表面印刷对电极及导线与触点，烘干；
(5)印刷参比电极：采用丝网印刷技术，以银/氯化银浆料为印刷材料，在绝缘层电极表面印刷参比电极与导线与触点，烘干，即获得多通道集成式阵列光电化学传感电极。
作为优选地，所述步骤(1)的具体过程是：在石英玻璃表面镀上一层氧化铟锡(ITO)，然后采用激光刻蚀技术在石英玻璃表面刻蚀阵列式相互间隔排列设置的工作电极，清洗即可。
作为优选地，所述工作电极导电层、绝缘层、对电极、参比电极的印刷次数之比为3:6:3:3，工作电极导电层、对电极、参比电极印刷次数3次保证优良的导电性，绝缘层印刷次数6次，保证优良的绝缘性。
作为优选地，所述导电银浆是通过以下方法制备而成，将80g的超细银粉与添加剂混合均匀即得，所述银粉为粒径为400-500nm的超细银粉，其中所述银粉与添加剂的质量之比为9:1，所述添加剂为环氧树脂、四氢呋喃、树脂固化剂和聚乙二醇，且所述添加剂环氧树脂、四氢呋喃、树脂固化剂、聚乙二醇各组分质量比1：(2-3)：(0.2-0.3)：(0.05-0.1)，该比例既保证了制备材料的导电性，又保证了粘结性。
作为优选地，所述步骤(2)到(5)中，印刷所述导电银浆的丝网印刷的目数均为200目。
所述银/氯化银浆料的制备方法与所述导电银浆的制备方法相同，将银替换为银和氯化银的混合粉末即可，所述银与氯化银的粉末质量比为1:1，所述混合粉末的粒径为400-500nm，通过添加氯化银制备参比电极。
所述步骤(3)中的绝缘油墨为加热固化型油墨(马来宾,9061)，所述步骤(3)中的绝缘油墨为购自马来宾环保油墨有限公司的9061。
作为优选地，在上述制备方法中，所述步骤(3)中印刷所述导电层的丝网印刷次数3次，每次烘干时间为20分钟。
作为优选地，在上述制备方法中，所述步骤(3)中印刷所述绝缘层的丝网印刷次数6次，每次烘干时间为30分钟。
作为优选地，在上述制备方法中，所述步骤(3)中印刷所述对电极层的丝网印刷次数3次，每次烘干时间为20分钟。
作为优选地，在上述制备方法中，所述步骤(5)中印刷所述参比电极的丝网印刷次数3次，每次烘干时间为20分钟。
本发明多通道集成式阵列光电化学传感电极目前尚无报道以及商品化，将所述多通道集成式阵列光电化学传感电极引入到光电化学传感或检测领域，则光电化学传感或检测更容易微型化，进而使光电化学传感/检测的取样量更少等，且能够在传感电极上进行多种物质的同时分析，并更使检测过程容易实现自动化，同时具有操作方便并且减少了人为因素对分析结果的影响的优点，可见具有重要的学术意义和实用价值。此外，本发明制备的多通道集成式阵列光电化学传感电极能够对遗传基因核酸进行高灵敏、高特异性检测。本发明对光电化学技术相关的光电极制备、电极修饰方法、电化学测试手段很深刻的启发，为后续将开展的光电化学检测/传感方法的设计发展奠定了基础。
装置实施例制备本发明多通道集成式阵列光电化学传感电极
预备工作：采用CAD软件进行丝网印刷图形的设计、采用光掩模法制备丝网印刷网板，所述导电银浆是通过以下方法制备而成，将80g的超细银粉与添加剂混合均匀即得，所述银粉为粒径为400-500nm的超细银粉，其中所述银粉与添加剂的质量之比为9:1，所述添加剂为环氧树脂、四氢呋喃、树脂固化剂和聚乙二醇，且所述添加剂环氧树脂、四氢呋喃、树脂固化剂、聚乙二醇各组分质量比5:15:1：0.5。
所述银/氯化银浆料的制备方法与所述导电银浆的制备方法相同，将银替换为银和氯化银的混合粉末即可，所述银与氯化银的粉末质量比为1:1，所述混合粉末的粒径为400-500nm，通过添加氯化银制备参比电极。
制备工作电极：在石英玻璃表面镀上一层氧化铟锡(ITO)，然后采用激光刻蚀技术在石英玻璃表面刻蚀阵列式相互间隔排列设置的工作电极，并分别采用清水、无水乙醇、丙酮依次进行清清洗即可；
(2)印刷工作电极导电层及连接点：采用300目丝网印刷技术，以导电银浆为材料，将其印刷于整个石英玻璃表面，烘干30分钟；
(3)制备绝缘层：采用300目丝网印刷技术，以购自马来宾环保油墨有限公司的绝缘油墨9061为材料，将其印刷于整个玻璃表面，工作电极触点及工作电极区域不印刷，并在110℃固化30min；
(4)印刷对电极：采用300目丝网印刷技术，以导电银浆料为印刷材料，在绝缘层表面印刷对电极及导线与触点，烘干30分钟；
(5)印刷参比电极：采用300目丝网印刷技术，以银/氯化银浆料为印刷材料，在绝缘层电极表面印刷参比电极与导线与触点，烘干30分钟，即获得多通道集成式阵列光电化学传感电极。
应用实施例
应用实施例1利用装置实施例的电极对不同HPV亚型进行测定
(1)制备传感器：在多通道集成式阵列光电化学传感电极上滴加1μL TiO2/Au(3mgmL-1)溶液的修饰材料并烘干，在修饰材料上滴上1％的Nafion溶液的方式固定材料，随后将9种ssDNA探针(ssDNA探针分别用于识别HPV6,11,16,18,31,33,45,52,58的核酸序列)用TCEP进行还原处理以减少S-S键，随后将还原的ssDNA探针溶液修饰在9个工作电极区域上，并将修饰的电极在4℃下孵育过夜，之后去除电极表面上过量的探针溶液。然后将1μL的1μMCdS溶液(已预先通过20mg/mL EDC和10mgmL-1NHS进行处理)滴加到连接有ssDNA探针的电极表面并在37℃下孵育60分钟，然后用PBS缓冲溶液冲洗电极三次以去除多余的CdS，然后将1μL的1mMMCH的PBS缓冲溶液滴加到电极表面并于37℃下孵育60分钟以钝化表面阻断任何非特异性结合位点，然后用PBS缓冲溶液冲洗电极三次。然后将清洁的电极用氮气吹干并用作检测目标序列的传感器；
(2)绘制标准曲线：将浓度为0fM，10fM，50fM，100fM，1pM，5pM和10pM的HPV核酸亚型序列的标准溶液经扩增后分别孵育在通过步骤(1)制备的传感器上，随后用去离子水清洗，之后在含有0.1M AA的10mM PBS(pH 7.4)缓冲溶液中进行测试，采用CHI1040C电化学工作站进行光电化学测量，其中检测过程中的条件为10W发光二极管灯作为激发光源，365nm波长作为激发波长，光强为20mW cm-2，每10秒打开和关闭一次灯，电位为0.0。一旦光照射到光电化学电极，就记录光电流信号，通过得到的光电流响应信号与标准溶液浓度的线性关系绘制标准曲线；
本发明传感器对于一系列不同HPV核酸亚型序列溶液的光电响应如图3所示，可以看出，随浓度增加，光电响应信号逐渐下降。如图4所示，图3所示的光电响应信号与HPV核酸亚型序列溶液的浓度之间呈对数关系，因此以浓度对数(lgC)与光电信号(I0-I/I0)进行线性拟合，所得回归方程参数如表一所示，线性范围是10fM-10pM。
表1回归方程参数
应用实施例2本发明的选择性的评估
使用应用实施例1制备的传感器对不同HPV核酸亚型序列之间进行选择性评估，以空白作为对照，包括有100fM的HPV6，HPV11，HPV16，HPV18，HPV31，HPV33，HPV45，HPV52，HPV58九种目标物的标准溶液扩增后滴加到通过应用实施例1的步骤(1)制备的传感器上并采用CHI1040C电化学工作站进行光电化学测量，其中检测过程中的条件为10W发光二极管灯作为激发光源，365nm波长作为激发波长，光强为20mW cm-2，每10秒打开和关闭一次灯，电位为0.0。一旦光照射到光电化学电极，就记录光电流信号，结果如图5所示。很显然，本发明传感器来展示了优良的选择性。
应用实施例3本发明的稳定性的评估
使用应用实施例1制备的传感器通过连续光照11次对其稳定性进行评估，通过应用实施例1的步骤(1)制备的传感器采用CHI1040C电化学工作站进行光电化学测量，在含有0.1M AA的10mM PBS(pH 7.4)缓冲溶液中进行测试，其中检测过程中的条件为10W发光二极管灯作为激发光源，365nm波长作为激发波长，光强为20mW cm-2，每10秒打开和关闭一次灯，电位为0.0。一旦光照射到光电化学电极，就记录光电流信号，测试结果如图6所示。可以发现，经过11个光照循环后，光电流强度仍保持与初始光电流的强度，很显然本发明光电传感器呈现出较好的稳定性。另外，在相同实验条件下，对光电核酸传感器进行光电流测试，记录其初始光电流信号响应值。将样品放入4℃冰箱保存，分别在一周和一个月以后取出再次进行测量，发现7天和30天后所得的光电流信号响应值与初始信号响应值相比改变值均小于10％。这表明本发明所制备的传感器具有非常优异的稳定性。
根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。