一种近红外聚集诱导发光膜探针分子、制备方法及应用
阅读说明：本技术 一种近红外聚集诱导发光膜探针分子、制备方法及应用 (Near-infrared aggregation-induced luminescent film probe molecule, preparation method and application ) 是由 钱兆生 丰慧 张晓晓 于 2021-10-12 设计创作，主要内容包括：本发明公开一种近红外聚集诱导发光膜探针分子,本发明还公开了该探针分子的制备方法,包括以下步骤：S1、在三颈烧瓶中加入乙醇,抽真空、充氮气,依次加入两电荷大位阻盐、三苯胺骨架和哌啶,回流；S2、反应结束后将溶液旋干剩少量乙醇,往体系中加入大量乙酸乙酯,红色固体析出,静置后将上层溶液倒掉；S3、除尽三苯胺骨架；S4、经过步骤三的固体用丙酮洗涤以除去沸点较高的乙酸乙酯；S5、将经过S4的固体减压真空旋干后密封保存,得到红色固体粉末；本发明以三苯胺为骨架合成一种具有水溶性的近红外荧光分子探针,用于细胞膜成像,在探针中引入一个空间位阻较大的基团和长的烷基链以增加膜停留时间。(The invention discloses a near-infrared aggregation-induced emission film probe molecule and a preparation method thereof, wherein the preparation method comprises the following steps: s1, adding ethanol into a three-neck flask, vacuumizing, filling nitrogen, sequentially adding two charge large steric hindrance salts, a triphenylamine framework and piperidine, and refluxing; s2, after the reaction is finished, spin-drying the solution to leave a small amount of ethanol, adding a large amount of ethyl acetate into the system, precipitating red solids, and pouring out the upper-layer solution after standing; s3, removing the triphenylamine skeleton; s4, washing the solid obtained in the third step with acetone to remove ethyl acetate with a higher boiling point; s5, carrying out vacuum drying on the solid subjected to S4 under reduced pressure, and then sealing and storing to obtain red solid powder; the invention synthesizes a water-soluble near-infrared fluorescent molecular probe by using triphenylamine as a framework, which is used for cell membrane imaging, and introduces a group with larger steric hindrance and a long alkyl chain into the probe to increase the membrane retention time.)
技术领域
本发明涉及光学探针技术领域，特别是涉及一种近红外聚集诱导发光膜探针分子、制备方法及应用。
背景技术
细胞膜是位于细胞外围的甘油磷脂双层，在细胞中起着重要作用，如控制物质进出，保护细胞以及维持细胞内环境稳定。细胞膜的双层结构主要由脂质和蛋白质组成。磷脂分子是细胞膜的主要脂质成分，具有疏水的烷基链和亲水的极性基团。这些分子在水介质中自发组装成连续的膜，形成细胞膜的基本骨架。揭示细胞膜的生物学功能对于药物筛选、疾病早期诊断和治疗以及信号转导控制等各种应用都是至关重要的。许多细胞膜探针的结构都是模仿细胞膜的两亲性，将探针分子设计成具有亲水性基团和亲脂性基团的结构或者直接将探针分子镶嵌到两亲分子上，利用这种结构性质使其镶嵌到细胞膜中。
现有的光学探针通常具有聚集荧光猝灭现象和显著的光漂白性质，并且复杂生物体系容易导致其发生聚集而荧光猝灭，因此不能用于长时间的荧光示踪。相比之下，聚集诱导发光分子具有光稳定性好、用量少、染色快、灵敏度高、免洗等优点。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种近红外聚集诱导发光膜探针分子，本发明是以三苯胺为骨架合成一种具有水溶性的近红外荧光分子探针，用于细胞膜成像。
为解决此技术问题，本发明的技术方案是：一种近红外聚集诱导发光膜探针分子，分子结构式如下：
或者
其中n为6或12。
优选合成路线为：
或者
本发明的第二个目的在于提供一种近红外聚集诱导发光膜探针分子，本发明制备工艺简单，制得一种水溶性好、长波长发射的细胞膜探针。
为解决此技术问题，本发明的技术方案是：一种近红外聚集诱导发光膜探针分子的制备方法，包括以下步骤：
S1、在三颈烧瓶中加入乙醇，抽真空、充氮气，依次加入两电荷大位阻盐、三苯胺骨架和哌啶，回流；
S2、反应结束后将溶液旋干剩少量乙醇，往体系中加入大量乙酸乙酯，红色固体析出，静置后将上层溶液倒掉；
S3、除尽三苯胺骨架；
S4、经过步骤三的固体用丙酮洗涤以除去沸点较高的乙酸乙酯；
S5、将经过S4的固体减压真空旋干后密封保存，得到红色固体粉末。
优选S3中除尽三苯胺骨架的方法如下：
经过S2的固体用乙酸乙酯和乙醇的混合溶液进行倾析法洗涤，用展开剂EA:PE＝1:10爬板，判断三苯胺骨架是否除尽。
优选三苯胺骨架为4-二苯胺苯甲醛、4-(4-己氧基二苯胺)苯甲醛和4-(4-十二烷氧基二苯胺)苯甲醛中的一种。
优选所述两电荷大位阻盐的结构式为
优选所述两电荷大位阻盐的制备方法如下：
将单电荷大位阻盐溶解于乙醇，抽真空、充氮气，加入4-甲基吡啶，80℃下加热回流至反应结束，得目标两电荷大位阻盐。
优选单电荷大位阻盐的制备方法如下：
将1,4-二叠氮双环[2.2.2]辛烷溶解于丙酮，加入1,3-二溴丙烷，室温搅拌过夜，有白色固体析出；
把沉淀上部的液体倒掉，洗涤，除去未反应完的原料；
将固体于40℃下减压真空旋干后密封保存得单电荷大位阻盐。
本发明的第三个目的在于将近红外聚集诱导发光膜探针分子用于细胞膜成像。，本发明在469nm的最佳激发波长下，TPAPDABOC、TPAPDABOC-C6和TPAPDABOC-C12的最佳发射分别是649nm、647nm和644nm，而分散在金刚烷中(探针和金刚烷的质量比为1：50)的最佳发射都发生了小范围的蓝移，分别是625nm、636nm和627nm。
通过采用上述技术方案，本发明的有益效果是：
本发明的细胞膜探针具有水溶性好、长波长发射、用量少、免洗等优点，通过引入一个大位阻基团，使其不容易穿透细胞膜。同时还引入一个较长的烷基链，可以很好地与细胞膜中间的疏水部分相结合，从另一个方面增加了探针在膜上的停留时间。
本发明所合成的探针既可以对动物细胞进行选择性成像，也可对植物细胞进行选择性成像。在对动物细胞进行成像的时候，其成像效果明显优于文献中已报道的TVP分子。而对植物细胞进行成像的时候，相比于商业化的PI染料具有用量少、染色快等优点，具有广阔的发展前景。
从而实现本发明的上述目的。
附图说明
图1、TPAPDABOC在固态时和分散在金刚烷中的发射波长；
图2、往10μM的TPAPDABOC-C12水溶液中逐量加入浓度为20mmol·L-1的十二烷基苯磺酸钠水溶液，随十二烷基苯磺酸钠的浓度从0μM·L-1增大到150μM·L-1，溶液荧光强度逐渐增强，到达一个最大值；
图3、用10μM的TPAPDABOC-C12对HepG2细胞进行染色后的共聚焦成像图，可见该探针对HepG2细胞的细胞膜有很好的选择性，能够进行长时间的成像；
图4、用10μM·L-1的TPAPDABOC对拟南芥幼苗根尖细胞进行染色1min，随后拍摄的随时间变化的共聚焦成像图。
具体实施方式
为了进一步解释本发明的技术方案，下面通过具体实施例来对本发明进行详细阐述。
本发明具体的合成路线是：
实施例1、单电荷大位阻盐的合成
将1,4-二叠氮双环[2.2.2]辛烷(2.24g,20mmol)溶解于100mL丙酮，加入1,3-二溴丙烷(2.02mL,20mmol)，室温搅拌过夜，有白色固体析出。把沉淀上部的液体倒掉，用丙酮进行倾析法洗涤，重复3～4次以除去未反应完的原料，将固体于40℃下减压真空旋干后密封保存。
实施例2、二电荷大位阻盐的合成
将单电荷大位阻盐(1.57g,5mmol)溶解于50mL乙醇，抽真空、充氮气，加入4-甲基吡啶(4.866mL,50mmol)，80℃下加热回流48h。溶液由澄清透明逐渐颜色加深，最终变为棕黄色。反应结束后将乙醇旋干，在粗产物中加入大量丙酮和少量乙醇(用于除去原料盐)的混合溶液，加热回流1h，冷却后倒掉上清液，重复操作3～4次，用展开剂EA:PE＝1:5爬板，判断4-甲基吡啶是否除尽，除尽后将固体于40℃下减压真空旋干后密封保存，得到棕黄色固体。
实施例3、4-己氧基二苯胺的合成
在30mL干燥的DMF中加入碳酸铯(7.78g,23.88mmol)，抽真空、充氮气，加入4-羟基二苯胺(2.65g,14.32mmol)，待充分溶解后加入溴己烷(1.68mL,11.94mmol)，100℃反应6h。反应结束后溶液呈棕黑色，用乙酸乙酯萃取，有机层水洗3遍后用无水硫酸钠干燥，硅胶粉拌样并旋干，EA:PE＝1:30过柱，得到白色固体，无明显荧光。
实施例4、4-十二烷氧基二苯胺的合成
在30mL干燥的DMF中加入碳酸铯(7.78g,23.88mmol)，抽真空、充氮气，加入4-羟基二苯胺(2.65g,14.32mmol)，待充分溶解后加入溴代十二烷(2.86mL,11.94mmol)，100℃反应6h。反应结束后溶液呈棕黑色，用乙酸乙酯萃取，有机层水洗3遍后用无水硫酸钠干燥，硅胶粉拌样并旋干，EA:PE＝1:20过柱，得到淡粉色固体，无明显荧光。
实施例5、4-(4-己氧基二苯胺)苯甲醛的合成
在100mL甲苯中加入碳酸铯(4.89g,15mmol)，抽真空、充氮气，先后加4-己氧基二苯胺(0.673g,2.5mmol)、对溴苯甲醛(1.387g,7.5mmol)，Pd(OAc)2(0.05g)和P(t-Bu)3(1mL)，混合均匀后110℃反应24～48h。反应结束后冷却至室温，用水和二氯甲烷萃取，有机层水洗3遍后用无水硫酸钠干燥，硅胶粉拌样并旋干，EA:PE＝1:200过柱除去前面的杂质，等产物点出来之后换成EA:PE＝1:50过柱，得黄绿色荧光的胶状产物。
实施例6、4-(4-十二烷氧基二苯胺)苯甲醛的合成
在100mL甲苯中加入碳酸铯(4.89g,15mmol)，抽真空、充氮气，先后加4-己氧基二苯胺(0.673g,2.5mmol)、对溴苯甲醛(1.387g,7.5mmol)，Pd(OAc)2(0.05g)和P(t-Bu)3(1mL)，混合均匀后110℃反应24～48h。反应结束后冷却至室温，用水和二氯甲烷萃取，有机层水洗3遍后用无水硫酸钠干燥，硅胶粉拌样并旋干，EA:PE＝1:200过柱除去前面的杂质，等产物点出来之后换成EA:PE＝1:50过柱，得黄绿色荧光的黄色固体。
实施例7、TPAPDABOC的合成
在250mL三颈烧瓶中加入50mL乙醇，抽真空、充氮气，依次加入两电荷大位阻盐(0.407g,1mmol)、4-二苯胺醛基(0.273g,1mmol)和4～5滴哌啶，80℃回流24～48h。反应结束后将溶液旋干剩少量乙醇，往体系中加入大量乙酸乙酯，会有大量红色固体析出，静置后将上层溶液倒掉，固体用大量乙酸乙酯和少量乙醇的混合溶液进行倾析法洗涤，用展开剂EA:PE＝1:10爬板，判断4-二苯胺醛基是否除尽，除尽后固体用丙酮洗涤2～3遍以除去沸点较高的乙酸乙酯，将固体于40℃下减压真空旋干后密封保存，得到红色固体粉末。
实施例8、TPAPDABOC-C6的合成
本实施例的合成方法与实施例7一致，只需将4-二苯胺醛基(0.273g,1mmol)换成4-(4-己氧基二苯胺)苯甲醛(0.373g,1mmol)，后处理同上。
实施例9、TPAPDABOC-C12的合成
合成方法与TPAPDABOC一致，只需将4-二苯胺醛基(0.273g,1mmol)换成4-(4-十二烷氧基二苯胺)苯甲醛(0.458g,1mmol)即可，后处理同上。
实施例10
本发明制得的TPAPDABOC-C12探针分子应用于人肝癌细胞(HepG2)的细胞膜成像。
HepG2细胞在DMEM高糖完全培养液(包含89％DMEM高糖，10％胎牛血清，1％青链霉素)中，在37℃、5％CO2的恒温箱中培养。将消化的HepG2细胞以10×103个/孔的密度接种于共聚焦培养皿中，孵育24h后，每个皿分别做如下处理：(1)空白对照不加探针；(2)分别加入含有10μM探针的培养液孵育细胞，分别在30min，60min，90min时在共聚焦激光显微镜上进行细胞成像，激发波长458nm，荧光接收范围是600-700nm。放大倍数630倍。
实施例11
本发明制得的用10μM·L-1的TPAPDABOC探针分子用于拟南芥幼苗根尖的细胞膜成像。对拟南芥野生型(Col-0)种子进行表面消毒，在4℃黑暗中浸泡3天，然后播种到0.5×Murashige&Skoog(MS)培养基1.5％(w/v)平板上。在气候控制生长室(22/20℃昼/夜温度、16/8h光周期和80μE s-1m-2光强)中将幼苗垂直生长在平板上。除非另有说明，本研究使用具有健康根的五天龄幼苗。荧光成像实验利用徕卡TCS SP5型共焦激光扫描显微镜(德国)，激发波长为468nm，可变发射滤光片(575～675nm)条件下进行。所用探针浓度为μM·L-1，染色时间为1min。
本实施例所得探针的光学性质：
在469nm的最佳激发波长下，TPAPDABOC、TPAPDABOC-C6和TPAPDABOC-C12的最佳发射分别是649nm、647nm和644nm，而分散在金刚烷中(探针和金刚烷的质量比为1：50)的最佳发射都发生了小范围的蓝移，分别是625nm、636nm和627nm。
由于生物体系有自体荧光的严重干扰，短波长的荧光探针无法实现超痕量疾病标志物的检测，不利于疾病的早期诊断与治疗。本发明合成一个具有近红外发射的荧光分子探针。常见的构建长波长发射荧光分子的策略主要有三种：(1)搭建D-π-A体系；(2)扩展π共轭体系；(3)强烈的D-A相互作用与扩展的π共轭体系相结合。与四苯乙烯类荧光材料相比，三苯胺的分子结构更为简单，是一个很好的供电子基，可用于构建供体-受体型的AIE材料。三苯胺本身没有荧光，当它与其他化合物反应时，由于三苯胺本身的螺旋结构可以有效地避免π-π堆积，抑制ACQ现象，使其在聚集态下荧光增强(AIE)。另一方面需要考虑的是探针在膜上的停留时间，减小探针分子的膜渗透系数。减小膜渗透系数的策略也有三种：(1)增加探针分子所带的正电荷数；(2)引入较长的烷基链，使其能够嵌在细胞膜中央；(3)增大空间位阻，使探针分子不容易穿透细胞膜。
本发明以三苯胺为骨架合成一种具有水溶性的近红外荧光分子探针，用于细胞膜成像，在探针中引入一个空间位阻较大的基团和长的烷基链以增加膜停留时间。
本实施例制得的TPAPDABOC，如图1所示，在浓度为100μM的探针水溶液中逐量加入浓度为20mmol·L-1的十二烷基苯磺酸钠水溶液。由于十二烷基苯磺酸钠是两亲分子，在水溶液中会自发形成胶束。随着水溶液中十二烷基苯磺酸钠的浓度逐渐增大，胶束的紧密程度逐渐增大，对探针分子的限制作用增强，从而导致荧光强度逐渐增强。
如图2所示，往10μM的TPAPDABOC-C12水溶液中逐量加入浓度为20mmol·L-1的十二烷基苯磺酸钠水溶液，随十二烷基苯磺酸钠的浓度从0μM·L-1增大到150μM·L-1，溶液荧光强度逐渐增强，到达一个最大值。
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