一种应用羊驼噬菌体天然文库和人t细胞株快速筛选嵌合抗原受体的方法
阅读说明：本技术 一种应用羊驼噬菌体天然文库和人t细胞株快速筛选嵌合抗原受体的方法 (Method for rapidly screening chimeric antigen receptor by using alpaca phage natural library and human T cell strain ) 是由 叶健斌 蔡冠星 汤赞 曾桂芳 陈洁莹 蔡车国 胡隽源 于 2021-09-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种应用羊驼噬菌体天然文库和人T细胞株快速筛选嵌合抗原受体的方法,涉及分子生物学和细胞生物学技术领域。本发明方法利用噬菌体文库展示、同源重组和细胞培养等技术,通过羊驼抗体天然文库进行多次淘选、验证和鉴定获得针对肿瘤抗原的VHH序列,进行质粒重组构建表达于人T细胞株Jurkat细胞快速验证该CAR是否有效,最后使用T细胞株Hut78细胞再次确认效果。本发明方法具有筛选速度快、低成本的特点,可快速筛选并评估出抗原受体CAR是否可以用于后续实验。(The invention discloses a method for rapidly screening a chimeric antigen receptor by applying an alpaca phage natural library and a human T cell strain, and relates to the technical field of molecular biology and cell biology. The method utilizes technologies such as phage library display, homologous recombination and cell culture, and the like, obtains a VHH sequence aiming at a tumor antigen through multiple times of panning, verification and identification of an alpaca antibody natural library, constructs and expresses the VHH sequence in a human T cell strain Jurkat cell through plasmid recombination, quickly verifies whether the CAR is effective, and finally reconfirms the effect by using the T cell strain Hut78 cell. The method has the characteristics of high screening speed and low cost, and can quickly screen and evaluate whether the antigen receptor CAR can be used for subsequent experiments.)
技术领域
本发明涉及分子生物学和细胞生物学技术领域，尤其涉及一种应用羊驼噬菌体天然文库和人T细胞株快速筛选嵌合抗原受体的方法。
背景技术
CAR-T，全称是Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy，指的是嵌合抗原受体T细胞免疫疗法。2017年8月3日，FDA批准诺华(Novartis)的CAR-T疗法Kymriah(CTL-019)上市，用于治疗复发性或难治性儿童、青少年B细胞急性淋巴白血病。2017年10月18日，FDA批准凯特(Kite)的CAR-T疗法Yescarta(KTE-C10)，用于治疗复发性或难治性的特定类型成人大B细胞淋巴瘤。正如所有的技术一样，CAR-T技术也经历一个漫长的演化过程，正是在这一系列的演化过程中，CAR-T技术逐渐走向成熟。
纳米抗体，抑或称之为羊驼抗体重链可变区VHH，具有体积小、结构稳定、亲和能力与scFv相当但免疫原性更低的特点。因此，将纳米抗体应用于CAR-T细胞上是一个合适的选择。
噬菌体展示技术是一种用于识别蛋白质和其他大分子配体的体外筛选技术。其原理是将外源多肽或蛋白质的DNA序列插入到噬菌体基因的适当位置上，随着噬菌体的传代，外源蛋白展现在子代噬菌体的表面。被展示的蛋白或者多肽可以保持相对的空间结构和生物活性，可以利用靶蛋白对其进行筛选。
因此，使用噬菌体文库展示技术在理论上可以快速筛选出针对肿瘤抗原的VHH序列，进行质粒重组构建CAR-T细胞，并快速验证该CAR-T细胞是否有效。
CD69是淋巴细胞被抗原激活后在早期便快速表达的一个经典表面标志物。利用该特性可在24小时内确认CAR-T细胞是否被靶细胞激活，达到快速筛选CAR的效果。
然而，目前尚未有相关技术的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是背景技术中提到的不足，提供一种应用羊驼噬菌体天然文库和人T细胞株快速筛选嵌合抗原受体的方法。具体地，利用噬菌体文库展示、同源重组和细胞培养等技术，通过羊驼抗体天然文库进行多次淘选、验证和鉴定获得针对肿瘤抗原的VHH序列，进行质粒重组构建表达于人T细胞株Jurkat细胞并快速验证该CAR是否有效，最后使用T细胞株Hut78细胞再次确认效果，从而可评估该CAR是否可用于后续实验。
为了解决上述问题，本发明提出以下技术方案：
本发明提供一种应用羊驼噬菌体天然文库和人T细胞株快速筛选嵌合抗原受体的方法，包括以下步骤：
(1)将抗原过夜包被于免疫管，封闭后加入羊驼噬菌体天然文库结合抗原，PBST清洗未结合的噬菌体后，使用胰酶洗脱已结合的噬菌体后加入AEBSF终止洗脱，获得噬菌体洗脱文库；
(2)将步骤(1)中的噬菌体洗脱文库感染SS320进行扩增和保种细菌文库后，使用辅助噬菌体感染包装扩增噬菌体并纯化，获得噬菌体文库；
(3)用步骤(2)得到的噬菌体文库重复步骤(1)-(2)的过程2-3次，获得噬菌体洗脱文库；
(4)将步骤(3)得到的噬菌体洗脱文库感染SS320后涂板，挑取预设数量的单克隆培养，加入辅助噬菌体进行噬菌体表达，进行ELISA检测，挑取阳性孔对应的单克隆再次进行ELISA验证，保留最终的阳性单克隆；
(5)将步骤(4)最终获得的阳性单克隆进行培养、扩增、保种并测序；
(6)将步骤(5)中经测序确认无误的羊驼纳米抗体序列插入具有CAR结构的病毒核心载体中构建重组质粒，转化感受态细胞获取单克隆、保种和测序鉴定；
(7)将步骤(6)中获得的CAR重组质粒电转Jurkat细胞表达CAR后，Jurkat细胞分别与靶细胞和非靶细胞共培养18h，使用抗人CD69流式抗体检测Jurkat细胞的CD69表达和MFI差值；
(8)将步骤(7)中有效激活的CAR重组质粒进行病毒包装浓缩，感染Hut78细胞表达CAR后，Hut78细胞与靶细胞共培养48h，使用7-AAD流式抗体检测靶细胞的死亡率
(9)若CAR细胞的杀伤能力高于对照组且具有显著性差异，则判定该嵌合抗原受体CAR可用于后续实验。
与现有技术相比，本发明所能达到的技术效果包括：
本发明通过噬菌体文库展示筛选技术和Jurkat细胞的早期激活特性可以低成本快速筛选并评估嵌合抗原受体CAR是否可以用于后续实验。具体为，利用噬菌体文库展示、同源重组和细胞培养等技术，通过羊驼抗体天然文库进行多次淘选、验证和鉴定获得针对肿瘤抗原的VHH序列，进行质粒重组构建表达于人T细胞株Jurkat细胞快速验证该CAR是否有效，最后使用T细胞株Hut78细胞再次确认效果。进一步地，在噬菌体文库展示筛选环节，可以快速筛选出特异性针对肿瘤抗原的羊驼VHH序列(最快只需14天)；在重组质粒构建环节利用已经构建好的具有CAR结构的模块化病毒质粒，可以快速获得重组质粒(最快只需两天)，最后通过质粒电转Jurkat细胞表达CAR后与靶细胞共培养，检测Jurkat的CD69表达，可以快速评估CAR的胞膜表达、自激活和其效应功能等情况(最快只需两天)。
附图说明
图1本发明实施例中Jurkat细胞电转之后的阳性率结果。
图2为本发明实施例中将Jurkat细胞与靶细胞、非靶细胞共培养后的CD69MFI差值结果。
图3为本发明实施例中Hut78细胞进行病毒感染后阳性率结果。
图4为应用本发明实施例筛选出的CAR-Hut78细胞的肿瘤杀伤效果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，以下将描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例提供一种应用羊驼噬菌体天然文库和人T细胞株快速筛选嵌合抗原受体的方法，包括以下步骤：
(1)将抗原过夜包被于免疫管，封闭后加入羊驼噬菌体天然文库结合抗原，PBST清洗未结合的噬菌体后，使用胰酶洗脱已结合的噬菌体后加入AEBSF终止洗脱，获得噬菌体洗脱文库；
(2)将步骤(1)中的噬菌体洗脱文库感染SS320进行扩增和保种细菌文库后，使用辅助噬菌体感染包装扩增噬菌体并纯化，获得噬菌体文库；
(3)用步骤(2)得到的噬菌体文库重复步骤(1)-(2)的过程2-3次，获得噬菌体洗脱文库；
(4)将步骤(3)得到的噬菌体洗脱文库感染SS320后涂板，挑取预设数量的单克隆培养，加入辅助噬菌体进行噬菌体表达，进行ELISA检测，挑取阳性孔对应的单克隆再次进行ELISA验证，保留最终的阳性单克隆；
(5)将步骤(4)最终获得的阳性单克隆进行培养、扩增、保种并测序；
(6)将步骤(5)中经测序确认无误的羊驼纳米抗体序列插入具有CAR结构的病毒核心载体中构建重组质粒，转化感受态细胞获取单克隆、保种和测序鉴定；
(7)将步骤(6)中获得的CAR重组质粒电转Jurkat细胞表达CAR后，Jurkat细胞分别与靶细胞和非靶细胞共培养18h，使用抗人CD69流式抗体检测Jurkat细胞的CD69表达和MFI差值；
(8)将步骤(7)中有效激活的CAR重组质粒进行病毒包装浓缩，感染Hut78细胞表达CAR后，Hut78细胞与靶细胞共培养48h，使用7-AAD流式抗体检测靶细胞的死亡率
(9)若杀伤能力高于对照组且具有显著性差异，则判定该嵌合抗原受体CAR可用于后续实验。
以下对各步骤进行详细描述：
利用噬菌体文库展示技术，通过羊驼抗体天然文库对肿瘤抗原的VHH序列进行多次淘选：
1.第一轮筛选，具体步骤如下：
1)从-80℃取出抗原，在冰上解冻；将抗原包被于免疫管(50μg/管，包被液为CBS，pH9.6，2ml/管)，4℃，7rpm/min，缓慢旋转孵育16-20h；孵育完成后去上清，室温，2ml PBS清洗3次(颠倒5次弃液)；加入2ml封闭液(1xPBS，0.1％Tween，3％BSA)，室温旋转2h；去上清，2ml PBS清洗3次(颠倒5次弃液)；
2)对1)的产物离心去上清，加入2ml PBS、羊驼噬菌体天然文库0.05ml(效价大于等于1013pfu/ml)，室温旋转1h；去上清，用2ml PBST(0.1％Tween20)缓冲液室温下清洗免疫管20次(颠倒5次弃液)；去上清，加入1ml 0.25mg/ml Trypsin溶液，室温旋转洗脱30min；加入10μl 10％AEBSF终止洗脱，将免疫管中的溶液转移至新的EP管中，即获得噬菌体洗脱文库，本实施例对其命名为一级噬菌体洗脱液；
3)取1.8ml SS320菌种复苏，补加2xYT至10ml，Tet 20μg/ml，培养3h-3.5h至OD600＝0.250(酶标仪300μl检测)；加入500μl一级噬菌体洗脱液至2ml的SS320菌液中，37℃，220rpm，30min；将全部菌液(含一级噬菌体洗脱液及SS320菌液)均匀涂布到1个T150 2xYT平板(100μg/mlAmp和2％葡萄糖)中，吹干，37℃，孵育16-20h；
4)取出平板，加入6ml 2×YT(20μg/ml Tet)刮下菌落并将菌液收集至15ml离心管中，即为扩增后的细菌子文库，检测冻存前OD600＝8.66(冻存甘油终浓度为20％)，冻存体积为0.577ml；
5)加入0.577ml的冻存后菌液至100ml 2×YT液体培养基中(含20μg/ml Tet和100μg/ml Amp)，37℃，220rpm培养直至OD600达到0.250；加入辅助噬菌体MOI＝10：1，37℃，220rpm继续培养30min；加入终浓度为50μg/ml Kana和终浓度为0.2mM IPTG，30℃，220rpm过夜培养；
6)收集培养后的菌液至50ml离心管中离心2000g，10min，收集上清；加入1/4体积预冷的PEG/NaCl溶液，混匀，冰浴30min；于4℃，离心2000g，20min，弃上清，纸上倒置2min；加入1ml PBS重悬沉淀至EP管，离心13500g，4℃，20min，收集上清；加入1/4体积预冷的PEG/NaCl溶液，混匀，冰浴10min；离心13500g，4℃，10min，弃上清，加入1ml PBS重悬沉淀；再次离心13500g，4℃，2min，将上清转移到新的1.5ml离心管中，获得噬菌体文库，本实施例将其命名为一级噬菌体文库。
2.第二轮筛选
1)从-80℃取出抗原，在冰上解冻；将抗原包被于免疫管(50μg/管，包被液为CBS，pH9.6，2ml/管)，4℃，7rpm/min，缓慢旋转孵育16-20h；孵育完成后去上清，室温，2ml PBS清洗3次(颠倒5次弃液)；加入2ml封闭液(1xPBS，0.1％Tween，3％BSA)，室温旋转2h；去上清，2ml PBS清洗3次(颠倒5次弃液)；
2)对1)的产物离心去上清，加入2ml PBS，加入一级噬菌体文库0.05ml(效价大于等于1013pfu/ml)，室温旋转1h；去上清，2ml PBST(0.1％Tween20)缓冲液室温清洗免疫管20次(颠倒5次弃液)；去上清，加入1ml 0.25mg/ml Trypsin溶液，室温旋转洗脱30min；加入10μl 10％AEBSF终止洗脱，将免疫管中的溶液转移至新的EP管中，即获得噬菌体洗脱文库，本实施例对其命名为二级噬菌体洗脱液；
3)取1.8ml SS320菌种复苏，1.8ml菌种，补加2xYT至10ml，Tet 20μg/ml，培养3h-3.5h至OD600＝0.250(酶标仪300μl检测)；加入500μl二级噬菌体洗脱液至2ml的SS320菌液中，37℃，220rpm，30min；将全部菌液均匀涂布到1个T150 2xYT平板(100μg/mlAmp和2％葡萄糖)中，吹干，37℃，16-20h；
4)取出平板，加入6ml 2×YT(20μg/ml Tet)刮下菌落并将菌液收集至15ml离心管中，即为扩增后的细菌子文库，检测冻存前OD600＝5.78(冻存甘油终浓度为20％)，冻存体积为0.865ml；
5)加入0.865ml冻存后菌液至100ml 2×YT液体培养基中(含20μg/ml Tet和100μg/ml Amp)，37℃，220rpm培养直至OD600达到0.250；加入辅助噬菌体MOI＝10：1，37℃，220rpm继续培养30min；加入终浓度为50μg/ml Kana和终浓度为0.2mM IPTG，30℃，220rpm过夜培养；
6)收集培养后的菌液至50ml离心管中离心2000g，10min，收集上清；加入1/4体积预冷的PEG/NaCl溶液，混匀，冰浴30min；于4℃，离心2000g，20min，弃上清，纸上倒置2min；加入1ml PBS重悬沉淀至EP管，离心13500g，4℃，20min，收集上清；加入1/4体积预冷的PEG/NaCl溶液，混匀，冰浴10min；离心13500g，4℃，10min，弃上清，加入1ml PBS重悬沉淀；再次离心13500g，4℃，2min，将上清转移到新的1.5ml离心管中，获得噬菌体文库，本实施例将其命名为二级噬菌体文库。
3.ELISA检测
1)取1.8ml SS320菌种复苏，补加2xYT至10ml，Tet 20μg/ml，培养3h-3.5h至OD600＝0.250；
2)取第二轮筛选的噬菌体洗脱液100μl，在1.5ml离心管中稀释10倍；接着继续取第二轮筛选的噬菌体洗脱液10μl稀释至1ml，梯度稀释至10E-9；最后继续取第二轮筛选的噬菌体洗脱液20μl稀释至200μl，梯度稀释至10E-14，吹打混匀；
3)向每个稀释离心管中加入180μl OD600值为0.5-0.55的SS320菌液，吹打均匀，均分为两份，一份37℃，220rpm继续培养30min；一份37℃，静置继续培养30min
4)将培养得到菌液分别均匀涂布到含有2xYT-solid-100μg/ml Amp，37℃培养16-20h；
5)从培养基平板中分别随机挑取200个单克隆于两个无菌96孔细胞培养板中，每孔加入200μl 2×YT培养基(100μg/mlAmp和20μg/ml Tet)，37℃培养16h；
6)取10μl阳性孔对应的单克隆菌液和140μl 2×YT液体培养基加入至新96孔板中，37℃静置培养至OD600>＝0.125，剩余菌液4℃保存；每孔加入辅助噬菌体0.5μl(0.5*200+19.9ml，50μl每孔)，37℃，继续培养30min；加入50μl2xYT(kana 500μg/ml，Amp 500μg/ml，IPTG 2mM)，混匀，30℃静置过夜培养；将AG抗原包被酶标板(1ng/μl，包被液为CBS，pH9.6，100μl/孔)，同时平行包被BSA作对照，4℃包被过夜；
7)将过夜培养后的96孔培养板4℃，2000g离心10min，4℃保存备用；将过夜包被的酶标板内液体弃掉，每孔加入200μl PBST，室温清洗1次，每孔加入100μL封闭液(1xPBS，0.1％Tween，3％BSA)，室温封闭1h；再向每孔加入100μl phage上清液，室温孵育2h；弃液，每孔200μl PBST洗涤3次，每次静置2min；每孔加入100μl M13 Bacteriophage Antibody-HRP(1:8000稀释于封闭液中)，室温孵育1h；弃液，每孔200μl PBST洗涤6次，每次静置2min；弃液，每孔100μl TMB单组份显色液避光显色，每孔加入100μl终止液(2M H2SO4)，用酶标仪读取OD450值，记录并保存。本实施例的ELISA检测结果见表1-2。
表1：抗原组OD450检测结果
抗原
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
A
0.0852
0.2867
0.3471
0.515
0.0781
0.1328
0.3134
0.8732
0.3813
0.0442
0.0775
0.0635
B
0.0879
0.1205
0.9271
0.9078
0.4129
0.1082
0.8979
0.3713
0.1174
0.8802
0.163
0.3489
C
0.0506
1.1979
0.0572
0.3152
1.2159
0.4036
0.8466
1.0246
0.1896
0.479
1.0949
0.1982
D
0.5582
1.3025
0.0722
0.9486
0.0524
0.2023
0.4969
0.4147
0.9803
1.0919
0.4297
0.1449
E
0.3353
0.9108
0.6719
0.6481
1.106
0.8093
0.653
0.7264
0.3855
0.173
1.0467
0.242
F
0.5716
0.9287
1.5326
0.7827
0.9918
0.1207
0.7994
0.7911
0.3276
0.1358
1.1765
0.1419
G
0.4675
0.2171
1.1663
1.1448
0.6157
1.1782
0.0628
1.5184
1.1311
0.1932
0.0472
0.1617
H
0.2085
0.7848
0.9402
1.4156
0.0857
0.2128
0.3418
0.0542
0.5118
0.1354
0.0454
0.7976
表2：BSA对照组OD450检测结果
BSA
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
A
0.09
0.272
0.08
0.2394
0.0936
0.1002
0.1723
0.6839
0.1597
0.0819
0.0958
0.0882
B
0.1043
0.1128
0.0765
0.5519
0.277
0.1123
0.5298
0.1935
0.0892
0.3847
0.1178
0.0841
C
0.096
1.0868
0.099
0.1524
1.0999
0.2009
0.9481
0.6693
0.1392
0.11
0.9264
0.0997
D
0.2227
0.9323
0.087
0.6821
0.2455
0.1025
0.3676
0.1385
0.4381
0.7286
0.305
0.1043
E
0.1839
0.6309
0.1511
0.5236
1.0318
0.0985
0.1572
0.547
0.2532
0.1154
0.21
0.1389
F
0.4954
0.106
1.5057
0.3859
0.1152
0.1107
0.5856
0.2088
0.185
0.0911
0.0874
0.1156
G
0.256
0.142
0.7205
0.8834
0.3699
0.618
0.0901
1.1743
0.1208
0.1479
0.0888
0.1315
H
0.162
0.6706
0.497
1.3204
0.0997
0.1273
0.1973
0.1036
0.1508
0.1205
0.1575
0.2016
4.重组质粒构建
根据重组试剂盒(One Step Cloning Kit，Vazyme，C112)要求设计PCR引物，使用PCR试剂盒(PrimeSTAR Mix，TAKARA，cat.R045)，以筛选出的细菌文库为模板(本实施例为通过ELISA检测的二级噬菌体文库)，根据以下表3-4的参数进行PCR反应获得插入片段。
表3PCR引物
Primer-F
5’-gctcggccctctagacatatgATGGCGGTGCAGCTGGTG-3’
Primer-R
5’-ggtagtggtacgcgtgctagcGCGTGCGCCTGAGGAGAC-3’
表4 PCR反应体系
体积
Mix
25μl
菌液
10μl
Primer-F
2μl
Primer-R
2μl
ddH<sub>2</sub>O
up to 50μl
表5 PCR反应条件
根据酶切试剂盒要求，双酶切获得线性化载体。根据以下表6参数配制反应体系，37℃孵育30min进行重组反应。
表6酶切重组反应体系
体积
线性化载体(175.8ng/μL)
1μl
插入片段3CL-G1
1μl
5xCE II buffer
4μl
Exnase II
2μl
ddH<sub>2</sub>O
12μl
5.质粒转化感受态细胞
冰上解冻感受态细胞，将重组产物20μl加入至100μl感受态细胞中，混匀，冰上放置30min，42℃热激45s，冰上放置2min。加入150μl 2xYT，37℃，220rpm培养1h，取30μl涂板，次日挑取单克隆，扩增、保种、进行质粒提取和测序鉴定。
6.Jurkat细胞-靶细胞共培养
Jurkat细胞使用RMPI1640加15％FBS培养传代，电转前收集细胞，使用生理盐水清洗3次，最后使用Opti-MEM重悬细胞，加入质粒DNA进行电转。4h后将Jurkat细胞分别与靶细胞和非靶细胞共培养18h，流式检测Jurkat细胞CD69的MFI，根据靶细胞组和非靶细胞组的CD69MFI差值判断Jurkat细胞是否被激活。结果如图1-图2所示，本实施例中，图1显示质粒电转Jurkat细胞后表达EGFP的细胞百分比，即CAR的阳性率，均表达成功；图2显示Jurkat细胞分别与靶细胞组和非靶细胞组共培养后流式检测的CD69平均荧光强度之间的差值，所有大于对照组(Mock)的均视为激活成功，选入下一步实验进行验证。
7.Hut78细胞与靶细胞共培养
将有效激活的CAR重组质粒挑选出来包装病毒。Hut78细胞使用IMDM加20％FBS进行培养传代。病毒感染表达CAR，同时靶细胞铺板前使用Cell Trace Far red(Thermo，C34564,C34572)进行染色。Hut78细胞与靶细胞共培养48h后用7-AAD染色检测肿瘤细胞的死亡率。
通过根据肿瘤细胞的死亡率判断挑选出的嵌合抗原受体CAR是否可以用于后续实验。
培养后的结果如图3-图4所示，本实施例中，图3显示病毒感染Hut78细胞后表达EGFP的细胞百分比，即CAR的阳性率，均表达成功；图4显示Hut78细胞与靶细胞共培养48h后死亡的肿瘤细胞占所有肿瘤细胞的百分比，即死亡率。死亡率显著性高于对照组(Mock)的视为该嵌合抗原受体CAR可用于后续实验，本实施例中的嵌合抗原受体CAR为3CL-C4。
在上述实施例中，对各个实施例的描述都各有侧重，某个实施例中没有详细描述的部分，可以参见其他实施例的相关描述。
以上所述，为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到各种等效的修改或替换，这些修改或替换都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求的保护范围为准。