具体实施方式

本公开至少部分地基于条件复制型腺病毒(CRAd)的开发，所述腺病毒在肿瘤相关基质细胞中选择性地复制并表达免疫调节蛋白。CRAd可用于溶瘤免疫疗法应用中，特别是作为化学疗法和/或检查点抑制剂疗法的辅助手段。

腺病毒是中等大小(90-100nm)的无包膜二十面体病毒，其含有大约36千碱基(kb)的双链DNA。腺病毒衣壳介导病毒感染细胞的早期阶段的关键相互作用，并且是腺病毒生命周期结束时包装腺病毒基因组所必需的。衣壳包含252个衣壳体，其包括240种六邻体三聚体、12种五邻体碱基五聚体蛋白和12种三聚体纤维(Ginsberg等人,Virology,28:782-83(1966))。六邻体包含三种相同的蛋白质，即多肽II(Roberts等人,Science,232:1148-51(1986))。五邻体碱基包含五种相同的蛋白质，并且纤维包含三种相同的蛋白质。蛋白质IIIa、VI和IX存在于腺病毒外壳中，并且据信可使病毒衣壳稳定(Stewart等人,Cell,67:145-54(1991)；和Stewart等人,EMBO J.,12(7):2589-99(1993))。除pIX外，衣壳蛋白的表达依赖于腺病毒聚合酶蛋白。因此，只有当聚合酶蛋白基因存在并表达时，腺病毒颗粒的主要组分才会从基因组中表达出来。

腺病毒的几个特征使它们成为将遗传物质转移至细胞以用于治疗性应用(例如，基因疗法、免疫疗法或作为疫苗)的理想载体。例如，腺病毒可以高滴度(例如，约10¹³个颗粒单位(pu))产生，并且可将遗传物质转移至非复制细胞和复制细胞。可操纵腺病毒基因组以携带大量外源DNA(高达约8kb)，并且腺病毒衣壳可增强甚至更长序列的转移(Curiel等人,Hum.Gene Ther.,3:147-154(1992))。此外，腺病毒通常不整合到宿主细胞染色体中，而是作为线性附加体保持，从而最大限度地减少重组腺病毒将干扰正常细胞功能的可能性。

已鉴定出超过50种腺病毒血清型，其分类为亚组A(例如，血清型12、18和31)、亚组B(例如，血清型3、7、11、14、16、21、34、35、50和55)、亚组C(例如，血清型1、2、5和6)、亚组D(例如，血清型8、9、10、13、15、17、19、20、22-30、32、33、36-39和42-49、51、53、54、56)、亚组E(例如，血清型4)、亚组F(例如，血清型40和41)、亚组G(例如，血清型52)。腺病毒的各种血清型可从美国典型培养物保藏中心(ATCC,Manassas,Va.)获得。

在一个实施方案中，腺病毒或腺病毒载体是血清型5腺病毒或腺病毒载体(“Ad5”)。如本文所用，术语“腺病毒”是指保留参与腺病毒生命周期的能力并且尚未例如通过破坏(例如，超声处理)、变性(例如，使用热或溶剂)或交联(例如，通过福尔马林交联)被物理灭活的腺病毒。“腺病毒生命周期”包括(1)病毒结合和进入细胞中，(2)腺病毒基因组的转录和腺病毒蛋白的翻译，(3)腺病毒基因组的复制，以及(4)病毒颗粒组装(参见例如，Fields Virology,第5版,Knipe等人(编辑),Lippincott Williams&Wilkins,Philadelphia,Pa.(2006))。如本文所用，术语“腺病毒载体”是指其中腺病毒基因组已被操作以适应相对于腺病毒基因组是非天然的核酸序列的腺病毒。通常，通过将一个或多个突变(例如，缺失、插入或取代)引入腺病毒的腺病毒基因组中以适应非天然核酸序列的插入，例如，用于基因转移至腺病毒中。

在一些实施方案中，腺病毒或腺病毒载体是嵌合的。“嵌合”腺病毒或腺病毒载体可包含源自两种或更多种(例如，2、3、4等)不同腺病毒血清型的腺病毒基因组。在一些实施方案中，嵌合腺病毒或腺病毒载体可包含大约相等量的两种或更多种不同腺病毒血清型中的每一者的基因组。当嵌合腺病毒或腺病毒载体基因组由两种不同腺病毒血清型的基因组组成时，嵌合腺病毒载体基因组优选包含不超过约95％(例如，不超过约90％、约85％、约80％、约75％、约70％、约65％、约60％、约55％、约50％、约45％或约40％)的腺病毒血清型之一的基因组，其余为获自或源自其他腺病毒血清型的基因组的嵌合腺病毒基因组。在一个实施方案中，腺病毒或腺病毒载体的基因组的大部分(即，大于50％)获自或源自血清型5腺病毒。

如上所述，本文公开的腺病毒和腺病毒载体是条件复制型的。条件复制型腺病毒或腺病毒载体是已被工程化为在预定条件下复制的腺病毒或腺病毒载体。例如，复制必需的基因功能，例如由腺病毒早期区域编码的基因功能，可与诱导型、阻抑型或组织特异性启动子可操作地连接。在此类实施方案中，复制需要激活或阻抑启动子的特定因子的存在或不存在。条件复制型腺病毒载体进一步描述于例如美国专利5,998,205；6,824,771中。腺病毒复制所必需的基因产物由腺病毒基因组的E1、E2和E4区域编码。E1区包含E1A和E1B亚区，而E2区包含E2A和E2B亚区。E4区包含多个开放阅读框(ORF)，其中ORF6和(在一些情况下)ORF3是腺病毒复制所必需的。腺病毒基因组的E3区不包括任何复制必需的基因功能。

早期1A和1B(E1A和E1B)区基因编码生产性腺病毒裂解循环所需的蛋白质(Fields，同上)。E1A是感染后转录的第一病毒基因，并且产生两种相关蛋白质243R和289R，所述蛋白质诱导其他早期病毒基因区域的转录并刺激感染细胞进入细胞周期的S期。E1B区编码两种主要蛋白质，E1B19K和E1B55K。E1B55K蛋白结合细胞肿瘤抑制因子p53，并且能够阻断p53介导的细胞凋亡以及对病毒和细胞复制的抑制。E1B19K蛋白是Bcl-2同源物，其与Bax相互作用并抑制细胞凋亡，从而允许病毒复制更长时间(Sundararajan,R.和White,E,J.Virology,75:7506-7516(2001))。最近已经证明，E1B蛋白可能不是溶瘤腺病毒复制所必需的(Lopez等人,Mol.Ther.,20:2222-2233(2012)；和Viale等人,J.Invest.Dermatol.,133(11):2576-2584(2013))。已显示E1A蛋白通过与p300/CBP或成视网膜细胞瘤(Rb)蛋白缔合而在受感染的细胞中诱导S期(Howe等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:5883-5887(1990)；Wang等人,Mol.Cell.Biol.,11:4253-4265(1991)；Howe,J.A.和Bayley,S.T.Virology,186:15-24(1992))。Rb和p300调控E2F转录因子的活性，所述转录因子协调细胞周期进程所需的细胞基因的表达(Helin,K.,Curr.Opin.Genet.Dev.,8:28-35(1998))。因此，E1A基因产物通过驱动休眠细胞进入细胞周期(部分是通过从成视网膜细胞瘤蛋白(pRb)肿瘤抑制因子中转移E2F转录因子)而在病毒基因组复制中发挥作用(Liu,X.和Marmorstein,R.,Genes&Dev.,21:2711-2716(2007))。

在某些肿瘤细胞类型中条件性复制的腺病毒通常使用以下方法之一或组合生成：(1)使用组织特异性启动子来驱动E1A的表达，从而限制E1A驱动的病毒复制到特定组织或肿瘤(Rodriguez等人,Cancer Res.,57:2559-2563(1997)；Alemany等人,Cancer GeneTher,6:21-25(1999)；Hallenbeck等人,Hum.Gene Ther.,10:1721-1733(1999)；以及Howe等人,Mol.Ther.,2(5):485-495(2000))，(2)在E1区内进行消除病毒蛋白与p53或Rb的相互作用的突变以靶向对于那些基因产物有缺陷的肿瘤细胞，和/或(3)天然腺病毒向性的修饰(Jounaidi等人,Curr.Cancer Drug Targets,7(3):285-301(2007))。在一个实施方案中，本文所述的腺病毒或腺病毒载体包含编码突变型E1A蛋白的核酸序列。腺病毒或腺病毒载体可包含编码任何合适的突变型E1A蛋白的核酸序列，但理想地突变型E1A蛋白表现出与成视网膜细胞瘤蛋白的结合受损或消除。编码突变型E1A蛋白的核酸序列包含一个或多个核苷酸的缺失、插入或取代，这使得由其编码的E1A蛋白对Rb结合有缺陷。不结合Rb或以降低的亲和力结合至Rb的突变型E1A蛋白是本领域已知的(参见例如，美国专利5,801,029；5,856,181；和5,972,706)，并且可与公开的腺病毒或腺病毒载体结合使用。在一个实施方案中，编码突变型E1A蛋白的核酸序列包含E1A的Rb蛋白结合结构域中的一个或多个核苷酸(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个核苷酸)的缺失。在某些实施方案中，编码突变型E1A蛋白的核酸序列包含10-20个核苷酸(即，10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸)的缺失。例如，编码突变型E1A蛋白的核酸序列可包含SEQ ID NO:1的核酸序列，所述SEQID NO:1的核酸序列包含E1A的Rb蛋白结合结构域中15个核苷酸的缺失，从而导致E1A的Rb蛋白结合结构域的氨基酸123至127(TCHEA)的缺失。

为了实现腺病毒在肿瘤或肿瘤相关细胞中的优先复制，编码突变型E1A蛋白的核酸序列可以可操作地连接至在肿瘤细胞中有活性、但在正常细胞中没有活性的启动子。此类启动子在本文中称为“肿瘤特异性”、“组织特异性”、“细胞特异性”或“癌症特异性”启动子。如本文所用，术语“启动子”是指指导RNA聚合酶的结合、从而促进RNA合成的DNA序列。当启动子能够指导核酸序列的转录时，所述核酸序列与启动子“可操作地连接(operablylinked)”或“操作性地连接(operatively linked)”。启动子对于它可操作地或操作地性连接的核酸序列而言可以是天然的或非天然的。用于将序列可操作地连接在一起的技术是本领域众所周知的。可基于其中待表达核酸序列的靶组织或肿瘤细胞类型来选择肿瘤特异性或癌症特异性启动子。多种肿瘤特异性启动子已被用于条件复制型腺病毒构建体中，所述启动子中的任一者都可用于本公开的上下文中。此类启动子包括，例如，α-胎蛋白启动子(Hallenbeck等人,Hum Gene Ther.,10(10):1721-33(1999))、前列腺特异性抗原(PSA)启动子(Rodriguez等人,Cancer Res.,57(13):2559-63(1997))、MUC1/DF3启动子(Kurihara等人,J Clin Invest.,106:763-771(2000))、人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子(Zhang等人,J Biol Chem.,287(39):32494-32511(2012))和E2F启动子(Tsukuda等人,CancerRes.,62:3438-3447(2002))。

在一些实施方案中，启动子可优先在肿瘤或癌细胞本身中具有活性；然而，在其他实施方案中，肿瘤特异性或癌症特异性启动子包括优先在与肿瘤或癌症相关的细胞(本文中称为“肿瘤相关细胞”或“癌症相关细胞”)中有活性的启动子。实际上，应当理解，肿瘤微环境是由肿瘤体积加上支持(或“基质”)细胞组成的异质细胞群体，所述细胞由来自附近的内源性宿主基质的肿瘤细胞募集。肿瘤相关基质细胞(TASC)包括但不限于血管内皮细胞、周细胞、脂肪细胞、成纤维细胞和骨髓间充质基质细胞。在某些实施方案中，编码突变型E1A蛋白的核酸序列可操作地连接至对缺氧和炎症有响应的启动子，缺氧和炎症两者均是肿瘤细胞和肿瘤相关基质细胞的共同特征(参见例如，Laitala,A.和J.T.Erler,Front.Oncol.,8:189(2018)；Petrova等人,Oncogenesis,7:10(2018)；Casazza等人,Oncogene,33(14):1743-1754(2014))。事实上，已知TASC分泌许多促炎性因子，如IL-6、IL-8、基质源性因子-1α、VEGF、腱生蛋白-C和基质金属蛋白酶(Filer等人,Discov.Med.,7(37):20-26(2007)；和Bussard等人,Breast Cancer Res.,18:84(2016))。可通过并入一个或多个缺氧响应元件(HRE)和一个或多个炎症响应元件来工程化对缺氧和炎症有响应的启动子。在此方面，启动子可包含一个或多个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)通过结合缺氧诱导因子-1(HIF-1)而对缺氧有响应的HRE，所述HRE是在对缺氧的细胞响应中起关键作用转录因子；以及一个或多个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10各或更多个)NF-kB炎症响应元件(kBRE)。

在一个实施方案中，启动子是酸性且富含半胱氨酸的分泌型蛋白(SPARC)启动子。SPARC(也称为骨粘连蛋白或BM-40)是多方面的分泌型糖蛋白，其在多种类型的细胞中表达并且与组织重塑、伤口修复、形态发生、细胞分化、细胞迁移和血管生成相关。SPARC在各种癌症中的肿瘤及其周围基质中差异表达。据报告，在乳腺癌、黑素瘤和成胶质细胞瘤中SPARC表达水平较高。在其他类型的癌症中发现了较低水平的SPARC表达，所述癌症如卵巢癌、结肠直肠癌、胰腺癌和急性骨髓性白血病，主要是由于启动子甲基化(Chen等人,Scientific Reports,4:7035(2014)；和Tai I.T.&Tang M.J.,Drug Resist Updat.,11:231-46(2008))。在本公开的上下文中，SPARC启动子被工程化为包含一个或多个缺氧响应元件(HRE)和一个或多个核因子κB(NF-κB)炎症响应元件(κBRE)，以便如上所述在肿瘤相关基质细胞中直接表达与其可操作连接的核酸序列。适用于所公开的腺病毒或腺病毒载体中的SPARC启动子描述于例如美国专利8,436,160中。

在其他实施方案中，可能希望腺病毒或腺病毒载体优先在血管内皮细胞(EC)、特别是肿瘤相关血管内皮细胞中复制。血管内皮细胞(EC)可以是溶瘤病毒免疫疗法的理想靶标，因为它们提供广泛的组织通路，并且是静脉内载体施用后的第一接触面。因此，编码突变型E1A蛋白的核酸序列可以可操作地连接至主要或仅在内皮细胞中有活性的启动子(即“内皮细胞特异性启动子”)。可使用本领域中已知的任何合适的内皮细胞特异性启动子，包括但不限于ICAM-2启动子、内皮糖蛋白启动子、Flt-1启动子、环形蛋白(roundabout)4(ROBO4)启动子或Tie1启动子。在一些实施方案中，编码突变型E1A蛋白的核酸序列操作性地连接至ROBO4启动子(描述于美国专利申请公布2016/0145643和2017/0159072；Okada等人,Circ Res.,100:1712-1722(2007)；和Lu等人,PLoS ONE,8(12):e83933(2013)中)或Tie1启动子(描述于例如Korhonen,Blood,86(5):1828-1835(1995)中)。

在一些实施方案中，腺病毒或腺病毒载体可包含腺病毒基因组的一个或多个区域的全部或部分的缺失。在一些实施方案中，腺病毒或腺病毒载体包含腺病毒基因组的足够遗传物质的缺失以消除或损害基因的功能(例如，使得基因产物的功能降低至少约2倍、5倍、10倍、20倍、30倍或50倍)，其核酸序列被全部或部分破坏(例如，缺失)。为了在腺病毒基因组中为一个或多个非天然核酸序列(或“转基因”)提供足够的空间，可能需要除去一个或多个基因区域的大部分。在此方面，腺病毒或腺病毒载体可包含腺病毒早期区域(例如，E1、E2、E3和E4区域)、晚期区域(例如，L1、L2、L3、L4和L5区域)、参与病毒包装的基因(例如，IVa2基因)和/或病毒相关RNA(例如，VA-RNA-1和/或VA-RNA-2)中的任一者的全部或部分的缺失。在一个实施方案中，腺病毒或腺病毒载体包含腺病毒基因组的E1B区域的全部或部分的缺失、腺病毒基因组的E3区域的全部或部分的缺失和/或腺病毒基因组的E4区域的全部或部分的缺失。可定制缺失的大小以便保留基因组与最佳基因组包装大小紧密匹配的腺病毒或腺病毒载体。较大的缺失将适应在腺病毒或腺病毒基因组中插入较大的非天然核酸序列。

通过除去腺病毒基因组的某些区域(例如腺病毒基因组的E1B、E3和/或E4区域)的全部或部分，所得腺病毒或腺病毒载体能够接受外源性非天然核酸序列的插入物，同时保留被包装到腺病毒衣壳中的能力。因此，在另一个实施方案中，腺病毒或腺病毒载体包含一个或多个非天然核酸序列。可在腺病毒基因组中的任何位置插入非天然核酸序列，只要插入允许形成腺病毒或腺病毒载体颗粒即可。“非天然”核酸序列是在天然存在的位置中不是腺病毒的天然存在的核酸序列的任何核酸序列(例如，DNA、RNA或cDNA序列)。因此，非天然核酸序列可天然存在于腺病毒中，但位于腺病毒基因组内的非天然位置和/或可操作地连接至非天然启动子。术语“非天然核酸序列”、“异源核酸序列”和“外源核酸序列”是同义词并且在本公开的上下文中可互换使用。非天然核酸序列优选地是DNA并且优选地编码蛋白质(例如，编码一种或多种蛋白质的一个或多个核酸序列)。术语“转基因”在本文中定义为与适当的调控元件(例如启动子)可操作地连接的非天然核酸序列，使得可表达非天然核酸序列以产生RNA或蛋白质(例如，调控性RNA序列、肽或多肽)。调控元件(例如，启动子)对于腺病毒或腺病毒载体可以是天然的或非天然的。

一个或多个非天然核酸序列中的每一个理想地编码免疫调节剂。术语“免疫调节剂”、“免疫调节剂蛋白”和“免疫调节剂”在本文中可互换使用，并且是指影响生物体的正常免疫功能的物质或蛋白质。在一些实施方案中，免疫调节剂诸如通过激活、加强或恢复免疫响应而刺激生物体的免疫功能。在其他实施方案中，免疫调节剂可诸如通过减弱现有免疫响应或阻止对免疫响应的刺激而对免疫功能产生负面影响。免疫调节剂可以是天然存在的物质(例如，蛋白质)或者可以是合成产生的化合物。天然存在的免疫调节剂的实例包括但不限于细胞因子、趋化因子和白细胞介素。细胞因子是由多种细胞类型通常响应于激活刺激而释放并且通过与特定受体结合来诱导响应的小蛋白质(约25kDa)。细胞因子的实例包括但不限于干扰素(即，IFN-α、IFN-β、IFN-γ)、白血病抑制因子(LIF)、制瘤素M(OSM)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、肿瘤坏死因子(例如，TNF-α)、转化生长因子(TGF)-β家族成员(例如，TGF-β1和TGF-β2)。趋化因子是一类具有化学引诱物性质的细胞因子，从而诱导具有适当受体的细胞向趋化因子的来源迁移。趋化因子主要分为两类：在氨基末端附近包含两个相邻的半胱氨酸的CC趋化因子，或CXC趋化因子，其中两个等效的半胱氨酸残基被另一个氨基酸隔开。CC趋化因子包括但不限于趋化因子配体(CCL)1至28，并且CXC趋化因子包括但不限于CXC配体(CXCL)1至17。白细胞介素是由巨噬细胞响应于病原体而分泌的一组结构多样的细胞因子，并且包括例如白细胞介素-1(IL-1)、IL-2、IL-6、IL-12和IL-8。其他细胞因子、趋化因子和白细胞介素是本领域已知的并且描述于例如Cameron M.J.和Kelvin D.J.,Cytokines,Chemokines and TheirReceptors.于:Madame Curie Bioscience Database,Austin(TX):Landes Bioscience；2000-2013中。可从：www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK6294/获得。在其他实施方案中，免疫调节剂可以合成或重组产生。例如，免疫调节剂可以是融合蛋白、嵌合蛋白或天然存在的免疫调节剂的任何经修饰型式。最近，已开发出由称为正痘病毒I类主要组织相容性复合物蛋白(OMCP)的NKG2D配体和对IL-2Rα的亲和力差的突变形式的IL-2组成的重组融合蛋白，并且其可用于腺病毒或腺病毒载体。这种融合蛋白(称为“OMCP-mutIL-2”)仅在带有NKG2D的细胞(如自然杀伤(NK)细胞)上有效且选择性地激活IL-2信号传导，而不会广泛激活带有IL-2Rα的细胞(Ghasemi等人,Nature Communications,7,Article No:12878(2016))。

在一个实施方案中，腺病毒或腺病毒载体包含编码细胞因子CD40配体(CD40L)的非天然核酸序列和编码细胞因子4-1BB配体(4-1BBL)的非天然核酸序列。CD40L(也称为CD154)是主要在激活的T细胞上表达的TNF蛋白超家族的成员。CD40L-CD40相互作用对于通过刺激APC分泌IL-12而在体内引发Th1 T细胞至关重要(Grewal,I.S.和Flavell,R.A.,Annual Review of Immunology,16:111-135(1998))。在一些实施方案中，可使编码CD40L的核酸序列突变。例如，非天然核酸序列可编码对金属蛋白酶裂解具有抗性的CD40L，从而使CD40L表达保留在细胞膜上(如例如Elmetwali等人,Molecular Cancer,9:52(2010)中所描述)。4-1BB配体(也称为CD137配体和TNFSF9)是为肿瘤坏死因子(TNF)配体家族的一部分的跨膜细胞因子。4-1BBL是充当TNFRSF9的配体的双向信号转导器子，TNFRSF9是T淋巴细胞中的共刺激受体分子。4-1BBL由激活的B细胞、巨噬细胞、树突细胞、激活的T细胞、神经元和星形胶质细胞表达，并且其与TNFRSF9的相互作用在抗原呈递发展和细胞毒性T细胞的产生中发挥作用。4-1BBR在静息T淋巴细胞中不存在，但在抗原刺激下迅速表达。4-1BBL在癌细胞系中表达，并且被认为参与T细胞-肿瘤细胞相互作用。也可使编码4-1BBL的非天然核酸序列突变。编码CD40L和4-1BBL的核酸序列是可公开获得的并且可用于公开的腺病毒或腺病毒载体中(参见例如，Seyama等人,Hum Genet.,97(2):180-5(1996)；Alderson等人,Europ.J.Immun.,24:2219-2227,1994；NCBI参考序列NG_007280.1；以及NCBI参考序列NM_003811.4)。

在其他实施方案中，腺病毒或腺病毒载体可包含编码抑制肿瘤相关巨噬细胞(TAM)的活性的蛋白质的非天然核酸序列。实体瘤中巨噬细胞的浸润与许多肿瘤的预后不良和化疗耐药性相关。在癌症小鼠模型中，巨噬细胞促进癌症起始和恶性进展，并且在转移部位巨噬细胞促进肿瘤细胞外渗、存活和生长。因此，正在研究TAM作为抗癌疗法的潜在靶标(Cassetta,L.,和J.W.Pollard,Nature Reviews Drug Discovery,17:887-904(2018))。在一个实施方案中，非天然核酸序列可编码蛋白质或肽，所述蛋白质或肽结合至集落刺激因子1受体(CSF1R)并抑制由集落刺激因子1受体(CSF1R)介导的信号传导，所述集落刺激因子1受体是由巨噬细胞表达的典型标志物。例如，非天然核酸序列可编码结合至CSF1R并抑制CSF1R的活性的抗体或其抗原结合片段。特异性地结合至CSF1R并抑制CSF1R的活性的几种抗体是本领域已知的并且可由非天然核酸序列编码，包括例如依马珠单抗(也称为RG-7155，参见例如ClinicalTrials.gov Identifier NCT02760797,“A Study ofEmactuzumab and RO7009789Administered in Combination in Participants withAdvanced Solid Tumors”)。除CSF1R外，由肿瘤相关巨噬细胞表达的其他受体可由腺病毒或腺病毒载体靶向。

一个或多个非天然核酸序列理想地与在肿瘤细胞中有活性的第二启动子可操作地连接。可采用可在肿瘤或癌细胞中指导转录的任何合适的启动子。例如，启动子可以是组成型启动子，如CMV、RSV、SV40、EF2或类似的病毒或哺乳动物启动子。更优选地，启动子是“肿瘤特异性”启动子，如本文所述。一个或多个非天然核酸序列可与本领域中已知的任何肿瘤特异性启动子(如本文所述的那些)可操作地连接。前列腺特异性抗原(PSA)、环氧合酶-2(Cox2)和人端粒酶逆转录酶(TERT)启动子是可用于赋予靶组织选择性病毒复制的启动子序列的实例。在一个实施方案中，一个或多个非天然核酸序列可操作地连接至人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子。大量研究证明，hTERT表达对癌细胞具有高度特异性并且与端粒酶活性密切相关，而其他端粒酶亚基在正常细胞和癌细胞两者中均组成型表达(Takakura等人,Cancer Res；58:1558-61(1998)；Kyo等人,Int.J Cancer,80:60-3(1999)；Kanaya等人,Int J Cancer,78:539-43(1998)；Kyo等人,Int.J Cancer,80:804-9(1999)；Kyo等人,Cancer Science,99(8):1528-1538(2008)；以及Zhang等人,J Biol Chem.,287(39):32494-32511(2012))。hTERT基因的5'启动子区域已由若干组表征(参见例如，Takakura等人,Cancer Res.,59:551-7(1999)；Horikawa等人,Cancer Res.,59:826-30(1999)；以及Cong等人,Hum Mol Genet；8:137-42(1999))，并且启动子的缺失分析鉴定了癌症特异性转录激活所必需的260bp核心启动子区域。在核心启动子区域内，存在几个不同的转录因子结合位点，包括E盒(CACGTG)和GC盒(GGGCGG)。

在腺病毒或腺病毒载体包含两个或更多个非核酸序列的实施方案中，所述两个或更多个非天然核酸序列可以可操作地连接至同一启动子(例如，以形成“双顺反子”、“多顺反子(multicistronic)”、或“多顺反子(polycistronic)”序列)，所述两个或更多个非天然核酸序列可以可操作地连接至单独的相同启动子，或者所述两个或更多个非天然核酸序列可以可操作地连接与单独且不同的启动子。当腺病毒或腺病毒载体包含编码CD40L的非天然核酸序列和编码4-1BBL的非天然核酸序列时，两个核酸序列均可以可操作地连接至同一肿瘤特异性启动子。当两个或多个核酸序列可操作地连接至单个启动子时，核酸序列理想地被内部核糖体进入位点(IRES)或2A肽(或2A肽样)序列隔开。IRES允许解偶联每个编码序列的翻译，从而避免产生无活性蛋白质和不正确的亚细胞靶向。启动子干扰或抑制也可通过使用IRES来减轻(参见例如，Vagner等人,EMBO Rep.,2:893-898(2001))。2A自裂解肽首先在细小核糖核酸病毒中被鉴定为位于细小核糖核酸病毒家族的一些成员中的两种蛋白质之间的寡肽(通常19-22个氨基酸)。此后在其他病毒中发现了2A肽。使用2A肽进行多顺反子基因表达的优点包括，例如，它们的小大小和它们有效共表达位于它们之间的基因的能力。实际上，与IRES相比，位于不同2A肽序列下游的基因可诱导更高水平的表达(参见例如，Szymczak,A.L.和Vignali,D.A.,Expert Opin Biol Ther.,5:627-638(2005))。

在某些实施方案中，腺病毒或腺病毒载体包含至少一种经修饰的衣壳蛋白。腺病毒衣壳介导病毒感染细胞的早期阶段的关键相互作用，并且是腺病毒生命周期结束时包装腺病毒基因组所必需的。衣壳包含252个衣壳体，其包括240种六邻体、12种五邻体碱基蛋白和12种纤维(Ginsberg等人,Virology,28:782-83(1966))。在一个实施方案中，可操纵腺病毒或腺病毒载体的一种或多种衣壳蛋白(在本文中也称为“外壳”蛋白)以改变所述病毒或载体对潜在宿主细胞上的受体的结合特异性或识别。本领域众所周知，在静脉内施用后几乎立即，腺病毒载体主要被肝脏鳌合，其中Ad5从血流中清除并在使用后几分钟内在肝脏中累积(Alemany等人,J.Gen.Virol.,81:2605-2609(2000))。腺病毒的肝脏鳌合主要是由于肝细胞上丰富的天然柯萨奇和腺病毒受体(CAR)。因此，对衣壳蛋白的操作可拓宽被腺病毒或腺病毒载体感染的细胞的范围，或者使腺病毒载体能够靶向特定细胞类型。例如，可对一种或多种衣壳蛋白进行操作以使腺病毒或腺病毒载体蛋白靶向肿瘤细胞或肿瘤相关细胞。此类操作可包括纤维、六邻体和/或五邻体蛋白的缺失(全部或部分)，将各种天然或非天然配体插入衣壳蛋白的部分中等。

在一些实施方案中，腺病毒或腺病毒载体包含经修饰的纤维蛋白。腺病毒纤维蛋白是腺病毒多肽IV的同源三聚体，其具有三个结构域：尾部、轴和旋钮。(Devaux等人,J.Molec.Biol.,215:567-88(1990)；Yeh等人,Virus Res.,33:179-98(1991))。纤维蛋白通过旋钮和轴结构域介导与细胞表面上的受体的初级病毒结合(Henry等人,J.Virol.,68(8):5239-46(1994))。用于三聚化的氨基酸序列位于旋钮中，这似乎是纤维的氨基末端(尾部)与五邻体碱基正确缔合所必需的(Novelli等人,Virology,185:365-76(1991))。除了识别细胞受体和结合五邻体碱基外，纤维还有助于血清型识别。来自不同腺病毒血清型的纤维蛋白差异很大(参见例如，Green等人,EMBO J.,2:1357-65(1983)；Chroboczek等人,Virology,186:280-85(1992)；和Signas等人,J.Virol.,53:672-78(1985))。因此，纤维蛋白具有对腺病毒的生命周期至关重要的多种功能。

对纤维蛋白进行“修饰”，因为它包含除血清型5腺病毒或腺病毒载体的野生型纤维氨基酸序列以外或代替其的非天然氨基酸序列。血清型5腺病毒进入细胞是由与其主要受体柯萨奇和腺病毒受体(CAR)的初始结合步骤介导的。然而，CAR在许多肿瘤细胞的表面上表现出降低的表达。相比之下，大多数细胞表达高水平的血清型3腺病毒、CD46和桥粒芯蛋白-2(DSG-2)的受体。因此，血清型5腺病毒纤维蛋白的修饰已被证明可显著提高对人类肿瘤细胞的感染性。在一个实施方案中，所公开的血清型5腺病毒或腺病毒载体的野生型纤维蛋白的至少一部分(例如，纤维尾部、纤维轴部、纤维旋钮或整个纤维蛋白)理想地被除去并用来自不同血清型(如本文所述的那些)的腺病毒的纤维蛋白的相应部分替代。在一个实施方案中，所公开的血清型5腺病毒或腺病毒载体的纤维蛋白的旋钮结构域被除去并用不同腺病毒血清型的相应纤维旋钮结构域替代。例如，血清型5腺病毒或腺病毒载体的纤维蛋白可包含来自血清型3腺病毒的旋钮结构域。血清型5腺病毒纤维蛋白的其他区域(即轴部和/或尾部结构域)可被除去并用来自其他腺病毒血清型(例如，血清型3)的相应区域替代。在一个实施方案中，血清型5腺病毒或腺病毒载体的完整野生型纤维蛋白被血清型3腺病毒的完整纤维蛋白替代。将血清型5腺病毒纤维蛋白的区域交换为相应的血清型3区域在例如美国专利5,846,782和7,297,542中有所描述。腺病毒血清型3纤维蛋白的氨基酸序列已进行了表征并且可公开获得(参见例如，等人,J Virol.,53(2):672-678(1985)；和UniProtKB/Swiss-Prot Accession No.P04501)。

在另一个实施方案中，所公开的血清型5腺病毒或腺病毒载体的野生型纤维蛋白的至少一部分被除去并用非腺病毒(即，异源)氨基酸序列替代。例如，血清型5腺病毒或腺病毒载体的纤维蛋白的旋钮结构域可被除去并用已经合成或重组产生的氨基酸序列或基序替代。一些异源肽已被引入纤维旋钮结构域中以重新靶向腺病毒，包括寡聚赖氨酸、FLAG、RGD-4C RGS(His)6和HA表位。然而，由于纤维旋钮结构域的相当复杂结构，引入纤维旋钮的任何异源肽或氨基酸序列不应使纤维不稳定，这将使其不能进行三聚化，并且因此无功能。因此，可将任何合适的异源氨基酸序列并入纤维旋钮结构域中，只要纤维蛋白能够三聚化。在一个实施方案中，本文所述的腺病毒或腺病毒载体的纤维旋钮被除去并用三聚化基序和受体结合配体替代。例如，本文所述的腺病毒或腺病毒载体的纤维旋钮被除去并用包含与截短形式的噬菌体T4纤蛋白蛋白遗传融合的Ad5纤维蛋白的轴结构域的尾部和两个氨基末端重复序列的异源蛋白和配体替代，如美国专利6,815,200和Krasnykh等人,J.Virol.,75(9):4176-4183(2001)中所述。可替代腺病毒或腺病毒载体的纤维旋钮区域的异源蛋白质的其他实例包括异亮氨酸三聚化基序和来自人肺表面活性剂D的颈区肽。

配体可以是特异性地识别为非天然腺病毒受体的细胞表面蛋白的任何合适的分子或肽。合适的配体的实例包括但不限于生理配体、抗受体抗体和细胞特异性肽。在一个实施方案中，配体是抗体、抗体片段或抗体的衍生物。在一个实施方案中，配体是抗体片段。抗体片段的实例包括但不限于(i)Fab片段，其是由VL、VH、CL和CH结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，其是在铰链区包含通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(iv)Fab'片段，其源自使用温和还原条件破坏F(ab')2片段的二硫桥；(v)二硫键稳定的Fv片段(dsFv)；以及(vi)单结构域抗体(sdAb)，其是特异性地结合抗原的抗体单可变区结构域(VH或VL)多肽。在一个实施方案中，配体是源自由骆驼科动物(即骆驼和羊驼)产生的抗体的单结构域抗体。骆驼科动物产生仅由两条重链(无轻链)组成的非常规抗体作为抗原(Ag)识别和结合的基础，并且这些抗体已被用于腺病毒介导的基因疗法中(Revets等人,Expert Opin.Biol.Ther.,5:111-124(2005))。骆驼科动物sdAb具有对于重靶向腺病毒而言理想的特性，如细胞溶质稳定性，从而允许功能性并入腺病毒衣壳中；以及与噬菌体生物淘选选择的相容性以允许靶细胞特异性(Beatty,M.S.和D.T.Curiel,Adv.Cancer Res.,115:39-67(2012))。事实上，骆驼科动物sdAb片段已被证明是用于靶向腺病毒载体的稳健配体(参见例如，Kaliberov等人,Lab Invest.,94(8):893-905(2014)；van Erp等人,Mol.Ther.Oncolytics,2:15001(2015)；和美国专利申请公布2017/0044269)。应当理解，在经修饰的纤维旋钮结构域中使用的骆驼科动物单结构域抗体的选择将取决于用于腺病毒靶向的所需细胞类型。当使腺病毒或腺病毒载体靶向肿瘤或癌细胞时，如本文所述，骆驼科动物sdAb理想地特异性地结合至在肿瘤或癌细胞表面上异常表达的受体(也称为“肿瘤特异性”或“癌症特异性”受体)。许多肿瘤细胞或癌细胞特异性细胞表面受体是本领域已知的，包括但不限于HER2/neu、雌激素受体、生物素受体、c(RGD-K)、表皮生长因子受体(EGFR)、内皮素受体B、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)、生长抑素受体、血管活性肠肽(VIP)受体、缩胆囊素(CCK)受体、铃蟾肽/胃泌素释放肽(GRP)受体、神经降压素受体、P物质、神经肽Y、α-黑素细胞刺激激素(α-MSH)、降钙素、内皮素、癌胚抗原(CEA)和CD276(B7-H3)。

在一个实施方案中，骆驼科动物单结构域抗体特异性地结合至CD276蛋白。CD276是B7和CD28家族的免疫检查点成员，并且其表达在抗原呈递细胞上被诱导。CD276在抑制T细胞功能中起重要作用，并且在多种人类实体癌中高度过表达，通常与患者的不良预后和不良临床结果相关(Picarda等人,Clinical Cancer Res.,22(14):3425-3431(2016))。CD276的肿瘤特异性表达可允许靶向CD276腺病毒或腺病毒载体的全身施用，同时避免感染正常细胞(即非癌性细胞)。此外，CD276在A549的细胞表面上表达，所述细胞在本领域中用于产生条件复制型腺病毒。

在其他实施方案中，纤维蛋白包含结合αvβ3、αvβ5或αvβ6整联蛋白的非天然氨基酸序列。与不以这种程度表达整联蛋白的细胞相比，展示对αvβ3整联蛋白具有特异性的配体(如RGD基序)的腺病毒感染在细胞表面上具有更多αvβ3整联蛋白部分的细胞，从而使所述载体靶向特定目标细胞。例如，腺病毒或腺病毒载体可包含嵌合纤维蛋白，所述嵌合纤维蛋白包含含有RGD基序的非天然氨基酸序列，所述RGD基序包括但不限于CRGDC(SEQ ID NO:2)、CXCRGDCXC(SEQ ID NO:3)(其中X表示任何氨基酸)以及CDCRGDCFC(SEQ ID NO:4)。RGD基序可插入到腺病毒纤维旋钮区域中，优选在腺病毒旋钮的暴露环(如HI环)中。

血清型5腺病毒纤维蛋白的其他区域(即轴部和/或尾部结构域)可被除去并用来自其他腺病毒血清型或非腺病毒肽的相应区域替代。可修饰或除去所公开的血清型5腺病毒或腺病毒载体的野生型纤维蛋白的任何合适的氨基酸残基，只要不阻碍病毒衣壳组装即可。类似地，只要纤维蛋白保留三聚化的能力，就可将氨基酸添加到纤维蛋白中。此类经修饰的纤维蛋白也被称为“嵌合”纤维蛋白，因为它们包含获自或源自两种不同的腺病毒血清型的氨基酸序列。

在一些实施方案中，腺病毒或腺病毒载体包含经修饰的六邻体蛋白。腺病毒六邻体蛋白是腺病毒衣壳中最大和最丰富的蛋白质。六邻体蛋白对于病毒衣壳组装、确定衣壳的二十面体对称性(其进而定义关于衣壳体积和DNA包装大小的限制)以及衣壳的完整性至关重要。此外，六邻体蛋白是用于修饰以减轻腺病毒载体的中和作用的主要靶标(参见例如，Gall等人,J.Virol.,72:10260-264(1998)；和Rux等人,J.Virol.,77(17):9553-9566(2003))。六邻体蛋白的主要结构特征为不同血清型的腺病毒所共有，但六邻体蛋白在不同血清型之间在大小和免疫学性质方面不同(Jornvall等人,J.Biol.Chem.,256(12):6181-6186(1981))。15种腺病毒六邻体蛋白的比较揭示，六邻体蛋白的主要抗原和血清型特异性区域似乎在环1和2(即分别为LI或l1，以及LII或l2)中，其内存在7至9个在腺病毒血清型之间再长度和序列方面不同的离散高变区(HVR1至HVR 7或HVR9)(Crawford-Miksza等人,J.Virol.,70(3):1836-1844(1996)和Bruder等人,PLoS ONE,7(4):e33920(2012))。

对六邻体蛋白进行“修饰”，因为它包含除血清型5腺病毒或腺病毒载体的野生型六邻体氨基酸序列以外或代替其的非天然氨基酸序列。Ad5六邻体蛋白介导病毒的肝脏鳌合(Waddington等人,Cell,132:397-409(2008)；Vigant等人,Mol.Ther.,16:1474-1480(2008)；以及Kalyuzhniy等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,105:5483-5488(2008))，并且六邻体蛋白的修饰，特别是在高变5(HVR5)和7(HVR7)区域内，已显示可减轻血清型5腺病毒颗粒的内源性肝鳌合(参见例如，Alba等人,Blood,114:965-971(2009)；Shashkova等人,Mol.Ther.,17:2121-2130(2009)；以及Short等人,Mol Cancer Ther.,9(9):2536-2544(2010))。在一个实施方案中，所公开的血清型5腺病毒或腺病毒载体的野生型六邻体蛋白的至少一部分(例如，整个六邻体蛋白)理想地被除去并用来自不同血清型(如本文所述的那些)的腺病毒的六邻体蛋白的相应部分替代。在一个实施方案中，血清型5腺病毒或腺病毒载体的六邻体蛋白包含来自不同血清型的腺病毒的一个或多个高变区(HVR)。例如，血清型5腺病毒或腺病毒载体的六邻体蛋白包含来自血清型3或血清型11腺病毒的一个或多个(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个或所有七个)高变区(HVR)。换言之，所公开的血清型5腺病毒或腺病毒载体的六邻体蛋白的一个或多个HVR可被除去并用来自血清型3或血清型11腺病毒的一个或多个相应的HVR替代。在一个实施方案中，血清型5腺病毒或腺病毒载体的完整野生型六邻体蛋白被血清型3或血清型11腺病毒的完整六邻体蛋白替代。

腺病毒血清型3的多种毒株的六邻体蛋白氨基酸序列已被表征并且可公开获得(参见例如，Haque等人,PLoS ONE,13(4):e0196263.doi.org/10.1371/journal.pone.0196263(2018))。然而，可修饰或除去所公开的血清型5腺病毒或腺病毒载体的野生型六邻体蛋白的任何合适的氨基酸残基，只要不阻碍病毒衣壳组装即可。类似地，只要保持衣壳的结构完整性，就可将氨基酸添加到六邻体蛋白中。此类经修饰的六邻体蛋白也被称为“嵌合”六邻体蛋白，因为它们包含获自或源自两种不同的腺病毒血清型的氨基酸序列。

本领域中已知的用于产生经修饰的(例如，嵌合的)腺病毒六邻体和纤维蛋白的方法可用于本公开的上下文中。此类方法描述于例如美国专利5,543,328；5,559,099；5,712,136；5,731,190；5,756,086；5,770,442；5,846,782；5,871,727；5,885,808；5,922,315；5,962,311；5,965,541；6,057,155；6,127,525；6,153,435；6,329,190；6,455,314；6,465,253；6,576,456；6,649,407；6,740,525；和6,815,200中。

本文所述的腺病毒或腺病毒可在适于条件复制型腺病毒增殖的细胞系中产生，包括例如KB细胞、HeLa细胞和A549细胞(参见例如，Lawrence和Ginsberg,J.Virol.,1:851-867(1967)；Green和Pina,Virology,20:199-207(1963)；Wold,Adenovirus Methods andProtocols(Humana Press,Totowa,NJ)(1999))。用于产生和纯化腺病毒和腺病毒载体的方法描述于例如美国专利6,194,191和国际专利申请公布WO99/54441、WO 98/22588、WO 98/00524、WO 96/27677和WO 2003078592中。

虽然本公开涵盖了多种包含启动子、非天然核酸序列、腺病毒基因组缺失、嵌合六邻体蛋白和嵌合纤维蛋白的各种组合的腺病毒或腺病毒载体，但特定实施方案包括包含以下各项的腺病毒或腺病毒载体：(1)(a)编码突变型E1A蛋白的核酸序列，所述核酸序列可操作地连接至本文所述的对缺氧和炎症有响应的工程化的SPARC启动子；(b)腺病毒基因组的E1B区域的全部或部分的缺失；(c)编码CD40L的核酸序列和编码4-1BBL的核酸序列，所述核酸序列可操作地连接至hTERT启动子(以5'-3'或3'-5'取向)；(d)纤维蛋白，其包含血清型3腺病毒纤维旋钮结构域；和(e)包含一个或多个血清型3高变区(HVR)的六邻体蛋白(参见图1A和图1B)；(2)(a)编码突变型E1A蛋白的核酸序列，所述核酸序列可操作地连接至本文所述的对缺氧和炎症有响应的工程化的SPARC启动子；(b)腺病毒基因组的E1B区域的全部或部分的缺失；(c)编码CD40L的核酸序列和编码4-1BBL的核酸序列，所述核酸序列可操作地连接至hTERT启动子；(d)纤维蛋白，其包含非天然纤维旋钮结构域和插入纤维中的CD276特异性单链骆驼科动物抗体氨基酸序列；和(e)包含一个或多个血清型3高变区(HVR)的六邻体蛋白(参见图1C)；(3)(a)编码突变型E1A蛋白的核酸序列，所述核酸序列可操作地连接至ROBO4或Tie1启动子；(b)腺病毒基因组的E3区域的缺失；(c)包含插入纤维旋钮结构域中的RGD肽的纤维蛋白；和(d)包含一个或多个血清型3高变区(HVR)的六邻体蛋白(参见图1D)；(4)(a)编码突变型E1A蛋白的核酸序列，所述核酸序列可操作地连接至Tie1启动子；(b)腺病毒基因组的E3区域的缺失，(c)编码抗PD1蛋白(例如，抗体)的核酸序列和编码OMPC-IL2的核酸序列，所述核酸序列可操作地连接至CMV启动子；(d)包含插入纤维旋钮结构域中的RGD肽的纤维蛋白；和(e)包含一个或多个血清型3高变区(HVR)的六邻体蛋白(参见图1E)；以及(5)(a)编码突变型E1A蛋白的核酸序列，所述核酸序列可操作地连接至Tie1启动子；(b)腺病毒基因组的E3区域的缺失；(c)编码抗PD1蛋白(例如抗体)的核酸序列和编码OMPC-IL2的核酸序列，所述核酸序列可操作地连接至CMV启动子；(d)纤维蛋白，其包含非天然纤维旋钮结构域和插入纤维中的CD276特异性单链骆驼科动物抗体氨基酸序列；和(e)包含一个或多个血清型3高变区(HVR)的六邻体蛋白(参见图1F)。

本公开提供了一种组合物，所述组合物包含本文所述的腺病毒或腺病毒载体以及其载体(例如，药学上可接受的载体)。所述组合物理想地是生理学上可接受的(例如，药学上可接受的)组合物，所述组合物包含载体、优选生理学(例如，药学上)可接受的载体以及腺病毒或腺病毒载体。在本公开的上下文中可使用任何合适的载体，并且此类载体是本领域中众所周知的。载体的选择将部分取决于组合物的特定用途(例如，施用于动物)和用于施用组合物的特定方法。在一些实施方案中，药物组合物可以是无菌的。

合适的组合物包括水性和非水性等渗无菌溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂和抑菌剂；以及水性和非水性无菌悬浮液，其可包含悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。组合物可以单位剂量或多剂量密封容器，如安瓿和小瓶形式呈现，并且可储存于冷冻干燥(冻干)条件下，仅需在使用前即刻添加无菌液体载体，例如水。临时溶液和悬浮液可由无菌粉末、颗粒和片剂制备。优选地，载体是缓冲盐水溶液。更优选地，腺病毒或腺病毒载体是为保护腺病毒或腺病毒载体在施用前免受损害而配制的组合物的一部分。例如，可配制组合物以减少用于制备、储存或施用腺病毒或腺病毒载体的装置如玻璃器皿、注射器或针上的腺病毒或腺病毒载体的损失。所述组合物可被配制为降低腺病毒或腺病毒载体的光敏感性和/或温度敏感性。为此，组合物可包含药学上可接受的液体载体，例如上述那些；以及选自由聚山梨醇酯80、L-精氨酸、聚乙烯吡咯烷酮、海藻糖以及它们的组合组成的组的稳定剂。使用这种组合物将延长腺病毒或腺病毒载体的保质期并促进其施用。用于含腺病毒或腺病毒载体的组合物的制剂进一步描述于例如美国专利6,225,289、6,514,943和7,456,009以及国际专利申请公布WO 2000/034444中。

此外，本领域普通技术人员将理解，腺病毒或腺病毒载体可与其他治疗剂或生物活性剂一起存在于组合物中。例如，控制炎症的因子(如布洛芬或类固醇)可以是组合物的一部分，以减轻与腺病毒或腺病毒载体的体内施用相关的肿胀和炎症。可存在抗生素，即杀微生物剂和杀真菌剂以治疗现有感染和/或降低未来感染的风险，如与病毒施用相关的感染。

存在于组合物中的腺病毒或腺病毒载体的剂量将取决于许多因素，包括预期的靶组织、任何副作用的程度、特定施用途径等。剂量理想地包含“有效量”的腺病毒或腺病毒载体，即在接受者(例如，人)中引起所需响应的腺病毒或腺病毒载体的剂量。理想地，单剂量的腺病毒或腺病毒载体包含至少约1×10⁷个腺病毒载体颗粒(也称为颗粒单位(pu)或病毒颗粒(vp))。剂量是至少约1×10⁸个腺病毒或腺病毒载体颗粒(例如，约1×10⁹-1×10¹⁴个颗粒)，并且优选至少约1×10¹⁰个颗粒(例如，约1×10¹⁰-1×10¹²个颗粒)。或者，剂量包含不超过约1×10¹⁴个颗粒，优选不超过约1×10¹³个颗粒，更优选不超过约1×10¹²个颗粒。换言之，单剂量的腺病毒载体可包含例如腺病毒或腺病毒载体的约1×10⁷个病毒颗粒、2×10⁷个vp、4×10⁷个vp、1×10⁸个vp、2×10⁸个vp、4×10⁸个vp、1×10⁹个vp、2×10⁹个vp、4×10⁹个vp、1×10¹⁰个vp、2×10¹⁰个vp、4×10¹⁰个vp、1×10¹¹个vp、2×10¹¹个vp、4×10¹¹个vp、1×10¹²个vp、2×10¹²个vp、4×10¹²个vp、1×10¹³个vp、2×10¹³个vp、4×10¹³个vp或1×10¹⁴个vp。

本公开还提供了在肿瘤细胞中诱导细胞毒性的方法，所述方法包括将肿瘤细胞与上述组合物接触。如本文所用，术语“肿瘤”是指当细胞分裂超过它们应有的程度或在它们应死亡的时候没有死亡时产生的异常组织块。在本公开的上下文中，术语肿瘤可指肿瘤细胞和肿瘤相关基质细胞(如上所述)。如果肿瘤不侵入附近组织或扩散至生物体的其他部分，则它们可能是良性和非癌性的。相比之下，术语“恶性肿瘤”、“癌症”和“癌细胞”可在本文中互换使用并且是指包含不受控制地分裂并且可以侵入附近组织的细胞的肿瘤。癌细胞还可通过血液和淋巴系统扩散或“转移”至身体的其他部位。所公开的方法理想地在恶性肿瘤细胞或癌细胞中诱导细胞毒性。恶性肿瘤细胞或癌细胞可来自癌(源自上皮细胞的癌症)、肉瘤(源自骨和软组织的癌症)、淋巴瘤(源自淋巴细胞的癌症)、血癌(例如，骨髓瘤或白血病)、黑素瘤或脑和脊髓肿瘤。恶性肿瘤或癌细胞可位于口腔(如舌头和口腔组织)和咽部、消化系统、呼吸系统、骨骼和关节(例如，骨转移)、软组织、皮肤(例如，黑素瘤)、乳房、生殖系统、泌尿系统、眼睛和眼眶、大脑和神经系统(例如，神经胶质瘤)或内分泌系统(例如，甲状腺)中并且不一定是原发性肿瘤。更具体地，消化系统的癌症可影响食道、胃、小肠、结肠、直肠、肛门、肝脏、胆囊和胰腺。呼吸系统的癌症可影响喉、肺和支气管，并且包括例如非小细胞肺癌。生殖系统的癌症可影响子宫颈、子宫体、卵巢、外阴、阴道、前列腺、睾丸和阴茎。泌尿系统的癌症可影响膀胱、肾脏、肾盂和输尿管。癌细胞还可与淋巴瘤(例如，霍奇金病和非霍奇金淋巴瘤)、多发性骨髓瘤或白血病(例如，急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病等)相关。在一个实施方案中，肿瘤细胞是卵巢细胞，如卵巢癌细胞。

如果剂(例如本文所述的腺病毒或腺病毒载体)杀死或抑制细胞、特别是癌细胞的生长，则所述剂是“细胞毒性的”并且诱导“细胞毒性”。在一些实施方案中，例如，细胞毒性包括阻止癌细胞分裂和生长，以及减小肿瘤或癌症的大小。肿瘤细胞的细胞毒性可使用本领域中已知的任何合适的细胞活力测定来测量，例如测量细胞裂解、细胞膜渗漏和细胞凋亡的测定。例如，方法包括但不限于台盼蓝测定、碘化丙啶测定、乳酸脱氢酶(LDH)测定、四唑鎓还原测定、刃天青还原测定、蛋白酶标志物测定、5-溴-2'-脱氧-尿苷(BrdU)测定，并且可使用ATP检测。也可使用可商购的细胞活力测定系统，并且包括例如CELLTITER-2.0(Promega,Madison,WI)、VIVAFIX^TM 583/603细胞活力测定(Bio-Rad,Hercules,CA)；和CYTOTOX-FLUOR^TM细胞毒性测定(Promega,Madison,WI)。

理想地，所公开的方法促进肿瘤细胞增殖的抑制、肿瘤细胞的根除和/或至少一种肿瘤大小的减小，从而治疗哺乳动物(例如人)的癌症。“癌症的治疗”是指癌症的全部或部分减轻。在一个实施方案中，所公开的方法使肿瘤的大小减小至少约20％(例如，至少约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％)。理想地，肿瘤被完全消除。

肿瘤细胞可在体外或体内与腺病毒组合物接触。术语“体内”是指在正常、完整状态的活生物体内进行的方法，而“体外”方法是使用已从其通常生物学环境中分离出来的生物体的组分进行的。当细胞在体外与组合物接触时，细胞可以是任何合适的原核或真核细胞。当细胞在体内与组合物接触时，可使用标准施用技术和途径将组合物施用于动物，如哺乳动物，特别是人。合适的施用途径包括但不限于口服、静脉内、腹膜内、皮下、肺、经皮、肌肉内、鼻内、经颊、舌下或栓剂施用。组合物优选适用于肠胃外施用。如本文所用，术语“肠胃外”包括静脉内、肌肉内、皮下、直肠、阴道和腹膜内施用。在其他实施方案中，可使用通过静脉内、肌肉内、腹膜内或皮下注射的全身递送将组合物施用于哺乳动物。

虽然单剂量的腺病毒或腺病毒载体的施用可通过组合物的单次施加(例如，对靶组织的单次注射)来完成，但在其他实施方式中，可通过将组合物多次施加至靶肿瘤的不同点来施用单剂量，或者可通过重复施用特定剂量来施用多剂量的腺病毒或腺病毒载体。在治疗期内，施用次数可以是约2至约50次施用或更多(包括介于2与50之间的所有整数)。施用次数将取决于肿瘤位置、肿瘤大小、肿瘤类型等。

所公开的方法可与其他治疗方法组合进行，以在患者中实现所需的生物学效果。理想地，所公开的方法可包括一种或多种癌症治疗，或结合一种或多种癌症治疗进行。与所公开的方法组合使用的癌症治疗的选择将取决于多种因素，包括癌症/肿瘤类型、肿瘤或癌症的分期和/或等级、患者的年龄等。可采用的合适的癌症治疗包括但不限于手术、化学疗法、放射疗法、免疫疗法、激素疗法和干细胞移植。在一个实施方案中，所公开的方法进一步包括用化学治疗剂治疗肿瘤细胞。在所公开的方法中可使用任何合适的化学治疗剂，包括，例如，阿霉素(adriamycin)、天冬酰胺酶、博来霉素、白消安、顺铂、卡铂、卡莫司汀、卡培他滨、苯丁酸氮芥、阿糖胞苷、环磷酰胺、喜树碱、达卡巴嗪、更生霉素、柔红霉素、右雷佐生、多西他赛、多柔比星(doxorubicin)、依托泊苷、氟尿苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、伊立替康、洛莫司汀、氮芥、巯基嘌呤、美法仑(meplhalan)、甲氨蝶呤、丝裂霉素、米托坦、米托蒽醌、亚硝基脲、紫杉醇、帕米膦酸盐、喷司他丁、普卡霉素、丙卡巴肼、利妥昔单抗、链脲菌素、替尼泊苷、硫鸟嘌呤、噻替派、长春碱、长春新碱、长春瑞滨、紫杉酚、反铂、抗血管内皮生长因子化合物(“抗VEGF”)、抗表皮生长因子受体化合物(“抗EGFR”)、5-氟尿嘧啶等。在所公开的方法中使用的化学治疗剂的类型和数量将取决于特定肿瘤类型的标准化学治疗方案。

在其他实施方案中，所公开的方法可进一步包括用细胞因子，如本文公开的任何细胞因子治疗肿瘤或癌细胞。理想地，所述细胞因子表现出针对癌症的治疗功效(例如，IL-2和IFN-α)(参见例如，Lee,S.和K.Margolin,Cancers(Basel),3(4):3856-3893(2011)；和Ardolino等人,Oncotarget,6(23):19346-19347(2015))。

在另一个实施方案中，所公开的方法可进一步包括用免疫检查点调节剂治疗肿瘤或癌细胞。免疫检查点是免疫细胞上的分子，所述分子必须被激活或抑制以刺激免疫系统活性。肿瘤可使用此类检查点来逃避免疫系统的攻击。免疫检查点调节剂可以是免疫细胞的抑制信号的拮抗剂，也称为“检查点抑制剂”，其阻断抑制性检查点(即通常抑制免疫响应的分子)。例如，免疫检查点调节剂可以是A2AR、BTLA、B7-H3、B7-H4、CTLA4、GAL9、IDO、KIR、LAG3、PD-1、TDO、TIGIT、TIM3和/或VISTA的拮抗剂。因此，检查点抑制剂疗法可阻断抑制性检查点，从而恢复免疫系统功能。目前批准的检查点抑制剂靶向分子CTLA4、PD-1和PD-L1，并且包括伊匹单抗纳武单抗派姆单抗阿特珠单抗阿维鲁单抗和德瓦鲁单抗任何合适的检查点抑制剂，如描述于例如Kyi,C.和M.A.Postow,Immunotherapy,8(7):821-37(2016)；Collin,M.,Expert Opin Ther Pat.,26(5):555-64(2016)；Pardoll,D.M.,Nat Rev Cancer,12(4):252-6(2012)；和Gubin等人,Nature,515(7528):577-81(2014))中的那些可与所公开的方法组合使用。在其他实施方案中，免疫检查点调节剂可以是免疫细胞刺激性受体的激动剂，如BAFFR、BCMA、CD27、CD28、CD40、CD122、CD137、CD226、CRTAM、GITR、HVEM、ICOS、DR3、LTBR、TACI和/或OX40的激动剂。虽然免疫检查点调节剂理想地在与包含腺病毒或腺病毒载体的组合物或制剂分开的组合物或制剂中施用，但在一些实施方案中，腺病毒或腺病毒载体包含编码免疫检查点调节剂的核酸序列。例如，腺病毒或腺病毒载体可包含编码PD-1抑制剂的核酸序列，所述PD-1抑制剂如抗PD-1抗体(例如，派姆单抗纳武单抗或西米普利单抗)。

以下实施例进一步说明本发明，但是当然不应被解释为以任何方式限制其范围。

实施例1

本实施例描述了根据本公开的血清型5腺病毒的构建和表征。

UIO-523(在美国临时申请号62/808,694中也称为AdSΔ15-40L.BBL-HV5/3-F5/3和UIO-522OP)是含有SPARC启动子的DNA序列的人血清型5条件复制型腺病毒(CRAd)载体(Δ15E1A、E1B-、E3+、HV5/3、F5/3)，所述启动子经修饰以包含三个缺氧响应元件(HRE)和12个核因子κB(NFκB)响应元件(κBRE)。HRE充当低氧环境的调节剂，而κBRE充当炎症的触发剂。缺氧和炎症是肿瘤微环境的特征。SPARC启动子在与恶性细胞区室密切接触的癌症相关成纤维细胞和内皮细胞中高度表达。经修饰的SPARC启动子驱动突变型E1A基因，所述基因编码如上所述的具有缺陷型成视网膜细胞瘤(Rb)结合的蛋白质。病毒基因组的5'端已被工程化为包含源自鸡β-珠蛋白基因座(cHS4)的染色质绝缘子序列，所述染色质绝缘子序列是通过其阻断异染色质的阻抑作用和/或增强子的激活作用的能力在功能上分离差异表达的遗传基因座的天然存在的DNA元件。在此，绝缘子序列通过阻断病毒ITR对经修饰的SPARC启动子的影响来降低来自载体的背景表达水平。

UIO-523的大部分E3基因区域是完整的，并且血清型5纤维旋钮被血清型3旋钮替代(F5/3)。UIO-523还含有六邻体蛋白，所述蛋白可交换为相应的血清型3序列，这允许降低在全身递送后的肝脏摄取。UIO-523载体还在癌症和干细胞特异性hTERT启动子的控制下表达免疫调节基因CD40L和4-1BBL，这提供了细胞因子的肿瘤特异性表达。与原始E1B转录方向相比，UIO-522OP基因组的大部分或全部E1B区域被除去并用处于相反取向的hTERT-CD40L/4-1BB盒替代，并被SV40聚A序列阻断以避免干扰E1A基因转录。UIO-523在图1B中示意性地表示。

为了证明UIO-523能够感染细胞并产生CD40L和4-1BBL基因产物，将A549人肺癌细胞和SKOV3人卵巢癌细胞在多孔组织培养板中生长24小时并用UIO-523感染，感染复数(MOI)为100或1000。在30小时后，收集细胞，并通过流式细胞术评估人CD40L。这些研究的结果显示在图2A和2B中，其证明UIO-523可裂解癌细胞并产生细胞因子以刺激树突状细胞(DC)和新T细胞以及新的T细胞浪潮。

为了评价腺病毒载体的体外细胞毒性，使用了人卵巢癌细胞SKOV3.Luc、鼠类结肠直肠癌CT26细胞和PA1人卵巢癌细胞。所测试的病毒包括AR2011(未武装的病毒)、武装有人CD40L和4-1BBL的含天然血清型5六邻体蛋白的UIO-523(UIO-523hH5)、具有将血清型5六邻体交换为血清型3六邻体并武装有人或鼠类CD40L和4-1BBL的UIO-523(UIO-523hH3或UIO-523mH3)以及AR2011-luc(非复制对照)。用MTT测定监测细胞活力，所述测定测量NAD(P)H依赖性细胞氧化还原酶的细胞代谢活性。该分析的结果示于图3A-3D中。对照AR2011病毒对靶细胞没有裂解作用，并且与表达人细胞因子的具有六邻体5的UIO-523对人和鼠类细胞的活性相当(参见图3A和3B)，从而证明添加细胞因子不影响病毒的裂解活性。此外，六邻体5交换为六邻体3不影响在PA1细胞上表达人或鼠类细胞因子的UIO-523的裂解活性(参见图3C和3D)

实施例2

该实施例描述了CD40L和41BBL在人SKOV3卵巢癌异种模型中的体内表达。

向6-8周龄裸小鼠施用4.5X10⁶个SKOV3.Luc细胞。一旦肿瘤达到平均150mm³，就向小鼠肿瘤内注射(i.t.)1x10¹⁰v.p./小鼠或相同体积的PBS(30μl)。

二十四小时后，切除肿瘤并制备蛋白质提取物。将100μg蛋白质提取物在12％SDS-PAGE中分离并转移至硝酸纤维素膜(Bio-Rad Laboratories)。用抗h4-1-BBL抗体(ab68185Abcam，Cambridge，UK)或抗CD40L抗体(ab2391 Abcam，Cambridge，UK)探测膜。抗β-肌动蛋白抗体(A4700；Sigma，St.Louis，MO)和抗α微管蛋白(12g10DSHB)用作负载对照。按照制造商的说明书(Amersham，Little Chalfont，UK)，使用增强的化学发光试剂来检测信号。CD40L表达在图4中示出。41BBL表达的评估正在进行中。

实施例3

该实施例描述了UIO-523在卵巢癌的皮下异种移植物小鼠模型中的药理学研究。

基于人卵巢癌细胞系SKOV3的皮下(s.c.)植入的卵巢癌鼠类异种移植物模型用于评价UIO-523(武装有人CD40L和4-1BBL)。通过将5×10⁶个SKOV3细胞/200μL注射到6-8周龄裸小鼠(n＝10只小鼠/组)的侧腹中建立皮下肿瘤。在建立肿瘤的第10天，将AR2011或UIO-523的5×10¹⁰个vp在400μL PBS中进行肿瘤内(i.t.)注射。PBS施用充当阴性对照。如所描述(Lopez等人,Molecular Therapy,20:2222-33(2012))在肿瘤建立后的第1天、第3天和第5天注射病毒。肿瘤成像在第-1天治疗前进行，然后每周一次直到实验结束。小鼠随意接受食物和水，并密切跟踪以避免任何消瘦迹象或其他可见的毒性适应症。在第45天处死小鼠。通过成像和动物存活率对肿瘤减小的直接分析用于评估治疗功效。在用UIO-523治疗的小鼠中观察到完全肿瘤根除，如图5A-5F所示。

实施例4

该实施例证明了UIO-523对小鼠模型中的播散性肿瘤的裂解活性。

基于人卵巢癌细胞系SKOV3的腹膜内植入(i.p.)的卵巢癌鼠类异种移植物模型用于评估UIO-523hH5(武装有人CD40L和4-1BBL)。通过将6×10⁶个SKOV3细胞注射到6-8周龄裸小鼠(n＝10只小鼠/组)中来建立腹膜内肿瘤。7天后，腹膜内注射在400μL PBS中AR2011或UIO-523的5×10¹⁰个vp。PBS施用(也是400μL)充当阴性对照。在第1天、第4天和第7天注射病毒(Lopez等人,Molecular Therapy,20:2222-33(2012))。小鼠随意接受食物和水，并密切跟踪以避免任何消瘦迹象或其他可见的毒性适应症。在细胞植入后第54天处死小鼠。观察到肿瘤大小的统计学显著差异(参见图6)并且在用UIO-523治疗的几只小鼠中观察到完全没有腹膜内肿瘤。具体地，注射了PBS的小鼠中没有一只没有肿瘤。在注射了UIO-523hH5的十只小鼠中，三只没有肿瘤，并且一只的肿瘤≤0.1克。在注射了AR2011的10只小鼠中，4只的肿瘤≤0.1克，并且10只小鼠中没有一只没有肿瘤。从治疗动物和对照动物切除的肿瘤示图7中。

为了评估病毒分布，提取总DNA并评估E4病毒水平作为病毒颗粒的替代标志物(Lopez等人，同上)。在第三次病毒施用后一天(参见图8“10天”)或在实验结束时(参见图8“54天”)切除肿瘤。实验结束时病毒DNA仍然存在，并且用UIO-523治疗的肿瘤显示出更高的E4水平/μgDNA，尽管它们的肿瘤重量较低。

该实施例的结果表明，AR2011和UIO-532hH5在SKOV3腹膜内小鼠模型中表现出显著肿瘤生长抑制。

实施例5

该实施例展示了通过纤维消融重新靶向条件复制型腺病毒载体。

如本文所讨论的，已经开发了几种策略来改变腺病毒载体的向性以通过靶向基序的遗传并入以修饰纤维蛋白来实现细胞特异性基因递送。在此，产生了源自重链(VHH)骆驼科动物抗体的抗CD276单可变结构域，以实现肿瘤特异性腺病毒载体基因转移。

为了获得抗CD276 VHH，在对CD276抗原的免疫响应达到峰值时，从羊驼的外周血淋巴细胞RNA生成了VHH展示文库，如Kaliberov等人,Laboratory Investigation,94:893-905(2014)中所述。除去血清型3人腺病毒的纤维蛋白并用杂交纤蛋白-抗CD276 VHH片段替代以使载体重定向至CD276受体(如Kaliberov等人，同上中所述)。所述载体还缺失E1区域并用CMV启动子替代以表达绿色荧光蛋白(GFP)，从而产生构建体Ad.CMV-GFP.H3.F(CD276)和Ad.CMV-GFP.H3.F(3)。用Ad.CMV-GFP.H3.F(CD276)和Ad.CMV-GFP.H3.F(3)转染经工程化以在表面上表达人或鼠类CD276的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。未修饰的CHO细胞充当对照。Ad.CMV-GFP.H3.F(CD276)展现选择性靶向在CHO细胞表面上表达的CD276，如图9A-9F中所示。Ad.CMV-GFP.H3.F(CD276)也能够感染人横纹肌肉瘤细胞，所述细胞表达腺病毒内化受体αv整联蛋白，但以低或不可检测的水平表达主要腺病毒附着受体柯萨奇病毒-腺病毒受体(CAR)(Cripe等人,Cancer Research,61:2953-2960(2001))(参见图10A和10B)。

实施例6

该实施例描述了UIO-523的同基因ID8小鼠模型中的药理学研究。

该研究将提供UIO-523在C57BL/6小鼠中抑制小鼠肿瘤细胞系(ID8)的肿瘤生长以及抗肿瘤免疫响应的功效评估。在人与小鼠之间的细胞因子交叉反应性是问题时，使用基因的鼠类型式构建替代载体，以便能够准确确定武装基因的生物学响应。此外，根据细胞系感染性，将使用F5/3或RGD纤维。将根据该研究的需要建立额外的安全性读数。

UIO-523的鼠类型式(mUIO-523)也将在卵巢癌的同基因免疫活性鼠类模型中进行研究。该模型基于CT26鼠类结肠直肠癌细胞系。在这种情况下，ID8细胞系将用报告基因标记，从而允许进行成像分析。C57BL/6小鼠将原位移植5×10⁶个ID8-F3mCherryLuc细胞/200μL(n＝10只小鼠/组)。一周后，将用UIO-523的5x10⁹或5×10¹⁰个vp腹膜内激发动物。相应的一组小鼠也将通过静脉内施用注射病毒以用于比较两种不同递送途径。每周的直接成像分析将允许评估抗肿瘤效应。此外，通过ELISPOT技术分析源自腹腔液和脾脏的免疫细胞将允许确定抗肿瘤免疫的诱导。为了保真，将在所研究的病毒中采用武装细胞因子的鼠类替代物，并测量这些基因的系统表达水平。所述研究将进行大约60天，并定期进行临床观察，以评估动物健康的变化。将对主要器官(例如，脑、肝脏、肺、肾脏、心脏)和注射部位区域进行组织病理学检查。

实施例7

该实施例描述了在同基因小鼠模型中施用UIO-523和检查点抑制剂的方法。

C57BL/6小鼠将原位移植5×10⁶个ID8-F3mCherryLuc细胞/200μL(n＝10只小鼠/组)。一周后，将用UIO-523的5x10⁹或5×10¹⁰个v.p.的UIO-523腹膜内或静脉内激发动物(腹膜内或静脉内递送将根据上述初始单一疗法功效研究中获得的结果确定)。在第8天和第13天，将向小鼠静脉内注射25μg/小鼠的抗小鼠PDL1单克隆抗体。直接成像分析将允许评估抗肿瘤功效。此外，通过ELISPOT技术分析源自腹腔液和脾脏的免疫细胞将允许确定抗肿瘤免疫的诱导。将监测治疗组的存活持续大约80天或直到治疗组中的所有小鼠都死亡。

实施例8

该实施例描述了检查叙利亚仓鼠中的UIO-523毒理学和生物分布的研究。

在单一良好实验室规范(GLP)研究中评价UIO-523的安全性和生物分布的实验将在具有免疫活性的叙利亚仓鼠中使用模拟如表1所示的所提出的I期卵巢临床试验的剂量递增方案进行。

1x 10⁹至1x 10¹¹个vp/仓鼠的UIO-523范围内的剂量将通过将模拟预期临床试验的给药方案(例如，连续几天每天一次)腹膜内施用。基于每kg体重，所研究的最高剂量将超过最高计划的人剂量至少50倍。由于卵巢适应症，所述研究将仅在雌性动物中进行，并且将具有有5只动物/组/时间点。

表1.叙利亚仓鼠中的生物分布/毒理学研究概述/毒理学的概述

来自这项生物分布/毒理学研究的结论将鉴定可安全纳入I期研究中最高病毒剂量而无观察到的不良作用水平(NOAEL)。它还将鉴定哪些组织在腹膜内施用病毒后具有最高水平的腺病毒感染，并提供对每种受感染组织中的病毒颗粒的量的定量评估。

实施例9

该实施例描述了UIO-523腺病毒在卵巢癌中的I期临床试验。

I期卵巢癌(OC)试验将是用于局部晚期、复发性或转移性卵巢癌的作为单一疗法和作为常规检查点抑制剂(CI)疗法的辅助手段的UIO-523的开放标签、剂量递增研究。大约18-30名患者预期参与所述研究。

I期OC临床研究的研究目标将是评估/鉴定：(1)单独和联合CI疗法的腹膜内(或静脉内)注射UIO-523在各种区域晚期和/或转移性癌症患者中的安全性和可行性；(2)UIO-523和CI在肿瘤中的位点特异性最大耐受剂量(MTD)以及推荐的II期剂量；(3)UIO-523和CI的腹膜内(或静脉内)注射的组合对局部控制的潜在影响；和(4)UIO-523在施用部位有效转染肿瘤细胞的能力。I/II期研究的主要终点将是肿瘤响应和手术结果。

正在考虑用于以下实体瘤和癌症的测试UIO-523的I/II期临床试验：食道癌、前列腺癌、成胶质细胞瘤、头颈癌、肝细胞癌、膀胱癌、黑素瘤、结肠直肠癌和骨肉瘤：由于肿瘤的可及性和这种癌症的不良预后，用UIO-523与CI治疗(例如PD-1/PD-L1抑制剂)的组合治疗食道癌作为患有不可手术的癌症患者的肿瘤减小的第一线是有吸引力的。由于使用直接注射技术、与近距放射疗法共同施用的可行性以及替代标志物PSA的存在，前列腺癌是另一种可能的适应症。由于可用于受影响患者的治疗选择有限，因此成胶质细胞瘤是可能的适应症。

UIO-523将作为肿瘤内或腹膜内注射溶液以小体积(2-5cc)施用于实体瘤或以较大体积(100cc)施用于OC。所述产物将通过使用限定的注射几何形状在多个部位直接注射到肿瘤或腹膜中进行施用(例如，对于实体瘤2-5次注射，并且对于OC 3次注射)。OC I期研究将包括五个剂量水平(1X10¹⁰至1X10¹²个vp，3次)，并在群组之间进行半对数递增。每种剂量水平将招募三名患者。如果出现剂量限制性毒性，在允许研究进入下一个剂量水平之前，将以所述剂量招募另外3名患者。类似的剂量递增设计将用于I期实体瘤研究。

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