阅读说明：本技术 一种复制缺陷型重组人4型腺病毒及其制备方法和应用 (Replication-defective recombinant human adenovirus type 4, and preparation method and application thereof ) 是由 陈凌 冯立强 于 2019-08-19 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种复制缺陷型重组人4型腺病毒的制备方法和应用。所述复制缺陷型重组人4型腺病毒通过以下方法得到：将人4型腺病毒基因组质粒化,敲除其E1和E3基因,并将Ad4的E4基因的开放阅读框2、3、4、5、6替换为Ad5 E4基因的相对应开放阅读框。本发明所描述的复制缺陷型人4型腺病毒载体可潜在地应用于：抗人4型腺病毒疫苗研发；抗人4型腺病毒中和抗体及药物筛选；抗其他病原体疫苗的研发；生物学研究的报告示踪系统等。(the invention discloses a preparation method and application of replication-defective recombinant human adenovirus type 4. The replication-defective recombinant human adenovirus type 4 is obtained by the following method: human adenovirus type 4 genome was plasmid-granulated, knockout of its E1 and E3 genes, and replacement of open reading frame 2, 3, 4, 5, 6 of the E4 gene of Ad4 with the corresponding open reading frame of Ad5E4 gene. The replication-defective human adenovirus type 4 vectors described in the present invention can potentially be applied to: research and development of anti-human adenovirus 4 vaccine; screening anti-human adenovirus 4 neutralizing antibody and medicine; development of vaccines against other pathogens; biological studies report tracer systems, etc.)

一种复制缺陷型重组人4型腺病毒及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种复制缺陷型重组人4型腺病毒载体及其制备方法和应用。

背景技术

腺病毒(Adenovirus，Ad)是双链DNA病毒，其基因组长度约35-40kb。已知人腺病毒分为7个亚群(A～G)，包括50多个血清型及90多个基因型，感染患者后主要引起急性呼吸道疾病(腺病毒B和C亚群)、结膜炎(腺病毒B和D亚群)和胃肠炎(腺病毒F亚型41型和42型，G亚群52型)。有研究报道，Ad4主要集中在部队、学校等青年和青少年聚集的地方爆发，甚至导致病人的死亡。但是，尚无治疗Ad4感染的特效药物，临床上只能采取支持性治疗。

目前，抗腺病毒感染的疫苗仅在美国军队获得使用。该疫苗为野生型Ad4、Ad7在人胚肾二倍体成纤维细胞上传代，经冷冻脱水、混和纤维素乳糖等制成的肠溶型胶囊形式的口服活病毒疫苗。该疫苗的使用有效控制了美军腺病毒感染疫情的爆发。但是，美军使用的Ad4腺病毒疫苗存在极大的风险，该疫苗主要是低剂量野生型腺病毒，安全性较差，存在残余活病毒从肠道排出后污染生活环境的风险，极易造成病毒的二次污染，因而不能广泛应用于普通人群。所以，研制安全性高并能预防Ad4强病毒株的复制缺陷型腺病毒疫苗是十分必要的。

复制缺陷型腺病毒载体已经被广泛的应用于疫苗研发、基因治疗等领域，其不仅安全性好，并且在生物体内又发较强的免疫反应。已有研究显示，腺病毒E1基因是其复制增殖的必需基因，E3基因在抵抗宿主的免疫系统中起关键性作用。敲除E1、E3基因后，腺病毒在正常人体内丧失复制能力，在此方面具有减毒表型。同时，Ad4主要的表面抗原Hexon、Fibre等则不受影响，不会影响疫苗的免疫原性。因此，采用复制缺陷的腺病毒作为疫苗可有效增加疫苗的全性和使用范围。复制缺陷型腺病毒可在互补细胞株，如表达Ad5E1基因的293细胞、PerC6细胞中生产。但是，研究发现很多腺病毒，尤其是非C亚群腺病毒，敲除E1、E3基因后在这些生产细胞株中产量较低，其主要原因是Ad5E1B 55K不能与B亚型腺病毒E4Orf6蛋白产生相互作用，不能有效抑制宿主细胞mRNA的出核，不能提升病毒晚期蛋白的表达。这些腺病毒需要表达相应E1基因的293细胞株或其他细胞株才能生产，然而，这些细胞株尚未获得生产疫苗的许可，因此，仅敲除E1、E3基因的复制缺陷型Ad4在疫苗生产细胞株293或PerC6种难以生产。提升其在这些细胞株中的生产能力是当前需要解决的瓶颈技术问题。

为提高复制缺陷型腺病毒的生长能力，已有研究将Ad5E4Orf6的编码基因取代Ad26、Ad35等的相应基因，这些嵌合的Ad26、Ad35在缺失E1基因后仍能在293细胞、PerC6细胞中有效复制。但是，尚无采用类似策略将Ad4改造为复制缺陷型病毒的报道。此外，由于腺病毒E4基因包含了Orf1、Orf2、Orf 3、Orf 4、34K(Orf6)、Orf6/7等读码框，其编码的蛋白均可能与E1基因编码蛋白相互作用，在腺病毒复制与包装过程中起到十分重要作用；而且Ad4本身的E4基因是否具有未知的细胞毒性尚不清楚。因此，有必要将Ad4E4基因的全部或大部分编码框置换为Ad5E4基因的相应编码框，以提升复制缺陷型Ad4的安全性及其在生产细胞株中的复制能力。

此外，复制缺陷型腺病毒作为基因载体在基因治疗、疫苗等领域已获得广泛应用。腺病毒载体在这些领域具有一系列优势，例如，安全性良好、基因载量较大，基因转导的有效性以及较容易的大规模生产能力等。基于这些优势，全球范围内已有数百项临床试验以腺病毒作为基因载体，居各类载体之首(24.8％)。这些研究大部分采用Ad5或Ad2作为载体。然而，多数人体内由于既往腺病毒感染而产生的抗腺病毒免疫反应限制了传统腺病毒载体的应用。研究表明多数发展中国家和地区的人群中Ad2、Ad5中和抗体阳性率极高，部分地区甚至超过90％。这些中和抗体会抑制腺病毒作为基因载体进入机体细胞，使其难以行使免疫原性和基因治疗等功能。为克服预存抗腺病毒免疫反应，研究者已开发一系列技术如：(1)采用免疫抑制剂如环孢霉素、环磷酰胺、FK506等抑制部分抗腺病毒免疫反应；(2)通过修饰或改造腺病毒载体表面蛋白，绕开预存中和抗体中和作用；(3)我们此前开发的以腺病毒体外感染PBMC然后自体回输的AVIP技术；等等。但是这些策略或者具有较高的毒副作用(如免疫抑制剂)、安全性(通过修饰或改造腺病毒载体表面蛋白)，或者仅能使用一次局限性(即因产生针对新载体的免疫反应而不能继续重复使用)。而Ad4在广大人群中尚未大规模流行，人体内普遍缺少针对Ad4的中和抗体，因此基于人4型的腺病毒载体是Ad2、Ad5等载体的良好替代品。

因此，本发明所描述的E1、E3基因缺失的复制缺陷型重组Ad4可应用于以下方面：(1)抗Ad4的疫苗的研发；(2)抗Ad4中和抗体及药物的筛选工具；(3)细胞治疗和基因疫苗的研发；(4)生物学示踪报告系统；等等。

发明内容

本发明所解决的技术问题是，为了克服现有技术缺陷，提供一种可在疫苗生产细胞株中大规模扩增的复制缺陷型重组Ad4及其制备方法和应用。

本发明所要解决的上述技术问题通过以下方案实现：

一种复制缺陷型重组人4型腺病毒，通过以下方法得到：将人4型腺病毒基因组质粒化，敲除其E1和E3基因，并将Ad4的E4基因的开放阅读框2、3、4、6、6/7替换为Ad5E4基因的相对应开放阅读框。

优选地，所述的复制缺陷型重组人4型腺病毒，还在Ad4的E1基因区整合外源基因的表达框。

一种复制缺陷型重组人4型腺病毒的制备方法，包含如下步骤：

S1.PCR扩增Ad4基因组的5’端和3’端，并连接至氨苄抗性载体得到pT-Ad4(L+R),线性化后与Ad4基因组同源重组，得到基因组质粒pAd4。

S2.PCR扩增Ad4E3区左右同源臂并连接至卡那霉素抗性载体，得到pVAX-Ad4-delE3载体，线性化后与经酶切线性化的pAd4同源重组，得到基因组质粒pAd4ΔE3；

S3.PCR扩增Ad4E1区左右同源臂并连接至卡那霉素抗性载体，得到pVAX-Ad4-delE1载体，线性化后与经酶切线性化的pAd4ΔE3同源重组，得到基因组质粒pAd4ΔE1ΔE3；

S4.PCR扩增Ad5E4Orf2-6、Ad55E4基因，以Ad5E4Orf2-6取代Ad4E4基因中相应区域得到pGK41-5E4，线性化后与经酶切的pAd4ΔE1ΔE3同源重组，得到基因组质粒pAd4ΔE1ΔE3(5E4)；

优选地，步骤S1的具体方法为：

以Ad4基因组为模板，PCR扩增得到Ad4基因组左右两端Ad4-L和Ad4-R作为同源臂，同源重组至pSIMPLE-19(EcoRV)载体得到pT-Ad4(L+R)载体，同时在pT-Ad4(L+R)载体的左右臂之间引入酶切位点SpeI和BamHI，线性化后，与Ad4基因组DNA同源重组，经氨苄青霉素抗性筛选得到带有全部Ad4基因组的环状质粒pAd4。

最优先地，在其中一个实施例中，步骤S1的具体方法为：

以Ad4基因组为模板，PCR扩增得到Ad4基因组左右两端Ad4-L和Ad4-R作为同源臂，同源重组连接至pSIMPLE-19(EcoRV)载体得到pT-Ad4(L+R)载体，同时在pT-Ad4(L+R)载体的左右臂之间引入酶切位点SpeI和BamHI，pT-Ad4(L+R)通过SpeI和BamHI双酶切线性化后，与Ad4基因组DNA同源重组，经氨苄青霉素抗性筛选得到带有全部Ad4基因组的环状质粒pAd4。

优选地，步骤S2的具体方法为：

以Ad4基因组为模板，PCR扩增得到E3区的同源重组臂delE3-4L和delE3-4R，同源重组至pVax载体得到pVAX-Ad4-delE3载体，线性化后，与EcoRI部分酶切的pAd4质粒同源重组，经氨苄青霉素抗性筛选得到敲除E3基因并引入唯一酶切位点SwaI的基因组质粒pAd4ΔE3。

最优先地，在其中一个实施例中，步骤S2的具体方法为：

以Ad4基因组为模板，PCR扩增得到E3区的同源重组臂delE3-4L delE3-4R和pVax载体通过Exnase酶进行三片段同源重组得到pVAX-Ad4-delE3载体，pVAX-Ad4-delE3载体通过SpeI和XbaI双酶切线性化后，与EcoRI部分酶切的pAd4质粒同源重组，经氨苄青霉素抗性筛选得到敲除E3基因并引入唯一酶切位点SwaI的基因组质粒pAd4ΔE3。

优选地，步骤S3的具体方法为：

以Ad4基因组为模板，PCR扩增得到E1区同源重组臂L-delK(E1)和R-delK(E1)，同源重组至pVax载体得到pVax-delE1载体，线性化后与PsiI线性化的pAd4ΔE1同源重组，得到去除E1、E3并引入唯一酶切位点PacI的基因组质粒pAd4ΔE1ΔE3。

最优先地，在其中一个实施例中，步骤S3的具体方法为：

以Ad4基因组为模板，PCR扩增得到E1区同源重组臂L-delK(E1)，R-delK(E1)和pVax载体通过Exnase酶进行三片段同源重组得到pVAX-Ad4-delE1载体，pVAX-Ad4-delE1载体通过BstZ17I+SgrAI双酶切线性化后，与PsiI线性化的pAd4ΔE1同源重组，得到去除E1、E3并引入唯一酶切位点PacI的基因组质粒pAd4ΔE1ΔE3。

优选地，步骤S4的具体方法为：

以Ad4基因组为模板，PCR扩增得到E4基因的左臂和右臂两个基因片段，连接至pGK143载体得到pGK143(L+R)载体，进一步PCR扩增得到Ad5E4Orf2-6基因片段，与线性化的pGK143(L+R)载体同源重组得到pGK143-5E4(Orf2-6)，线性化后与SwaI线性化的pAd4ΔE1ΔE3同源重组，得到pAd4ΔE1ΔE3(5E4)载体。

最优先地，在其中一个实施例中，步骤S3的具体方法为：

以Ad4基因组为模板，PCR扩增得到E4基因的左臂和右臂两个基因片段，与采用BstZ17I+SgrAI双酶切pGK134-EGFP回收的载体骨架通过Exnase酶三片段同源重组，得到pGK143(L+R)载体，同时在E4基因的左右臂之间引入唯一的BamHI酶切位点；进一步，以Ad5基因组为模板，通过PCR扩增得到Ad5E4Orf2-6基因片段，与BamHI单酶切线性化的pGK143(L+R)载体同源重组得到pGK143-5E4(Orf2-6)，pGK143-5E4(Orf2-6)载体通过BstZ17I+SgrAI双酶切线性化后与SwaI线性化的pAd4ΔE1ΔE3同源重组，得到pAd4ΔE1ΔE3(5E4)载体。

一种复制缺陷型重组人4型腺病毒的制备方法，还包括如下步骤：

S5.以Ad4基因组为模板，PCR扩增得到E1区同源重组臂4SE1L和4SE1R，同源重组至pVax载体得到pGK41载体，并在两臂之间引入酶切位点PacI和EcoRV；以pGA1-EGFP为模板，PCR扩增得到外源基因表达框CMV-EGFP-BGH，与EcoRV线性化的pGK41进行连接，得到pGK41-EGFP载体，线性化后与经PacI酶切的pAd4ΔE1ΔE3(5E4)同源重组，得到基因组质粒pAd4ΔE1ΔE3(5E4)-EGFP。

优选地，步骤S5的具体方法为：

以Ad4基因组为模板，PCR扩增得到E1区同源重组臂4SE1L和4SE1R，同源重组至pVax载体得到pGK41载体，并在两臂之间引入酶切位点PacI和EcoRV；以pGA1-EGFP为模板，PCR扩增得到外源基因表达框CMV-EGFP-BGH，与EcoRV线性化的pGK41进行连接，得到pGK41-EGFP载体，线性化后与经PacI酶切的pAd4ΔE1ΔE3(5E4)同源重组，得到基因组质粒pAd4ΔE1ΔE3(5E4)-EGFP。

最优先地，在其中一个实施例中，步骤S5的具体方法为：

以Ad4基因组为模板，PCR扩增得到E1区同源重组臂4SE1L，4SE1R和pVax载体通过Exnase酶同源重组得到pGK41载体，并在两臂之间引入酶切位点PacI和EcoRV；以pGA1-EGFP为模板，PCR扩增得到外源基因表达框CMV-EGFP-BGH，与EcoRV酶切线性化的pGK41进行连接，得到pGK41-EGFP载体，pGK41-EGFP载体通过BstZ17I+SgrAI双酶切线性化后，与经PacI酶切的pAd4ΔE1ΔE3(5E4)同源重组，得到基因组质粒pAd4ΔE1ΔE3(5E4)-EGFP。

pAd4ΔE1ΔE3(5E4)和pAd4ΔE1ΔE3(5E4)-EGFP采用AsisI酶切进行线性化，乙醇沉淀回收后，转染293细胞进行病毒拯救，扩大培养，以CsCl2密度梯度离心法纯化Ad4ΔE1ΔE3(5E4)和Ad4ΔE1ΔE3(5E4)-EGFP。

所述的复制缺陷型重组人4型腺病毒在制备抗人4型腺病毒疫苗中的应用。

所述的复制缺陷型重组人4型腺病毒在抗人4型腺病毒药物及中和抗体研发中的应用。

所述的复制缺陷型重组人4型腺病毒在制备其他病原体疫苗或基因治疗中的应用。

所述的复制缺陷型重组人4型腺病毒在生物学报告示踪系统中的应用。

有益效果：(1)本发明提供了一种全新的复制缺陷型重组人4型腺病毒，能够在293、PerC6等疫苗生产细胞株中大量生产，在正常人体细胞不具备复制能力因此具备减毒表型。(2)该重组载体还可在靶细胞内高效表达外源基因。(3)本发明所述重组载体可作为疫苗或基因治疗载体，还可应用于药物及中和抗体的研发，以及报告示踪系统等。(4)实施例实验数据表明所述复制缺陷型人4型腺病毒可以在小鼠体内诱发较强的免疫反应，产生针对Ad4的特异性中和抗体。

附图说明

附图1是Ad4基因组环化的原理示意图。

附图2是敲除pAd4载体中腺病毒E3基因的原理示意图。

附图3是敲除pAd4ΔE3载体中腺病毒E1基因的原理示意图。

附图4是pAd4ΔE1ΔE3载体中E4基因采用Ad5基因组中E4基因替换原理示意图。

附图5是携带外源基因表达框的pAd4ΔE1ΔE3(5E4)-EGFP质粒的构建原理示意图。

附图6是载体pAd4、pAd4ΔE3、pAd4ΔE1△E3、pAd4ΔE1△E3(5E4)和pAd4ΔE1ΔE3(5E4)-EGFP双酶切结果。

附图7是Ad4复制缺陷型腺病毒的生产及纯化结果。

附图8是复制缺陷型Ad4载体在HEK293及A549细胞中的噬斑形成实验结果。

附图9是Ad4复制缺陷型腺病毒免疫小鼠的实验方案和免疫后血清中抗Ad4中和抗体的检测结果。

具体实施方式

本发明公开了一种复制缺陷型人4型腺病毒载体的制备方法。本发明所述腺病毒载体的制备方法和构建思路适用于针对腺病毒及其他病原体疫苗的研发，抗腺病毒药物及中和抗体的筛选，以及生物学研究中的报告示踪系统。

本发明术语“人4型腺病毒”指本领域普通技术人员已知的4型腺病毒，实施例中用到的Ad4基因组也来源于这些已知的人4型腺病毒。本发明所述复制缺陷型人4型腺病毒载体不局限于实施例所采用的特定临床分离株。

本发明术语“外源序列”是指非4型腺病毒来源的任何DNA序列。本领域普通技术人员应当理解，外源序列可以是外源基因表达框，也可以是shRNA或miRNA的表达框等。

在以下实施例中，根据本领域技术人员的理解，外源基因表达框可包含真核启动子、外源基因编码序列、转录终止子。所述外源基因编码序列可以是但不仅限于绿色荧光蛋白、其他病毒抗原、shRNA等的编码序列。

为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例结合附图详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。

实施例1：Ad4腺病毒基因组的环化。

1.Ad4基因组环化穿梭载体的构建。

以Ad4基因组为模板进行PCR扩增，得到重组臂Ad4-L及Ad4-R。

Ad4-L引物序列：

Ad4-L Fw，ATAGAATTCGGGGTGGAGTGTTTTTGCAAG(SEQ ID NO.1)；

Ad4-L RwR，TTTACTAGTGTTTAAACGTAATCGAAACCTCCACGTAATGG(SEQ ID NO.2)。

PCR程序：95℃，30秒；62℃，30秒；72℃，20秒；25个循环。

Ad4-R引物序列：

Ad4-R Fw，ACTAGTAGCTGGATCCAAGCCTCGAGGCACTACAATG(SEQ ID NO.3)；

Ad4-R Rw，CCTGCCGTTCGACGATGCGATCGCCATCATCAATAATATACCTTATAGATGG(SEQ IDNO.4)。

PCR程序：95℃，30秒；55℃，30秒；72℃，80秒；25个循环。

采用同源重组酶(Vazyme)连接至pSIMPLE 19(EcoRV)载体(TaKaRa)得到Ad4基因组环化穿梭质粒pT-Ad4(L+R)。

2.pAd4质粒的构建。

pT-Ad4(L+R)以SpeI或BamHI线性化后，与Ad4基因组共转化BJ5183感受态细胞(Stratagene)；经氨苄青霉素抗性筛选后，手工提取质粒，进一步转化XL-Blue感受态细胞(北京斯百汇生物科技有限公司)；手工提取质粒，得到pAd4，技术流程如附图1所示。以不同的酶切组合进行酶切鉴定，如附图6所示。

实施例2：E3基因的敲除及pAd55ΔE3质粒的构建。

1.E3基因敲除穿梭质粒pVax-delE3(L+R)的构建。

以Ad4基因组为模板进行PCR扩增，得到重组臂L-delE3及R-delE3。

L-delE3引物序列：

L-delE3F，GACATTGATTATTGACTAGTTTCAACACCTGGACCACTGCC(SEQ ID NO.5)；

L-delE3R，ATTTAAATTGGAATTCAAGGTCAGAGACTGGTTGAAGGATG(SEQ ID NO.6)。

PCR程序：95℃，30秒；55℃，30秒；72℃，20秒；25个循环。

R-delE3引物序列：

R-delE3F，GAATTCCAATTTAAATAGCAGTCTGGCGATACCAAGG(SEQ ID NO.7)；

R-delE3R，GTTTAAACGGGCCCTCTAGACATTCTTGGTGGTGACAGGGTC(SEQ ID NO.8)。

PCR程序：95℃，30秒；55℃，30秒；72℃，20秒；25个循环。

采用同源重组酶(Vazyme)连接至pVax载体(Invitrogen)得到到敲除E3基因的穿梭质粒pVax-delE3(L+R)。

2.pAd4ΔE3质粒的构建。

pVax-delE3(L+R)以SpeI和PmeI双酶切线性化后，与EcoRI部分酶切线性化的pAd4共转化BJ5183感受态细胞(Stratagene)；经氨苄青霉素抗性筛选后，手工提取质粒，进一步转化XL-Blue感受态细胞(北京斯百汇生物科技有限公司)；手工提取质粒，得到pAd4ΔE3质粒，技术流程如附图2所示。以不同的酶切组合进行酶切鉴定，如附图6所示。所得到的pAd55ΔE3质粒中的腺病毒基因组原E3区引入1个SwaI酶切位点，以方便后续克隆。

实施例3：E1基因的敲除及pAd4ΔE1ΔE3质粒的构建。

1.E1基因敲除穿梭质粒pVax-delE3(L+R)的构建。

以Ad4基因组为模板进行PCR扩增，得到重组臂L-delE1及R-delE1。

L-delE1引物序列：

L-delE1F，CCAGATATACGCGTGTATACCATCATCAATAATATACCTTATAGATGG(SEQ IDNO.9)；

L-delE1R，GATATCAAGTTAATTAAAATCGAAACCTCCACGTAAAC(SEQ ID NO.10)。PCR程序：95℃，30秒；50℃，30秒；72℃，20秒；25个循环。

R-delE1引物序列：

R-delE1F，TTAATTAACTTGATATCGTGTGGATGTGACGGAGGAC(SEQ ID NO.11)；

R-delE1R，GCCCAGTAGAAGCGCCGGTGCGGGATTATTAGTGGAACTTGAG(SEQ ID NO.12)。

PCR程序：95℃，30秒；55℃，30秒；72℃，20秒；25个循环。

采用同源重组酶(Vazyme)连接至pVax载体(Invitrogen)得到到敲除E1基因的穿梭质粒pVax-delE1(L+R)。

2.pAd4ΔE1ΔE3质粒的构建。

pVax-delE1(L+R)以BstZ17I+SgrAI双酶切线性化后，与PsiI酶切线性化的pAd4ΔE3共转化BJ5183感受态细胞(Stratagene)；经氨苄青霉素抗性筛选后，手工提取质粒，进一步转化XL-Blue感受态细胞(北京斯百汇生物科技有限公司)；手工提取质粒，得到pAd4ΔE1ΔE3质粒，技术流程如附图3所示。以不同的酶切组合进行酶切鉴定，如附图6所示。所得到的pAd55ΔE3质粒中的腺病毒基因组原E3区引入1个PacI酶切位点，以方便后续克隆。

实施例4：Ad4E4基因的改造及pAd4ΔE1ΔE3(5E4)质粒的构建。

1.Ad4E4基因的改造穿梭质粒pGK143-(L+R)的构建。

以Ad4基因组为模板进行PCR扩增，得到重组臂4E4L及4E4R。

4E4L引物序列：

4E4R F，CATTGATTATTGACTAGAGTATAC CATGCTGGCGCGGCTGACCTAGCT(SEQ IDNO.13)；

4E4R R，CGGATCCGCTGTGATTCCAACCACCGAGGACAGCCCTC(SEQ ID NO.14)。

PCR程序：95℃，30秒；60℃，30秒；72℃，20秒；25个循环。

4E4R引物序列：

4E4R F，CGGATCCGTCCAGCATGGTTAGTGTTTTTGGTGATCTGTAGAAC(SEQ ID NO.15)；

4E4R R，TAGAAGCGCCGGTGGGTAAGCTATGGACGCTGAG(SEQ ID NO.16)。

PCR程序：95℃，30秒；60℃，30秒；72℃，20秒；25个循环。

采用同源重组酶(Vazyme)连接至pVax载体(Invitrogen)得到到Ad4E4基因的改造的穿梭质粒pGK143-(L+R)。

2.Ad4E4基因的改造穿梭质粒pGK143-5E4的构建。

以Ad5基因组为模板进行PCR扩增得到Ad5腺病毒E4基因的5E4(Orf2-Orf6)。

5E4引物序列：

5E4F，TCCTCGGTGGTTGGAATCACAGCTACATGGGGGTAGAGTCATAATCG(SEQ ID NO.17)；

5E4R，CCAAAAACACTAACCATGCTGGAATGCAGAAACCCGCAGACATGTTTGAG(SEQ IDNO.18)。

PCR程序：95℃，30秒；65℃，30秒；72℃，20秒；25个循环。

采用同源重组酶(Vazyme)连接至BamHI线性化的pGK143-(L+R)载体，得到Ad4E4基因的改造的穿梭质粒pGK143-5E4。

3.pAd4ΔE1ΔE3(5E4)质粒的构建。

pGK143-5E4以BstZ17I+SgrAI双酶切线性化后，与SwiI酶切线性化的pAd4ΔE1ΔE3共转化BJ5183感受态细胞(Stratagene)；经氨苄青霉素抗性筛选后，手工提取质粒，进一步转化XL-Blue感受态细胞(北京斯百汇生物科技有限公司)；手工提取质粒，得到pAd4ΔE1ΔE3(5E4)质粒，技术流程如附图4所示。以不同的酶切组合进行酶切鉴定，如附图6所示。

实施例5：携带外源基因的穿梭质粒及pAd4ΔE1ΔE3(5E4)-EGFP质粒的构建。

1.构建携带外源基因表达框的穿梭质粒pGK3-EGFP。

1.1以Ad4基因组为模板PCR扩增得到E1区同源重组臂4SE1L及4SE1R：

SE1L引物序列：

4SE1L Fw，CCAGATATACGCGTGTATACCATCATCAATAATATACCTTATAGATGG(SEQ IDNO.19)；

4SE1R Rw，GATATCAAGTTAATTAAAATCGAAACCTCCACGTAAAC(SEQ ID NO.20)。

PCR程序：95℃，30秒；55℃，30秒；72℃，20秒；25个循环。

4SE1R引物序列：

4SE1R Fw，TTAATTAACTTGATATCGTGTGGATGTGACGGAGGAC(SEQ ID NO.19)；

4SE1R Rw，GCCCAGTAGAAGCGCCGGTGCGGGATTATTAGTGGAACTTGAG(SEQ ID NO.20)。

PCR程序：95℃，30秒；55℃，30秒；72℃，1分钟30秒；25个循环。

1.2构建携带重组臂的穿梭质粒pGK41-(L+R)。

采用同源重组酶(Vazyme)连接将E1区同源重组臂4SE1L和4SE1R连接至pVax载体，得到携带重组臂的穿梭质粒pGK41-(L+R)。

1.3构建携带外源基因表达框的穿梭质粒pGK41-EGFP。

以pGA1-EGFP为模板，以下列引物PCR得到CMV-EGFP-BGH表达框。

引物序列：

CMV，GTCACATCCACACGATACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGG(SEQ ID NO.21)；

BGH，TTTTAATTAACTTGATCCTGCTATTGTCTTCCCAATC(SEQ ID NO.22)。

PCR程序：95℃，30秒；66℃，30秒；72℃，30s；25个循环。

采用同源重组酶(Vazyme)将CMV-EGFP-BGH表达框连接至pGK41-(L+R)载体，得到携带重组臂的穿梭质粒pGK41-EGFP。

2.构建基因组质粒pAd4ΔE1ΔE3(5E4)-EGFP。

pGK41-EGFP质粒以BstZ17I+SgrAI切，乙醇沉淀回收；pAd4ΔE1ΔE3(5E4)以PacI线性化后乙醇沉淀回收；共转化BJ5183，同源重组得到携带外源基因表达框的pAd4ΔE1ΔE3(5E4)-EGFP质粒，技术流程如附图5所示。双酶切鉴定结果参见附图6。

实施例6：复制缺陷型Ad55载体的拯救与生产

按照常规方法，pAd4ΔE1ΔE3(5E4)和pAd4ΔE1ΔE3(5E4)-EGFP分别以AsiSI线性化，乙醇沉淀回收，阳离子脂质体转染法转染293细胞，转染后8小时，加入2毫升含5％胎牛血清的DMEM培养基，孵育7-10天，观察细胞病变；出毒后，收集细胞及培养上清，在37度水浴及液氮中反复冻融3次并离心去除细胞碎片，上清感染10厘米皿；2-3天后，收集细胞及培养上清，反复冻融3次并离心去除细胞碎片，上清感染3-5个15厘米皿；2-3天后，收集细胞，反复冻融3次并离心去除细胞碎片；上清感染30个15厘米皿2-3天后，收集细胞，反复冻融3次并离心去除细胞碎片；上清加至氯化铯密度梯度离心管；4℃,40000转，离心4小时；吸出病毒条带，脱盐，分装；以OD260吸光度测定病毒粒子滴度，计算公式为：病毒浓度＝OD260×稀释倍数×36/基因组长度(Kb)；病毒储存液于-80℃冻存。复制缺陷型Ad4载体的生产及纯化结果如附图7所示。

实施例7：复制缺陷型Ad4病毒在A549及293细胞中的复制能力测定。

按照常规实验方法，以噬斑形成实验鉴定复制缺陷型Ad4病毒在辅助细胞HEK293和非辅助细胞A549中的生长能力。六孔板中293或A549细胞长至九成满后，以Ad4ΔE1ΔE3(5E4)-EGFP和Ad4ΔE3(5E4)-EGFP进行感染，感染滴度为1X10⁷Vp/孔。感染后4小时，吸走培养基，并铺上1％的琼脂糖凝胶(含1％琼脂糖，1％BSA，1×MEM培养基)。37℃培养箱内放置9－12天后，在荧光显微镜下观察病毒克隆的形成，并拍照记录。结果如附图8所示。Ad4ΔE3-EGFP保留完整的E1基因，因此感染HEK293及A549细胞后均可形成噬斑；而复制缺陷型Ad4ΔE1ΔE3(5E4)-EGFP仅能在HEK293细胞中形成噬斑，在A549细胞中则不能形成噬斑。这表明，复制缺陷型Ad4载体可在E1基因互补的HEK293细胞中有效增殖，但在非辅助细胞如A549细胞中不具备复制能力，具有减毒表型。同时，该结果也显示复制缺陷型人4型腺病毒载体可携带报告基因进入靶细胞，因而可应用于报告示踪系统中。

实施例8：复制缺陷型Ad4载体在小鼠中免疫原性的评估。

按照附图7所示的免疫方案，对复制缺陷型Ad55的免疫原性进行了评估。

6-8周龄Balb/c小鼠分为4组，每组12只；第0天，G1组肌肉注射Ad4ΔE1ΔE3(5E4)病毒，剂量为1×10⁸vp/只；G2组肌肉注射Ad4ΔE1ΔE3(5E4)病毒，剂量为1×10⁹vp/只；G3组肌肉注射β丙内酯灭活的Ad4ΔE1ΔE3(5E4)病毒，剂量为1×10⁹vp/只；第21天，眼眶取血并分离血清；第28天，按上述方案加强免疫；第42天，摘眼球取血并分离血清。

按照常规方法，以Ad4ΔE3-SEAP作为报告病毒检测小鼠血清中抗Ad4的中和抗体。293细胞铺至96孔板，小鼠血清以无酚红无血清培养基梯度稀释；分别以100ul 1X10⁷Vp/ml的Ad4ΔE3-SEAP与血清共孵育，37℃1小时后加至细胞培养板；继续孵育24小时后，每孔取50微升培养上清，加至96孔黑色板；以phospha-light^TM system(Applied Biosystem)进行检测，在荧光照度计上读取发光值；根据读数计算中和抗体的滴度。小鼠体内中和抗体滴度如图9所示，免疫组小鼠在初免后即可产生Ad4中和抗体；而加强后抗体水平显著提升；灭活Ad4免疫产生的中和抗体滴度相对未灭活组较低。该结果说明复制缺陷型Ad4载体可潜在的应用于抗Ad4疫苗研发。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，这些实验例的描述清楚、具体，但并不能理解为对本发明专利范围的限制。需要强调的是，对于本领域的普通技术人员来说，在在本次发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本项发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。