具体实施方式

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。

实施例1

主要原料按重量份数计：菌草鹿角灵芝15份，富硒茶10份，紫苏1份，麦芽糊精1份。

制备方法包括以下步骤：

1）将菌草鹿角灵芝、富硒茶、紫苏烘干，加20倍水，浸泡6 h，80℃超声4 h，过滤；药渣再加20倍水，80℃超声4 h，合并滤液；60℃真空减压浓缩，真空冷冻干燥，得干浸膏粉；

2）加入麦芽糊精，混合均匀，70℃杀菌20 min，均质，喷雾干燥，包装。

喷雾干燥参数：进风温度190℃，排风温度90℃，负压150 Pa，进料速度25 r/min。

实施例2

主要原料按重量份数计：菌草鹿角灵芝17.7份，富硒茶12.38份，紫苏1.27份，麦芽糊精3份。

制备方法包括以下步骤：

1）将菌草鹿角灵芝、富硒茶、紫苏烘干，加20倍水，浸泡6 h，80℃超声4 h，过滤；药渣再加20倍水，80℃超声4 h，合并滤液；60℃真空减压浓缩，真空冷冻干燥，得干浸膏粉；

2）加入麦芽糊精，混合均匀，72℃杀菌18 min，均质，喷雾干燥，包装。

喷雾干燥参数：进风温度195℃，排风温度93℃，负压150 Pa，进料速度25 r/min。

实施例3

主要原料按重量份数计：菌草鹿角灵芝20份，富硒茶15份，紫苏2份，麦芽糊精5份。

制备方法包括以下步骤：

1）将菌草鹿角灵芝、富硒茶、紫苏烘干，加20倍水，浸泡6 h，80℃超声4 h，过滤；药渣再加20倍水，80℃超声4 h，合并滤液；60℃真空减压浓缩，真空冷冻干燥，得干浸膏粉；

2）加入麦芽糊精，混合均匀，75℃杀菌15 min，均质，喷雾干燥，包装。

喷雾干燥参数：进风温度200℃，排风温度90-95℃，负压150 Pa，进料速度25 r/min。

1超声提取工艺与传统水提工艺对浸膏得率的影响

超声水提法得到的浸膏得率、多糖含量都高于传统的水提工艺得到的浸膏得率和多糖含量，这可能是由于超声提取利用其所具有的机械效应、空化效应、热效应通过增大介质分子的运动速度、增大介质的穿透力以提取生物有效成分，加快了多糖分子的溶出，提高了多糖的溶出效果，同时保证了多糖的结构不被破坏，对多糖在人体和动物中所发挥的活性作用起到了很好保护效果。

2 复方菌草鹿角灵芝提取物各组分配伍关系对巨噬细胞功能的影响

2.1动物预处理

将雄性，4-5周龄SPF级BALB/c小鼠随机分为9组，每组10只。本实验以复方菌草鹿角灵芝提取物低剂量为例，分析在同一剂量配伍下各单味药材之间是否存在联系，对复方是否存在影响。设计以下实验组：复方菌草鹿角灵芝提取物低剂量组（A组）4.065 g/kg、菌草鹿角灵芝水提取物组（B组）2.3 g/kg、紫苏水提取物组（C组）0.165 g/kg、富硒茶水提取物组（D组）1.6 g/kg、菌草鹿角灵芝+富硒茶水提取物组（E组）3.9 g/kg、菌草鹿角灵芝+紫苏水提取物组（F组）2.465 g/kg、紫苏+富硒茶水提取物组（G组）1.765g/kg，每日对小鼠灌胃给药1次，每次0.3 mL，对空白对照组小鼠每日灌胃0.3 mL的生理盐水1次，对阳性对照组小鼠每日灌胃0.3 mL的左旋咪唑1次，剂量为10 mg/kg，连续给药28 d。

2.2鸡红细胞悬液制备

取鸡血置于有玻璃珠的锥形瓶中，朝一个方向充分摇动，以脱纤维。用生理盐水洗涤2-3次，离心，2000 r/min，10 min，去上清，用生理盐水配成1%V/V的鸡红细胞悬液。

2.3吞噬功能测定

（1）停药前三天向每只小鼠腹腔注射5%淀粉肉汤溶液1 mL，每天1次，连续3 d。停药次日，每只小鼠腹腔注射1%鸡红细胞悬液1 mL，间隔30 min，颈椎脱臼处死动物将其仰位固定于鼠板上，正中剪开腹壁皮肤，经腹腔注入生理盐水2 mL，转动鼠板1 min，吸出腹腔洗液1mL。（2）将回收的腹腔洗液注入干净的离心管中，1200 r/min离心10 min，弃上清液后加入PBS缓冲液冲洗细胞2次。所得细胞沉淀用预冷RPMI1640培养液洗涤，将沉淀细胞再加入预冷RPMI1640培养液重悬细胞，计数，调整浓度至2×10⁶个/mL。将细胞接种于96孔板中，100μL每孔，每个样品3个复孔，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养，使巨噬细胞贴壁，孵育3ｈ，轻摇培养板，弃培养上清液，用37℃预温的RPMI1640培养液轻轻冲洗培养孔1~2次，充分弃去非黏附的淋巴细胞和其他细胞，获得贴壁细胞即为单层的巨噬细胞。按下式计算吞噬百分率和吞噬指数：

吞噬百分率（%）=吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数／计数的巨噬细胞数×100%

吞噬指数=吞噬的鸡红细胞总数／计数的巨噬细胞。

2.4 实验结果分析

如图1所示，与空白对照组比较，阳性对照组的巨噬细胞吞噬率存在极显著差异（P<0.01）,复方菌草鹿角灵芝提取物低剂量组、菌草鹿角灵芝水提取物组（B组）、灵芝+富硒茶水提取物组（E组）、菌草鹿角灵芝+紫苏水提取物组（F组）、紫苏+富硒茶水提取物组（G组）的巨噬细胞吞噬率呈现显著性差异（P<0.05），紫苏水提取物组（C组）、富硒茶水提取物组（D组）与空白对照组相比无显著性差异，通过比较B组和E组，B组和F组，分别加了富硒茶、紫苏成分后，E组、F组的巨噬细胞吞噬率明显高于B组，而单味药材富硒茶水提取物和紫苏水提物与空白对照组相比无显著性差异，说明添加了富硒茶、紫苏成分后，能够增强小鼠巨噬细胞的吞噬率。通过分析紫苏水提取物组（C组）、富硒茶水提取物组（D组)和紫苏+富硒茶水提取物组（G组）,表明紫苏和富硒茶成分组合后提高小鼠巨噬细胞吞噬率的效果优于各成分单独作用的效果，复方菌草鹿角灵芝提取物低剂量组的吞噬率与E组、F组、G组相比，小鼠巨噬细胞的吞噬率明显高于E组、F组、G组，表明三者组合后提高小鼠巨噬细胞的吞噬率效果比其两两组合效果更优，通过上述分析表明紫苏、富硒茶和菌草鹿角灵芝之间在提高小鼠巨噬细胞吞噬率方面具有协同作用。

3复方菌草鹿角灵芝水提物对小鼠细胞免疫功能的影响

3.1动物预处理

将雄性，4-5周龄SPF级BALB/c小鼠随机分为5组，每组10只。将复方菌草鹿角灵芝提取物分别按低剂量 4.065 g/kg，中剂量8.13 g/kg，高剂量16.26 g/kg每日对小鼠灌胃给药1次，每次0.3 mL，对空白对照组小鼠每日灌胃0.3 mL生理盐水1次，对阳性对照组小鼠每日灌胃0.3 mL（的）左旋咪唑1次，剂量为10 mg/kg，连续给药28 d。

3.2脾细胞悬液的制备

将SRBC免疫4-5天后的小鼠颈椎脱臼处死，用75%乙醇浸泡小鼠3 min，沿腹腔中线剪开小鼠腹腔，取出脾脏置于培养皿中，解剖后取出脾脏，将表面包膜及脂肪组织剥离干净，放在盛有无菌PBS的大培养皿中，用两块无菌的磨砂载玻片碾压脾脏，再用PBS清洗载玻片，最后将细胞液通过200目的网筛。洗涤脾细胞2次，每次1000 r/min离心10 min。计数细胞，并将细胞浓度调整为5×10⁶个/mL，测定脾脏的空斑形成细胞数。

3.3 细胞因子测定

取眼球血样并离心，3000 r/min，离心5 min，取上清液。提前20 min取出INF-γ、IL-2、IL-10试剂盒平衡至室温，用超纯水将20×浓缩洗涤液稀释成1×工作液，加入标准品&标本通用稀释液1.5 mL至冻干样品中，静置15 min，轻轻混匀，稀释成2000、1000、500、250、125、62.5、31.25、0 pg/mL，96孔板中空白孔加标准品&标本通用稀释液，其余孔加标本或不同浓度标准品（100μ/孔），用封板胶纸封住反应孔，37℃孵育120 min，洗板5次后，空白孔加酶结合物稀释液，其余孔加酶结合物工作液（100μ/孔），用封板胶纸封住反应孔，37℃避光孵育60 min。洗板5次。加入显色底物（TMB）100μ/孔，37℃避光孵育20 min。加入终止液100μ/孔，震荡1 min后马上测量OD₄₅₀值。

3.4试验结果分析

通过图2可知，与空白对照组相比，低剂量组和中剂量组小鼠体内的IFN-γ、IL-2和IL-10含量升高，高剂量组小鼠体内的IFN-γ、IL-2和IL-10含量与空白对照组相比无显著差异。IFN-γ和IL-2是Th1产生的两种主要的正性免疫调节因子，IFN-γ不仅可增强T细胞功能，而且能够诱导骨髓巨噬细胞向M1型巨噬细胞极化，发挥杀伤作用，IL-2可促进T细胞增殖活化和NK细胞杀伤活性，IL-10是T细胞、自然杀伤细胞和巨噬细胞产生的一种抗炎性细胞因子，IL-10可防止和抑制强大的特异和非特异性免疫反应和由此导致的组织损伤，IL-10含量增加可增强消除病原体的能力，从而达到免疫调节的作用，因此IFN-γ、IL-2和IL-10含量的升高，表明低剂量和中剂量的复方菌草鹿角灵芝提取物对于提高小鼠体内的IFN-γ、IL-2和IL-10细胞因子具有促进的作用，复方菌草鹿角灵芝提取物能够增强小鼠的免疫功效，高剂量组小鼠体内的IFN-γ、IL-2和IL-10含量与空白组比较无显著差异，这可能是由于高剂量的复方菌草鹿角灵芝提取物引起小鼠的肝脏、肾脏代谢和功能的异常，从而影响小鼠的免疫功能，对于其副作用还需进一步的实验探究。

4复方菌草鹿角灵芝水提物对小鼠体液免疫功能的影响

4.1动物预处理

将雄性，4-5周龄SPF级BALB/c小鼠随机分为5组，每组10只。将复方菌草鹿角灵芝提取物分别按低剂量 4.065 g/kg，中剂量8.13 g/kg，高剂量16.26 g/kg每日对小鼠灌胃给药1次，每次0.3 mL，对空白对照组小鼠每日灌胃0.3 mL的生理盐水1次，对阳性对照组小鼠每日灌胃0.3 mL的左旋咪唑1次，剂量为10 mg/kg，连续给药28 d。

4.2脾细胞悬液的制备

将SRBC免疫4~5天后的小鼠颈椎脱臼处死，用75%乙醇浸泡小鼠3 min，沿腹腔中线剪开小鼠腹腔，取出脾脏置于培养皿中，将表面包膜及脂肪组织剥离干净，放在盛有无菌PBS的培养皿中，用两块无菌的磨砂载玻片碾压脾脏，用PBS清洗载玻片，将细胞液通过200目的网筛。洗涤脾细胞2次，每次1000 r/min离心10 min。计数，并将细胞浓度调整为5×10⁶个/mL，制成脾细胞悬液，测定脾脏的空斑形成细胞数。

4.3空斑测定

称取1g琼脂糖加双蒸水至100 mL配制表层培养基备用，将表层培养基加热溶解后，放45℃水浴保温，与等量pH 7.2~7.4，2倍浓度的Hanks液混合，分装小试管，每管0.5 mL，再向管内加50 μL10%SRBC（V/V）用SA液配制，20 μL脾细胞悬液，迅速混匀，倾倒于已刷琼脂糖薄层的玻片上，做平行片，待琼脂凝固后，将玻片水平扣放在片架上，放入二氧化碳培养箱中温育1~1.5 h，然后用SA缓冲液稀释的补体1∶8加到培养基上层，继续温育1~1.5 h后，计数溶血空斑数。

通过图3分析可知，与空白对照组相比，低剂量组和中剂量组的溶血空斑数存在显著性差异（P<0.05），高剂量组小鼠的溶血空斑数与空白对照组相比无显著性差异，空斑的形成是由释放溶血性抗体的B淋巴细胞在补体的参与下可溶解周围的羊红细胞，在周围形成一个可见的空斑，一个空斑代表一个抗体形成细胞，所以空斑数量反应机体的体液免疫功能和小鼠体内特异性抗体生成细胞的数量，通过上述数据可知，复方菌草鹿角灵芝提取物能够增强小鼠的体液免疫功效和抗体生成细胞的数量。

5 复方菌草鹿角灵芝水提物对小鼠单核-巨噬细胞功能的影响

5.1动物预处理

将雄性，4-5周龄SPF级Balb/c小鼠随机分为5组，每组10只。将复方菌草鹿角灵芝提取物分别按低剂量4.065 g/kg，中剂量8.13 g/kg，高剂量16.26 g/kg每日对小鼠灌胃给药1次，每次0.3 mL，对空白对照组小鼠每日灌胃0.3 mL的生理盐水1次，对阳性对照组小鼠每日灌胃0.3 mL的左旋咪唑1次，剂量为10 mg/kg，连续给药28 d。

5.2鸡红细胞悬液制备

取鸡血置于有玻璃珠的锥形瓶中，朝一个方向充分摇动，以脱纤维。用生理盐水洗涤2-3次，离心，2000 r/min，10 min，去上清，用生理盐水配成1%V/V的鸡红细胞悬液。

5.3吞噬功能测定

（1）停药前三天向每只小鼠腹腔注射5%淀粉肉汤溶液1 mL，每天1次，连续3 d。停药次日，每鼠腹腔注射1%鸡红细胞悬液1 mL，间隔30 min，颈椎脱臼处死动物将其仰位固定于鼠板上，正中剪开腹壁皮肤，经腹腔注入生理盐水2 mL，转动鼠板1 min，吸出腹腔洗液1 mL。

（2）将回收的腹腔洗液注入干净的离心管中，1200 r/min离心10 min，弃上清液后加入PBS缓冲液冲洗细胞2次。所得细胞沉淀用预冷RPMI1640培养液洗涤，将沉淀细胞再加入预冷RPMI1640培养液重悬细胞，计数，调整浓度至2×10⁶个/mL。将细胞接种于96孔板中，100μL每孔，每个样品3个复孔，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养，使巨噬细胞贴壁，孵育3ｈ，轻摇培养板，弃培养上清液，用37℃预温的RPMI1640培养液轻轻冲洗培养孔1~2次，充分弃去非黏附的淋巴细胞和其他细胞，获得贴壁细胞即为单层的巨噬细胞。按下式计算吞噬百分率和吞噬指数：

吞噬百分率（%）=吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数／计数的巨噬细胞数×100%

吞噬指数=吞噬的鸡红细胞总数／计数的巨噬细胞。

5.4 实验结果分析

表1巨噬组小鼠脾指数和胸腺指数

注：与空白对照组比较，*表示P<0.01,#表示P<0.05

通过表1可知，与空白对照组相比，低剂量组、中剂量组小鼠的脾指数呈现显著性差异（P<0.05），高剂量组和阳性对照组小鼠的脾指数无显著性差异。与空白对照组比较，实验组小鼠的胸腺指数无显著差异。低剂量组、中剂量组和阳性对照组小鼠的脾指数和胸腺指数均高于空白对照组，而高剂量组小鼠脾指数和胸腺指数低于空白对照组，无显著性差异，表明低剂量和中剂量的复方菌草鹿角灵芝提取物对小鼠脾脏和胸腺的生长发育有促进作用。

表2 复方菌草鹿角灵芝提取物对小鼠巨噬细胞吞噬能力的影响

注：与空白对照组比较，*表示P<0.01,#表示0.01<P<0.05，△表示与中剂量组相比P<0.05

对表2的小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬率及吞噬指数数据进行统计学单因素方差分析，结果如下：1.阳性对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组小鼠巨噬细胞的吞噬率和吞噬指数均高于空白对照组，经统计学分析，阳性对照组、低剂量组和中剂量组小鼠巨噬细胞的吞噬率与空白对照组比较差异呈现极显著水平（P<0.01），阳性对照组和中剂量组小鼠巨噬细胞的吞噬指数与空白对照组比较差异呈现极显著水平(P<0.01)，低剂量组与空白对照组小鼠巨噬细胞的吞噬指数比较差异呈现显著水平（P<0.05）,其中阳性对照组小鼠巨噬细胞的吞噬率和吞噬指数最高，表明低剂量和中剂量复方菌草鹿角灵芝提取物对提高巨噬细胞的吞噬能力有显著作用，从而提高机体的免疫力。2.高剂量组巨噬细胞的吞噬率和吞噬指数与空白对照组相比无显著差异，表明高剂量组对增强巨噬细胞的吞噬作用效果比低剂量组和中剂量组差，经统计学分析无显著差异（P>0.05）3.与中剂量组相比较，高剂量组呈现显著性差异(P<0.05)，表明适宜剂量对巨噬细胞的吞噬作用有促进作用，而高剂量的复方菌草鹿角灵芝提取物可能由于对肝脏、肾脏等产生负面影响，影响了小鼠的免疫系统，从而导致其吞噬率、吞噬指数反而下降。

6 复方菌草鹿角灵芝水提物对小鼠抗肿瘤功能的影响

6.1动物模型建立及处理

取40只雄性，4-5周龄SPF级ICR小鼠，准备好浓度为1.0×10⁷/mL 的S180小鼠肉瘤细胞悬液。ICR小鼠右前肢腋部用酒精作表面消毒，然后将0.2 mLS180小鼠肉瘤细胞注入右前肢腋部皮下。隔日将接种后的小鼠随机分为4组，即空白对照组（生理盐水组）、低剂量组（4.065 g/kg）、中剂量组（8.13 g/kg）和高剂量组（16.26 g/kg）3个剂量组，接种一周后，接种处长出 80~90 mm³大小的肿瘤时说明造模成功，根据小鼠体重开始灌胃给药，每日一次，连续10天。给药后每日记录肿瘤大小及ICR小鼠体重。

6.2肿瘤抑制率、脾指数、胸腺指数的测定

10天后，各组处死ICR小鼠，处死前8小时，小鼠不能接触食物。通过颈椎脱臼处死小鼠，剥离肿瘤，胸腺和脾，分别称重，计算复方菌草鹿角灵芝提取物对小鼠S180肿瘤的抑制率，小鼠的脾脏指数和胸腺指数。计算脾脏指数和胸腺指数根据以下公式：脾脏指数=脾重（mg）/死亡时的体重（g）；胸腺指数=胸腺重量（mg）/死亡时的体重（g）。

6.3生存期实验

将雄性，4-5周龄SPF级ICR小鼠右前肢腋部用酒精作表面消毒，无菌条件下，取接种7天的S180小鼠肿瘤细胞悬液，用台盼蓝染色后计数，用PBS稀释将细胞浓度调至1×10⁷/mL，将0.2 mL小鼠腹水瘤细胞注入右前肢腋部。接种次日，将小鼠随机分为4组，每组10只，雌雄各半。复方菌草鹿角灵芝提取物分别按低剂量4.065 g/kg、中剂量8.13 g/kg、和高剂量16.26g/kg，每日灌胃给药1次，空白对照组每日灌胃0.3 mL的生理盐水１次，给药18天后停药观察，观察和记录小鼠死亡时间，记录生存天数，按公式计算各组小鼠的生命延长率。

生命延长率=(治疗组平均生存天数-对照组组平均生存天数)/对照组平均生存天数)×100%

表3复方菌草鹿角灵芝提取物对小鼠肿瘤组脾指数和胸腺指数的影响

注：与空白对照组比较，*表示P<0.01,#表示P<0.05

表4复方菌草鹿角灵芝提取物对小鼠肿瘤的影响

注：与空白对照组比较，*表示P<0.01,#表示P<0.05

通过对表4数据进行统计学分析，与空白对照组比较，低剂量组、中剂量组和高剂量组小鼠的肿瘤重量均低于空白对照组，低剂量组和中剂量组小鼠的平均瘤重与空白对照组比较呈现显著差异（P<0.05），高剂量组小鼠的肿瘤重量与空白对照组比较无显著差异（P>0.05），说明在连续喂药后能够一定程度地抑制肿瘤增长，中剂量组小鼠的抑瘤率为40.30%，低剂量组小鼠的抑瘤率为36%，高剂量组小鼠的抑瘤率为12.49%。高剂量组小鼠的抑瘤率低于低剂量组和中剂量组，结合前面的实验以及胸腺指数和脾指数，我们可以初步判断高剂量会对小鼠免疫功能造成一定的副作用，使其抗肿瘤效果比低剂量组和中剂量组抗肿瘤效果差，通过对生存周期和生命延长率分析可知，随着抑瘤率的增高，小鼠的生存周期和生命延长率也随之增高，表明一定浓度的复方菌草鹿角灵芝提取物能够抑制肿瘤的生长，从而提高小鼠的生存周期和生命延长率。

7 复方菌草鹿角灵芝粉冲剂、复方菌草鹿角灵芝茶粉对溶血空斑和抑瘤率影响的比较

参考专利号CN201910220780.3复方菌草鹿角灵芝茶粉的制备工艺和实验流程，在相同实验条件下，以复方菌草鹿角灵芝茶粉中剂量为例：灵芝粗多糖100mg/kg，富硒红茶茶多酚320mg/kg，紫苏乙醇提取物8.54mg/kg，探究其与复方菌草鹿角灵芝粉冲剂低剂量对溶血空白和抑瘤率效果的差异，从而对配方组合进行评价。为了在同一水平下进行比较，通过提取率换算，得到复方菌草鹿角灵芝茶粉中剂量为：菌草鹿角灵芝2.403 g/kg、富硒茶3.596 g/kg、紫苏0.166 g/kg。复方菌草鹿角灵芝粉冲剂低剂量为：菌草鹿角灵芝2.3g/kg，富硒红茶1.6g/kg，紫苏0.165g/kg。

表5 复方菌草鹿角灵芝粉冲剂、复方菌草鹿角灵芝茶粉对溶血空斑和抑瘤率的影响

通过表5可知，复方菌草鹿角灵芝粉冲剂低剂量组在溶血空斑数和对小鼠S180肉瘤抑瘤率方面高于复方菌草鹿角灵芝茶粉中剂量组，而复方菌草鹿角灵芝茶粉中剂量组各组分原材料用量却高于复方菌草鹿角灵芝粉冲剂低剂量组用量，表明复方菌草鹿角灵芝粉冲剂各组分配伍比例在提高小鼠溶血空斑和抑瘤率方面效果更好，同时这也可能是由于超声辅助水提的方法，通过响应面优化增强了菌草鹿角灵芝、富硒茶、紫苏中的有效成分溶出效果，同时保留有效成分的生物活性，在生产应用中对节省原材料具有重要的意义。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。