水果中三种多酚加合物的连续提取方法及其应用
阅读说明：本技术 水果中三种多酚加合物的连续提取方法及其应用 (Continuous extraction method of three polyphenol adducts in fruits and application thereof ) 是由 苏东晓 罗楠 辛婷 唐淑英 舒彬 于 2021-08-13 设计创作，主要内容包括：本发明公开了水果中三种多酚加合物的连续提取方法及其应用,包括以下步骤：在果浆中加入乙醇,进行醇沉,固液分离,收集固相A；将固相A溶解后,进行水提,收集液相A和固相B；液相A脱除蛋白后,加入乙醇,醇沉后,所得的沉淀即为水溶性多酚加合物；固相B中加入碳酸钠溶液,固液分离,收集固相C和液相B,所述液相B为碱溶性多酚加合物提取液；所述固相C为不溶性多酚加合物。通过本发明的方法,可以从水果中连续提取高纯度的水溶性多酚加合物、不溶性多酚加合物和碱溶性多酚加合物,方法简单高效,工艺可操作性强,成本低,易实现工业化生产。(The invention discloses a continuous extraction method of three polyphenol adducts in fruits and application thereof, which comprises the following steps: adding ethanol into the fruit pulp, carrying out alcohol precipitation, carrying out solid-liquid separation, and collecting a solid phase A; dissolving the solid phase A, performing water extraction, and collecting a liquid phase A and a solid phase B; removing protein from the liquid phase A, adding ethanol, and precipitating with ethanol to obtain precipitate as water-soluble polyphenol adduct; adding a sodium carbonate solution into the solid phase B, carrying out solid-liquid separation, and collecting a solid phase C and a liquid phase B, wherein the liquid phase B is an alkali-soluble polyphenol adduct extracting solution; the solid phase C is an insoluble polyphenol adduct. The method can continuously extract the water-soluble polyphenol adduct, the insoluble polyphenol adduct and the alkali-soluble polyphenol adduct with high purity from the fruits, has the advantages of simple and high-efficiency method, strong process operability, low cost and easy realization of industrial production.)
技术领域
本发明属于天然产物提取技术领域，具体涉及水果中三种多酚加合物的连续提取方法及其应用。
背景技术
近年研究表明，植物多糖具有多种生物活性，如降低心血管疾病和代谢综合征。酚类物质是植物的次生代谢物，流行病学表明，酚类物质也具有对人体有益的生物活性如抗氧化，调节免疫，抑菌等。酚类物质又可分为游离酚和结合酚。结合酚与多糖共价结合，可被保护免受胃肠消化吸收，从而达到结肠发挥调节肠道菌群的益生素效应。
目前关于植物多糖的提取多种多样，如化学提取法，微波提取法，超声提取法等。研究人员通过不同的技术来缩短提取时间，降低提取能耗，提高提取效率，从而获得质量较高，纯度较纯的多糖。但植物多糖具有多种级分，不同级分多糖结合不同含量和组成的结合酚，从而有不同的抗氧化功能和生物活性，目前提取研究只是集中在某一种多糖的提取制备。现有技术并没有针对不同级分多酚加合物分离提取的方法。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种水果中三种多酚加合物的连续提取方法，能够简单高效的分离不同级分的多酚加合物。
本发明还提出一种具有上述方法的应用。
根据本发明的一个方面，提出了一种水果中三种多酚加合物的连续提取方法，所述方法包括以下步骤：
S1、在果浆中加入乙醇，进行醇沉，固液分离，收集固相A；
S2、将步骤S1所得的固相A溶解后，进行水提，收集液相A和固相B；
S3、将步骤S2所得的液相A脱除蛋白后，加入乙醇，醇沉后，所得的沉淀即为水溶性多酚加合物；
S4、将步骤S2所得的固相B中加入碳酸钠溶液，固液分离，收集固相C和液相B，所述液相B为碱溶性多酚加合物提取液；所述固相C为不溶性多酚加合物。
在本发明的一些实施方式中，步骤S1中，果浆的制备包括：将水果去皮去核，粉碎打浆。
在本发明的一些实施方式中，所述多酚加合物为多糖与多酚的复合物。
在本发明的一些实施方式中，所述水果为荔枝、苹果、猕猴桃、蓝莓、桑葚、葡萄、菠萝、草莓、香蕉、桃类、梨、杏、香瓜和西瓜中的一种或多种。
在本发明的一些实施方式中，步骤S1中，果浆与乙醇的质量体积比为1：1～10。
在本发明的一些实施方式中，步骤S1中，所述乙醇的质量分数为95％～100％。
在本发明的一些实施方式中，步骤S1中，所述醇沉的温度为1～4℃，时间为8～12h。
在本发明的一些实施方式中，步骤S1中，固液分离方式采用过滤。
在本发明的一些实施方式中，步骤S2中，所述水提的方式采用水浴加热，加热温度为85～95℃，加热时间为4～6h。
在本发明的一些实施方式中，步骤S2中，所述固液分离方式采用离心，离心速率为4000～6000rpm，时间为10～15min。
在本发明的一些实施方式中，步骤S3中，所述脱除蛋白的方式采用蛋白质沉淀剂；优选地，所述蛋白质沉淀试剂为Sevag试剂。
在本发明的一些实施方式中，Sevag试剂的组成包括三氯甲烷与正丁醇；三氯甲烷与正丁醇的体积比为4：1；
在本发明的一些实施方式中，液相与Sevag试剂的比例为1：2～6，时间为10～20min，提取次数为9～15次。提取温度为55～65℃。
在本发明的一些实施方式中，步骤S3中，加入Sevag试剂后还包括搅拌步骤，搅拌速率为100～500rpm，时间为1～5min。
在本发明的一些实施方式中，步骤S3中，加入Sevag试剂后还包括采用旋转蒸发仪60～70℃脱除有机溶剂的步骤。
在本发明的一些实施方式中，脱除蛋白沉淀的方式采用离心，离心速率为4000～6000rpm，时间为10～15min。
在本发明的一些实施方式中，步骤S3中，所述乙醇的质量分数为95％～100％。
在本发明的一些实施方式中，步骤S3中，所述水溶性多酚加合物还包括干燥步骤，50～75℃真空干燥至恒重。
在本发明的一些实施方式中，步骤S3中，所述醇沉的温度为1～4℃，时间为8～12h。
在本发明的一些实施方式中，步骤S4中，所述固相B与添加的碳酸钠溶液的质量体积比为1：4～8。
在本发明的一些实施方式中，步骤S4中，所述碳酸钠溶液的浓度为0.05～0.10mol/L。
在本发明的一些实施方式中，步骤S4中，所述碳酸钠溶液中还包含20～40mmol/L的硼氢化钠。
在本发明的一些实施方式中，步骤S4中，所述固液分离方式采用离心，离心速率为4000～6000rpm，时间为10～15min。
在本发明的一些实施方式中，步骤S4中，加入碳酸钠溶液后还包括搅拌步骤，搅拌速率为100～500rpm，时间为1～5min。
根据本发明的第二个方面，提出了上述方法的应用，所述应用为在提取多酚中的应用。
一种荔枝多酚的提取方法，所述方法包括以下步骤：将上述提取的荔枝多酚加合物加入碱性溶液中，在惰性气氛的保护下搅拌12-24h；将混合物调Ph至中性，加入乙酸乙酯进行萃取，分离得到乙酸乙酯萃取相；将得到的萃取相于30～40℃真空浓缩至乙酸乙酯完全挥发，得到所述的荔枝多酚。
在本发明的一些实施方式中，所述碱性溶液为氢氧化钠、氢氧化钾中的一种。
在本发明的一些实施方式中，所述应用为在制备促进消化的食品或药品中的应用。
根据本发明的一种优选的实施方式，至少具有以下有益效果：通过本发明的方法，可以从水果中连续提取高纯度的水溶性多酚加合物、不溶性多酚加合物和碱溶性多酚加合物，基本没有多糖和多酚损失，方法简单高效，工艺可操作性强，成本低，易实现工业化生产。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：
图1为本发明测试例中的三种多酚加合物的高效液相色谱图；
图2为本发明测试例中的三种多酚加合物的结合酚含量图。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1
本实施例提供了一种水果中三种多酚加合物的连续提取方法，具体过程为：
(1)将200g荔枝果肉浸泡在无水乙醇中，在4℃下过夜(12h)，去除脂肪、色素等小分子物质；
(2)以4500r/min离心10min收集沉淀；
(3)将步骤(2)所得的沉淀加入1000mL蒸馏水中，在90℃水浴中提取4h。再次提取滤渣并合并滤液；
(4)步骤(3)所得的滤液在60℃真空浓缩后，用Sevag法脱蛋白8次，然后加入4倍体积的无水乙醇，在4℃下过夜；过滤收集沉淀干燥即得水溶性多酚加合物。
(5)将步骤(3)所得的滤渣中加入500mL 0.05mol/L Na2CO3溶液(含20mmol/L硼氢化钠)震荡提取4h后，4000rpm离心10min，得到上清液和沉淀；将上清液冻干后，得碱溶性多酚加合物；将沉淀通过冷冻干燥后获得不溶性多酚加合物。
实施例2
本实施例从实施例1中提取得到的水溶性多酚加合物、不溶性多酚加合物和碱溶性多酚加合物中采用以下步骤分别提取其中的结合酚。
将多酚加合物(水溶性多酚加合物、不溶性多酚加合物或碱溶性多酚加合物)加入2M氢氧化钠溶液中，并在氮气气氛下用磁力搅拌器在室温搅拌18h。然后将混合物用6M盐酸中和后，用乙酸乙酯萃取6次。合并有机相，并在35℃下真空蒸发至干，用85％甲醇复溶，然后定容至10mL，即得结合酚，并在-20℃下保存在冰箱中。
试验例
1、三种多酚加合物的检测
采用了高效液相色谱(HPLC)-二极管阵列检测器(DAD)对实施例2制备的3种多酚加合物中结合酚的含量分别进行鉴定；采用TOF 5600+液相色谱高分辨串联质谱仪对三种多酚加合物的酚类组成进行鉴定；采用反相高效液相色谱法对三种多酚加合物中的酚类化合物进行鉴定。方法如下：
使用YMC-Pack ODS-A色谱柱(250×4.6mml.D，5μm粒径)对实施例1制备的3种多酚加合物进行色谱分离。流动相由0.4％的乙酸水溶液(溶液A)和乙腈(溶剂B)组成。梯度曲线如下：0-40min，5-25％B；40-45min，25-35％B；总运行时间为50min，平衡5min，流速为1.0mL/min，进样量为20μL，柱温箱30℃。在分析之前，所有样品均通过0.45μm过滤器过滤。(如图1所示)。
将实施例1制备的三种多酚加合物中的酚类化合物，采用质谱仪进行鉴定，用TOF5600+液相色谱高分辨串联质谱仪，配备涡轮离子喷雾电离源，使用EclipsePlus C18柱(2.1×100mm，1.8μm，安捷伦，德国)在负离子ESI模式下运行。毛细管电压设为4500v(负)，流动相为0.4％甲酸水溶(A)和乙腈(B)。以洗脱梯度进行分析：0-16min，5-25％B；16-18min，25-35％B；18-20min，35-50％B。流速为0.4mL/min，柱温为35℃，离子源温度为500℃，进样量为4μL。分析前，所有样品均通过0.22μm过滤器过滤。通过10次多通道采集，在100～1000m/z范围内扫描。(如表1-3所示)。
表1水溶性多酚加合物
表2碱溶性多酚加合物
表3不溶性多酚加合物
采用反相高效液相色谱法对三种多酚加合物中的结合酚含量进行鉴定。在分析之前，所有样品均通过0.45μm过滤器过滤。高效液相色谱采用YMC-Pack ODS-A柱(250×4.6mml.D.，5μm粒径)；柱温箱30℃；进样量20μL；检测器：DAD；流动相流速1.0mL/min下在安捷伦1260液相色谱仪上进行高效液相色谱分析。流动相为溶剂A(水/乙酸，996:4)和溶剂B(乙腈)。以下为洗脱梯度：0～40min溶剂B：5％～25％；40～45min溶剂B：25％～35％；45～50min溶剂B：35％～55％；总运行50min，平衡5min。在280nm紫外检测器下收集色谱数据，根据对比标准品(食子酸，儿茶素，丁香醛，原儿茶素，原儿茶醛，芦丁，(+)-没食子儿茶素，咖啡酸，原花青素B2，高原儿茶酸，槲皮素，丁香酸)的保留时间进行分析样品中酚类化合物的含量，数据为从三个样品获得的三个重复的平均值。
表4
三种多酚加合物的高效液相色谱的数据结果如图1所示，从图中可以看出，本发明方案成功制备了3种多酚加合物，质谱数据如表1-3所示，3种多酚加合物中结合酚的含量如表4所示，从表中可以看出，本发明方案成功制备了3种多酚加合物，本发明方案制备的多酚加合物鉴定出含有没食子酸，儿茶素，原儿茶素，原儿茶醛，芦丁，(+)-没食子儿茶素，咖啡酸，原花青素B2等多种多酚，含量高。
2、三种多酚加合物中结合酚的总酚含量测定
分别取稀释20倍的实施例2制备的3种结合酚样品125μL中加入125μL福林酚试剂和蒸馏水(0.50mL)。涡旋震荡均匀后避光反应6min后，依次加入1.25mL Na2CO3溶液(7％，m/v)和1mL蒸馏水。涡旋震荡均匀后，避光反应90min。用Shimadzu UV-1800分光光度计在760nm处测定吸光度。以没食子酸为标准，总酚含量表示为每100克荔枝果肉干重(DW)的没食子酸当量(GAE)含量。
实验结果如图2所示，从图中可以看出，本发明不溶性多酚加合物中的结合酚含量最高，含量最低的是碱溶性多酚加合物，结果表明，本申请方案成功提取了水溶性多酚加合物、不溶性多酚加合物和碱溶性多酚加合物。
综上所述，通过本发明方案可以从水果中连续提取水溶性多酚加合物、不溶性多酚加合物和碱溶性多酚加合物，方法简单高效，工艺可操作性强。
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
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