青龙衣提取物在人黑色素瘤细胞损伤的应用
阅读说明：本技术 青龙衣提取物在人黑色素瘤细胞损伤的应用 (Application of exocarpium Juglandis Immaturus extract in treating human melanoma cell injury ) 是由 马晓玲 石磊岭 魏鸿雁 宋海龙 朱军 郭雄飞 于 2021-11-08 设计创作，主要内容包括：本发明公开了青龙衣提取物在人黑色素瘤细胞损伤的应用,所述人黑色素瘤细胞损伤为人黑色素瘤细胞氧化应激损伤。所述青龙衣提取物的提取方法如下：干燥青龙衣,粉碎,乙醇热回流提取,合并提取液,减压浓缩,得到浸膏,浸膏用水分散,依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取,萃取液减压浓缩至干燥,分别得到石油醚萃取物、二氯甲烷萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物。以不同浓度H-(2)O-(2)作用不同时间来诱导A375细胞氧化损伤,从DPPH、ABTS自由基的清除率检测抗氧化活性。(The invention discloses application of a exocarpium Juglandis Immaturum extract in human melanoma cell injury, wherein the human melanoma cell injury is human melanoma cell oxidative stress injury. The extraction method of the exocarpium Juglandis Immaturum extract comprises the following steps: drying exocarpium Juglandis Immaturus, pulverizing, extracting with ethanol under reflux, mixing extractive solutions, concentrating under reduced pressure to obtain extract, dispersing the extract with water, sequentially extracting with petroleum ether, dichloromethane, ethyl acetate and n-butanol, concentrating the extractive solution under reduced pressure to dry to obtain petroleum ether extract, dichloromethane extract, ethyl acetate extract and n-butanol extract, respectively. In a different wayConcentration H 2 O 2 Acting for different time to induce A375 cell oxidative damage, and detecting antioxidant activity from DPPH and ABTS free radical clearance.)
技术领域
本发明涉及提取青龙衣中的化学成分的技术领域，更具体的说是涉及青龙衣提取物在人黑色素瘤细胞损伤的应用。
背景技术
青龙衣Green wulnut husk是胡桃科植物落叶乔木胡桃楸，果实的未成熟青色外果皮，又被称为核桃青皮，始载于《开元本草》，其镇痛、治疡功效在《山东中草药手册》、《救急方》等医药典籍中早有记载，民间也有将其泡水饮用起止痛之效的应用。现代研究表明，青龙衣中含有丰富的化学成分，包括醌类、黄酮类、二芳基庚烷类、酚酸类等，具有良好的抗菌、抗肿瘤、镇痛等多种药理活性。
核桃青皮一直被当做废弃物或者燃料，对环境带来了较大的压力和污染，农民收获核桃时，处理核桃青皮时手上会留下难以洗去的黑灰色印记，难以洗净。核桃盛产区域产生大量的核桃青皮堆积，堆积的果皮会产生难闻气味，产生有害液体，对人体、农作物等产生影响。因此，加大核桃青皮的开发和利用成为促进核桃产业进一步发展的重要问题。
近年来，氧化应激学说备受关注。氧化应激是指人体内氧化与抗氧化作用的不平衡，导致人体产生大量的氧化中间产物。M Eskandani等人研究表明氧化应激水平和酪氨酸酶活性呈负相关，酪氨酸酶活性可调节皮肤黑色素细胞产生黑色素。Schallreuter等人研究表明白癜风患者的表皮细胞中含有H2O2，白癜风患者与H2O2水平较高有关，氧化应激失衡产生的氧化物可以使黑色素细胞受到损伤，导致黑色素生成量减少，进而患白癜风等疾病。因此，抗氧化剂治疗已成为白癜风的有前途的治疗方向。
本发明为进一步探究青龙衣抗氧化损伤活性，对青龙衣提取物的不同极性萃取物进行体外细胞抗氧化损伤活性研究与清除DPPH、ABTS自由基能力做出评价。因此，提供青龙衣提取物在人黑色素瘤细胞损伤的应用，是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了青龙衣提取物在人黑色素瘤细胞损伤的应用，采用H2O2诱导A375细胞氧化损伤模型，研究核桃青皮乙醇提取物的不同极性萃取物抗氧化作用，筛选出主要抗氧化作用的有效部位，为开发治疗白癜风疾病的药物和天然的食品抗氧化剂提供参考依据。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
青龙衣提取物在人黑色素瘤细胞损伤的应用，所述人黑色素瘤细胞损伤为人黑色素瘤细胞氧化应激损伤。
优选的，所述青龙衣提取物的提取方法如下：
干燥青龙衣，粉碎，用体积分数70％的乙醇热回流提取3次，合并提取液，旋转蒸发仪50℃减压浓缩，得到浸膏，浸膏用水分散，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，萃取液减压浓缩至干燥，分别得到石油醚萃取物、二氯甲烷萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物。
优选的，所述二氯甲烷萃取物的提取方法如下：干燥青龙衣，粉碎，用体积分数70％的乙醇热回流提取3次，合并提取液，旋转蒸发仪50℃减压浓缩，得到浸膏，浸膏用水分散，AB-8树脂柱上样，95％乙醇：二氯甲烷＝1：1洗脱，回收洗脱液旋转蒸发仪50℃减压浓缩至干燥，得到二氯甲烷萃取物。
优选的，所述乙酸乙酯萃取物的提取方法如下：干燥青龙衣，粉碎，用体积分数70％的乙醇热回流提取3次，合并提取液，旋转蒸发仪50℃减压浓缩，得到浸膏，浸膏用水分散，HPD300大孔树脂柱上样，95％乙醇：乙酸乙酯＝1：1洗脱，回收洗脱液旋转蒸发仪50℃减压浓缩至干燥，得到乙酸乙酯萃取物。
优选的，所述二氯甲烷萃取物的提取方法可替换为：干燥青龙衣，粉碎，用二氯甲烷回流提取，旋转蒸发仪50℃减压浓缩至干燥，得到二氯甲烷萃取物。
优选的，所述二氯甲烷萃取物的提取方法可替换为：干燥青龙衣，粉碎，用水：二氯甲烷＝1：1回流提取，旋转蒸发仪50℃减压浓缩至干燥，得到二氯甲烷萃取物。
优选的，所述乙酸乙酯萃取物的提取方法可替换为：干燥青龙衣，粉碎，用乙酸乙酯回流提取，旋转蒸发仪50℃减压浓缩至干燥，得到乙酸乙酯萃取物。
优选的，所述乙酸乙酯萃取物的提取方法可替换为：干燥青龙衣，粉碎，用水：乙酸乙酯＝1：1回流提取，旋转蒸发仪50℃减压浓缩至干燥，得到乙酸乙酯萃取物。
优选的，所述人黑色素瘤细胞的细胞培养方法如下：
取冻存于液氮中的人黑色素瘤A375细胞，置37℃水浴中解冻，将细胞转移至离心管，设置1000r/min，离心4min，沉淀用5mL含10％FBS的DMEM培养基重悬于37℃、5％的CO2的条件下静置培养，换液，细胞融合至80％时，用1mL胰蛋白酶消化，传代。
青龙衣提取物在清除DPPH自由基的应用，所述青龙衣提取物为青龙衣的乙酸乙酯萃取物和二氯甲烷萃取物。
青龙衣提取物在清除ABTS自由基的应用，所述青龙衣提取物为青龙衣的乙酸乙酯萃取物和二氯甲烷萃取物。
青龙衣提取物在制备治疗白癜风疾病的药物中的应用。
通过采用上述技术方案，本发明的有益效果如下：
本发明研究了对青龙衣提取物的不同极性萃取物样品对A375细胞的抗氧化作用，筛选出最佳部位，核桃青皮乙醇提取物的乙酸乙酯萃取物和二氯甲烷萃取物分别使细胞存活率提高至85.79％、86.57％，总抗氧化能力提高至1.97mmol/mL，1.77mmol/mL，SOD活力分别提高至92.55U/mgprot，68.34U/mgprot，MDA含量分别降低至9.05nmol/mL，11.41nmol/mL，DPPH自由基清除率分别为86.67％、63.54％，ABTS自由基清除率分别为91.53％、74.02％。由此可知，青龙衣提取物的乙酸乙酯萃取物和二氯甲烷萃取物对H2O2氧化损伤的A375细胞具有明显的保护作用，其中乙酸乙酯萃取物的抗氧化能力更强，可用作食品的抗氧化剂或用于治疗白癜风等疾病，能提高核桃青皮的利用率，降低核桃青皮对环境的危害。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为青龙衣乙酸乙酯萃取物和二氯甲烷萃取物对H2O2诱导A375细胞MDA的影响；
图2附图为青龙衣乙酸乙酯萃取物和二氯甲烷萃取物对H2O2诱导A375细胞T-AOC的影响；
图3附图为青龙衣乙酸乙酯萃取物和二氯甲烷萃取物对H2O2诱导A375细胞SOD的影响；
图4附图为青龙衣乙酸乙酯萃取物和二氯甲烷萃取物对DPPH·的清除能力；
图5附图为青龙衣乙酸乙酯萃取物和二氯甲烷萃取物对ABTS+·的清除能力。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例所用仪器为二氧化碳培养箱BC-J80S，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；酶标仪BioTeK、Gen5 BioTeK；SW-CJ-2F型洁净工作台，苏州尚田洁净技术有限公司；Eclipse Ts2型倒置显微镜，日本Nikon公司；96孔细胞培养板，德国Eppendorf公司；移液器，德国Eppendorf公司。
本发明实施例所用材料与试剂中95％乙醇、氯仿、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇有机试剂均产自AR安徽安特生物化学有限公司；DMEM高糖培养基，Hyclone公司；胎牛血清，Gibco公司，FBS，Lot：1428479；Cell Counting Kit-8(CCK-8)，武汉博士德生物工程有限公司，批号：AR1160-500；过氧化氢30％，天津欧博凯化工有限公司；丙二醛(MDA)测定试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)活性测定试剂盒、总抗氧化能力(T-AOC)试剂盒，南京建成生物工程研究所，批号分别：20200702、20200708、20200706)；ABTS、DPPH、抗坏血酸，上海源叶生物科技有限公司；过硫酸钾，天津市风船化学试剂科技有限公司。
本发明实施例所用药物与细胞：人黑色素瘤A375细胞，购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源库；实验所用青龙衣采集于新疆和田。
数据统计使用SPSS 25.0统计软件和OriginPro 8.5、GraphPadprism5作图完成，以x±s表示，采用单因素方差分析及LSD多重比较，检验标准a＝0.05，以p<0.05为差异具有统计学意义。
实施例
实施例公开了青龙衣提取物在人黑色素瘤细胞损伤的应用：
青龙衣提取物的提取方法如下：
干燥青龙衣，粉碎，用体积分数70％的乙醇热回流提取3次，合并提取液，旋转蒸发仪50℃减压浓缩，得到浸膏，浸膏用水分散，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，萃取液减压浓缩至干燥，分别得到石油醚萃取物、二氯甲烷萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物。
1.1青龙衣的不同极性萃取物对A375细胞安全浓度剂量范围的测定：
取冻存于液氮中的人黑色素瘤A375细胞，置37℃水浴中解冻，将细胞转移至离心管，设置1000r/min，离心4min，沉淀用5mL含10％FBS的DMEM培养基重悬于37℃、5％的CO2的条件下静置培养，换液，细胞融合至80％时，用1mL胰蛋白酶消化，传代。
取对数生长期的细胞，用含10％FBS的DMEM培养基调整细胞密度至4×104/mL，以每孔100μL接种于96孔培养板中，于37℃，5％CO2培养箱中培养24h。实验分组为对照组、给药组、空白组。空白组加入不含细胞的DMEM培养液，对照组每孔加入含细胞的DMEM培养液，给药组将核桃青皮各部位样品分别用DMSO配制储备液，用DMEM培养液稀释至不同浓度：12.5、25、50、100mg/L，每孔加入100μL，作用A375细胞24h后，去除上清液加入新配制含10％CCK-8溶液100μL孵育1h，酶标仪检测450nm波长处的光密度值，每个浓度4个复孔，按式1计算细胞存活率。
式中：实验孔为含有细胞和含待测物的培养基；空白孔为只含培养基；对照孔为只含细胞的培养基。
测定结果如表1所示，核桃青皮在100、50、25、12.5mg/L浓度下无细胞毒性。在浓度为100、50mg/L时药物溶解在培养基中有较浅颜色，因此各部位选择25mg/L以下浓度进行后续实验。
表1核桃青皮的不同极性萃取物对A375细胞存活率％的影响
1.2建立A375细胞氧化损伤模型：
按照“1.1”方法接种细胞，培养24h。设对照组：加入含细胞的DMEM培养基；模型组：分别加入终浓度为400、600、800μmol/L的H2O2；空白组：不含细胞的DMEM培养液。H2O2作用A375细胞2、4、6h后，去除上清液加入新配制含10％CCK-8溶液100μL孵育1h，酶标仪检测450nm波长处的光密度值，按式1计算细胞存活率。每个浓度4个复孔。
结果如表2所示:在H2O2溶液浓度为400μmol/L，作用时间4h时，立即用CCK-8检测A375细胞的存活率为50.38％。以半数致死率为原则，选择细胞存活率为50％左右时为建立最优的模型条件。
表2不同浓度H2O2对A375细胞作用不同时间后存活率％的影响
1.3核桃青皮的不同极性萃取物对H2O2诱导A375细胞损伤的修复作用：
A375细胞按“1.1”方法接种于96孔板，培养24h后，空白组与对照组每孔加入DMEM培养液；模型组和给药组加入400μmol/L的H2O2作用4h后；空白组、对照组、模型组更换新培养液100μL；给药组：将核桃青皮的不同极性萃取物分别用DMEM培养液稀释成浓度分别为3.125、6.25、12.5、25mg/L，每孔加入100μL。培养24h用CCK-8法检测，每个浓度4个复孔，按式1计算细胞存活率。
结果如表3所示，与对照组比较，模型组存活率显著降低至49.93％(p<0.001)，与模型组比较，核桃青皮的乙酸乙酯、二氯甲烷萃取物对H2O2诱导的A375细胞具有显著的保护作用(p<0.05)，乙酸乙酯萃取物最适浓度时，可使细胞活力升高至75.13％，二氯甲烷萃取物最适浓度时，可使细胞活力达72.31％。这说明在相同浓度下核桃青皮的乙酸乙酯萃取物、二氯甲烷萃取物的是核桃青皮中主要修复H2O2氧化损伤A375细胞的有效部位。
表3核桃青皮的不同极性萃取物对H2O2损伤后的A375细胞存活率的影响
1.4核桃青皮的不同极性萃取物对A375细胞防御H2O2损伤的作用
A375细胞按“1.1”方法接种于96孔板，培养24h，空白组、对照组与模型组每孔加入DMEM培养液；给药组：将核桃青皮的不同极性萃取物分别用DMEM培养液稀释成浓度分别为3.125、6.25、12.5、25mg/L，每孔加入100μL。培养24h，模型组和给药组加入400μmol/L的H2O2作用4h后用CCK-8法检测，每个浓度4个复孔，按式1计算细胞存活率。
结果如表4所示，与对照组比较，模型组存活率显著降低至52.56％(p<0.001)，表明H2O2对A375细胞产生明显损伤作用，说明造模成功，与模型组比较，核桃青皮的乙酸乙酯、二氯甲烷萃取物对A375细胞具有显著的防御损伤作用(p<0.01)，乙酸乙酯萃取物可使细胞活力提升至85.79％，二氯甲烷萃取物可使细胞活力提升至86.57％，其他极性萃取物没有改善细胞活力。说明在相同浓度下核桃青皮的乙酸乙酯萃取物、二氯甲烷萃取物是核桃青皮中主要保护A375细胞免受H2O2损伤的有效部位。
表4核桃青皮的不同极性萃取物对A375细胞防御H2O2损伤的影响
1.5T-AOC能力、MDA含量、SOD活性测定
取对数生长的A375细胞，消化，离心，重悬，按每孔2mL，1×106个/孔，接种于6孔板中，培养24h，对照组更换培养基，模型组和给药组加入400μmol/L的H2O2作用4h，模型组和对照组更换新培养基，给药组：将核桃青皮乙酸乙酯萃取物和二氯甲烷萃取物分别用DMEM培养液稀释，分别为低浓度6.25mg/L、中浓度12.5mg/L、高浓度25mg/L，每孔加入2mL。培养24h，收集细胞，按照T-AOC、MDA、SOD检测试剂盒说明书操作。每个浓度3个复孔，结果如图1-3所示，其中与对照组比较，#p<0.05；##p<0.01；与模型组比较，*p<0.05；**p<0.01。
由图1-3可知：模型组的总抗氧化能力和SOD活力明显降低，MDA含量明显增高。其中对照组的MDA含量为8.84nmol/mL，总抗氧化能力为2.06mmol/mL，SOD活力为94.96U/mgprot，模型组的MDA含量为14.29nmol/mL，总抗氧化能力为1.45mmol/mL，SOD活力为62.72U/mgprot，核桃青皮乙酸乙酯萃取物和二氯甲烷萃取物高剂量组处理A375细胞后，A375细胞的MDA含量分别降低至9.05nmol/mL，11.41nmol/mL，总抗氧化能力分别提高至1.97mmol/mL，1.77mmol/mL，SOD活力分别提高至92.55U/mgprot，68.34U/mgprot，由此可知，乙酸乙酯萃取物的抗氧化能力优于二氯甲烷萃取物。
1.6清除DPPH自由基的能力的测定
准确称取1.97mg DPPH，用少量无水乙醇溶解后，移至50mL容量瓶中用无水乙醇定容，配置成浓度为0.1mmol/L的DPPH溶液。分试管1，2，3号，1号试管加入0.3mL不同浓度提取物和0.9mL无水乙醇，2号试管加入0.3mL不同浓度提取物和0.9mL的0.1mmol/L的DPPH溶液，3号试管加入0.9mL的0.1mmol/L的DPPH溶液和0.3mL去离子水。以同样浓度系列的抗坏血酸为阳性对照，混匀后在室温下避光反应30min于517nm处测定各孔吸光度，按式2计算DPPH·的清除率。
式中：A1：提取物+无水乙醇；A2：提取物+DPPH溶液；A3：DPPH溶液+去离子水
DPPH溶液为紫色，当待测物具有清除DPPH自由基能力时，紫色变浅，在517nm波长处测定吸光度值会降低，由此可知待测物的抗氧化效果。由图4可知，核桃青皮乙酸乙酯萃取物和二氯甲烷萃取物在最大浓度时对DPPH自由基的清除率分别为为86.67％和63.54％，VC清除率达到96.33％，其中乙酸乙酯的效果较好，对DPPH自由基清除率接近VC的清除能力。对醇提物进行萃取后，乙酸乙酯萃取物的抗氧化能力接近于VC的抗氧化能力。核桃青皮醇提物的乙酸乙酯萃取物和二氯甲烷萃取物的抗氧化活性可能被这些因素所影响，从而抗氧化活性有所降低。
1.7清除ABTS+·自由基的能力的测定
取6.6mg过硫酸钾溶于10mL蒸馏水中，得2.45mmol/L的过硫酸钾溶液，取7.7mgABTS溶解于2mL过硫酸钾溶液中，室温过夜16h后，使用蒸馏水稀释，得在734nm下测量吸光度在0.7±0.02之间的ABTS工作液。取50μL不同浓度提取物于96孔板中，加入150μL的ABTS工作液，混匀，室温反应6min，在734nm下测定吸光度值，以抗坏血酸为阳性对照，按式3计算ABTS+·的清除率。
式中：A0：50μL蒸馏水+150μL ABTS工作液；A1：50μL提取物+150μLABTS工作液ABTS+·溶液为蓝绿色，当待测物具有清除ABTS+·自由基能力时，蓝绿色变浅，在734nm处测定吸光度值会降低，由此可知待测物的抗氧化效果。由图5可知，核桃青皮乙醇提取物的乙酸乙酯萃取物和二氯甲烷萃取物在最大浓度时对ABTS自由基的清除率分别为为91.53％和74.02％，VC达到94.67％。其中，乙酸乙酯萃取物的能力强于二氯甲烷萃取物。在最大浓度时，乙酸乙酯萃取物清除ABTS自由基的效果和VC相当。
H2O2在浓度400μmol/L，作用时间4h为建立氧化应激模型条件。与模型组比较，核桃青皮乙醇提取物的乙酸乙酯萃取物和二氯甲烷萃取物浓度为25μg/mL时能显著提高A375细胞活力，细胞存活率分别为85.79％，86.57％，核桃青皮乙醇提取物的乙酸乙酯萃取物和二氯甲烷萃取物可以降低细胞中MDA含量、提高SOD酶活力和总抗氧化能力，并明显改善细胞形态。核桃青皮乙醇提取物的乙酸乙酯萃取物和二氯甲烷萃取物对DPPH自由基的清除率分别为为86.67％和63.54％，ABTS自由基的清除率分别为为91.53％和74.02％。核桃青皮乙醇提取物的乙酸乙酯萃取物和二氯甲烷萃取物对H2O2诱导的A375细胞具有明显的保护作用。
此外，对实施例青龙衣提取所得产物进行分析，经HPLC法测定其中含有不低于0.25％的3-羟基-3′,4″-环氧-1-(4′-甲氧基苯基)-7-(3″-羟基苯基)-庚烷和不低于0.45％的2,3-二羟基-1-(4′-羟基-3′-甲氧基苯基)-7-(4″-羟基苯基)-庚烷。
2.1HPLC法测定3-羟基-3′,4″-环氧-1-(4′-甲氧基苯基)-7-(3″-羟基苯基)-庚烷和2,3-二羟基-1-(4′-羟基-3′-甲氧基苯基)-7-(4″-羟基苯基)-庚烷的含量
2.1.1色谱条件考察：
检测波长的选择，本实验在210～360nm进行紫外扫描检测，结果显示在300nm下吸收峰面积最大，故选择检测波长为300nm；流动相的考察，曾用不同比例甲醇-水溶液系统对供试品进行等度洗脱，发现分离效果不理想，采用乙腈-水溶液系统进行洗脱，分离效果较好但有拖尾现象，在洗脱系统中加入磷酸后，改善了分离效果。因此选择以乙腈-0.5％磷酸(30:70)为流动相，3-羟基-3′,4″-环氧-1-(4′-甲氧基苯基)-7-(3″-羟基苯基)-庚烷和2,3-二羟基-1-(4′-羟基-3′-甲氧基苯基)-7-(4″-羟基苯基)-庚烷的出峰时间合适且峰的分离效果好。
2.1.2色谱条件：
色谱柱：大连江申Century SIL C18-EPS柱(4.6×250mm，5μm)；流动相：乙腈-0.5％磷酸(30:70)；体积流量：1.0mL/min；检测波长：300nm；柱温：30℃；进样量：10μL。在此色谱条件下，3-羟基-3′,4″-环氧-1-(4′-甲氧基苯基)-7-(3″-羟基苯基)-庚烷的保留时间为14.1min，2,3-二羟基-1-(4′-羟基-3′-甲氧基苯基)-7-(4″-羟基苯基)-庚烷的保留时间为26.8min，理论塔板数均大于8000，分离度均大于1.5，拖尾因子均小于1.05。
2.1.3标准曲线的制备：
精密称取3-羟基-3′,4″-环氧-1-(4′-甲氧基苯基)-7-(3″-羟基苯基)-庚烷2.49mg，2,3-二羟基-1-(4′-羟基-3′-甲氧基苯基)-7-(4″-羟基苯基)-庚烷5.00mg，置10mL量瓶中，用60％乙醇溶解并加至刻度。精密吸取对照品溶液1.0、2.0、4.0、8.0、12.0、16.0、20.0μL。注人液相色谱仪中，测定峰面积。分别以3-羟基-3′,4″-环氧-1-(4′-甲氧基苯基)-7-(3″-羟基苯基)-庚烷和2,3-二羟基-1-(4′-羟基-3′-甲氧基苯基)-7-(4″-羟基苯基)-庚烷质量X为横坐标，峰面积Y为纵坐标，得方程:Y1＝36172X1-6645862，r＝0.9998，线性范围:5～100μg/mL；Y2＝36172X2-6645862，r＝0.9999，线性范围:10～200μg/mL。
2.1.4供试品溶液的制备：
精密称取各青龙衣提取物、有效部位样品适量，置50mL容量瓶中，用60％乙醇溶解，超声提取30min，静置至室温后加60％乙醇至刻度，过0.22μm滤膜，即得。
2.1.5精密度试验：
精密吸取3-羟基-3′,4″-环氧-1-(4′-甲氧基苯基)-7-(3″-羟基苯基)-庚烷和2,3-二羟基-1-(4′-羟基-3′-甲氧基苯基)-7-(4″-羟基苯基)-庚烷对照品溶液10uL，连续进样5次，测定相应的峰面积，RSD(n＝5)分别为1.1％和1.0％，表明该方法精密度良好。
2.1.6稳定性试验：
精密吸取待测供试品溶液10μL，分别于0，1，2，4，6，8，12h进样测定，测得3-羟基-3′,4″-环氧-1-(4′-甲氧基苯基)-7-(3″-羟基苯基)-庚烷峰面积的RSD为1.2％，2,3-二羟基-1-(4′-羟基-3′-甲氧基苯基)-7-(4″-羟基苯基)-庚烷峰面积的RSD为1.5％，结果表明供试品溶液在12h内稳定。
2.1.7重复性试验：
精密称取青龙衣提取物5份，各约0.25g，按“2.1.4”项下方法制备供试品溶液，精密吸取10μL在上述色谱条件下测定3-羟基-3′,4″-环氧-1-(4′-甲氧基苯基)-7-(3″-羟基苯基)-庚烷和2,3-二羟基-1-(4′-羟基-3′-甲氧基苯基)-7-(4″-羟基苯基)-庚烷的含量。结果含量平均值分别为0.36％和0.62％mg/g，RSD(n＝5)为1.6％和1.4％。
2.1.8加样回收率试验：
根据“2.1.7”项下的测定结果，精密称取青龙衣提取物适量共3份，分别精密加入3-羟基-3′,4″-环氧-1-(4′-甲氧基苯基)-7-(3″-羟基苯基)-庚烷和2,3-二羟基-1-(4′-羟基-3′-甲氧基苯基)-7-(4″-羟基苯基)-庚烷对照品对照品储备液270μL，摇匀，按“2.1.4”项下方法制备供试溶液，精密吸取10μL进样测定含量，计算其平均回收率分别为98.3％和95.6％，RSD分别为1.7和1.9％。
2.1.9测定：采用外标法进行测定(n＝3)。
各提取物的测定结果见下表5：
表5青龙衣各提取物的关键成分含量测定
2.2青龙衣提取物中关键指标成分的结构式：
2,3-二羟基-1-(4′-羟基-3′-甲氧基苯基)-7-(4″-羟基苯基)-庚烷
3-羟基-3′,4″-环氧-1-(4′-甲氧基苯基)-7-(3″-羟基苯基)-庚烷
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
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