一种高效的海马齿腋芽组培快繁方法
阅读说明：本技术 一种高效的海马齿腋芽组培快繁方法 (Efficient hippocampus axillary bud tissue culture and rapid propagation method ) 是由 魏翔莺 何伟红 王丹 郑秀霞 杨楠 于 2021-08-30 设计创作，主要内容包括：本发明属于植物无性扩繁技术领域,公开了一种高效的海马齿腋芽组培快繁方法。本发明所述的方法包括海马齿无菌实生苗、茎段丛芽增殖诱导、丛芽生根、炼苗和移栽步骤。以带有腋芽的茎段为外植体,通过诱导腋芽增殖获得大量海马齿组培苗的无性繁殖方式。通过MS培养基添加不同植物生长调节剂,实现腋芽的高效扩繁和诱导生根。采用的技术方法简便易行、成本低,能在短时间内获得大量生长一致、无病害、健壮的海马齿,与有性繁殖相比明显缩短繁殖周期,且不容易产生性状分离。所获得的海马齿能够应用于滨海、湖泊及河流等水体及其淡水、海水养殖尾水的生态修复,也可用于海岸带沙滩修复,应用广泛。该发明为海马齿的推广应用提供了材料保障。(The invention belongs to the technical field of plant asexual propagation and discloses an efficient hippocampus axillary bud tissue culture rapid propagation method. The method comprises the steps of germfree seedling of hippocampus, propagation induction of stem-segment cluster buds, rooting of the cluster buds, hardening off and transplanting. The stem section with axillary buds is used as an explant, and a large amount of hippocampus tooth tissue culture seedlings are obtained by inducing the proliferation of the axillary buds. Different plant growth regulators are added into an MS culture medium, so that the efficient propagation and root induction of the axillary buds are realized. The adopted technical method is simple and easy to implement, has low cost, can obtain a large amount of healthy and strong hippocampus with consistent growth in a short time, obviously shortens the propagation period compared with sexual propagation, and is not easy to generate character separation. The obtained sea horse teeth can be applied to ecological restoration of water bodies such as seashore, lake and river and fresh water thereof and seawater culture tail water, can also be applied to restoration of beach of coastal zones, and have wide application. The invention provides a material guarantee for popularization and application of the hippocampus.)
技术领域
本发明属于植物扩繁技术领域，具体涉及一种高效的海马齿腋芽组培快繁方法。
技术背景
海马齿是分布于热带或亚热带海岸的沙滩上，适应环境能力强，对盐碱和重金属具有一定的抗性。另外，海马齿对养殖场污水具有净化能力。近年来，养殖场养殖污水的排放、重金属和微塑料等已经进一步加剧了对湖泊、河水以及滨海湿地的污染。海马齿作为根系发达的盐生植物，是进行生态修复及环境治理的首选植物材料。按照常规的播种方法培育海马齿，不仅低效而且育苗周期长，感病率高，采用腋芽组培快繁方法能够大量繁殖海马齿脱毒苗，缩短育苗周期，降低感病率，有利于产业化生产。此外，对后续转抗性基因的海马齿植株的种质资源保存具有重要的应用价值。
发明内容
本发明的目的在于针对海马齿的种子繁殖周期长，无法大规模工厂化生产，插条繁殖受季节影响大，湿热季节扦插易感病等问题，提供了一种高效的海马齿腋芽组培快繁方法，缩短育苗周期，可以短期内获得大量长势一致性状稳定的海马齿植物材料，扩大其生产和应用。
为达到上述目的，本发明采用的技术方法如下：
一种高效的海马齿腋芽组培快繁方法，包括如下几个步骤：
（1）海马齿无菌苗的准备：从盐生植物海马齿中收集新鲜、成熟的种子，并对种子进行杀菌、消毒处理，将已消毒的种子播种至播种培养基中，待其萌发后将海马齿幼苗移栽至已灭菌的含播种培养基的组培玻璃瓶中，每瓶接种3 - 4棵海马齿幼苗，在温度25 ℃，湿度70 %，光周期16 h光照 / 8 h黑暗的人工培养室中培养，获得海马齿无菌苗；
（2）腋芽的增殖诱导：选取步骤（1）的海马齿无菌苗，在无菌滤纸上，用解剖刀去除外植体上原先的叶片并剪切成含有4个腋芽节点的茎段外植体，将外植体茎段插到含有腋芽增殖诱导培养基的组培玻璃瓶中，每个玻璃瓶中接种4个外植体，在温度25 ℃，湿度70%，光周期16 h光照 / 8 h黑暗的人工培养室中培养至再生芽的芽数达8-12；
（3）生根培养：用步骤（2）中含有3个腋芽节点的再生芽作为外植体来诱导其生根，剪取含有3个腋芽节点的再生芽，同时去除靠近茎段基部的第一个腋芽节点上的叶片，然后插入到生根培养基中，靠近茎段基部的第一个节点要插到生根培养基里面，在人工培养室中光照培养10天后开始长出不定根；
（4）生根苗的移栽及管护：待步骤（3）中的生根苗长至6 - 8 cm且叶片绿色浓郁时进行炼苗移栽；移栽前打开玻璃瓶盖，加入清水覆盖住培养基表层，放置两天，使生根苗提前适应环境，然后倒出培养基，用清水清洗生根苗根部残留的培养基，移栽至含有一定配比且已灭菌的基质和沙子的育苗穴盘中，盖上透明塑料罩子，保持基质水分，待到生根苗完全适应环境后移除罩子，并定期浇灌营养液。
上述步骤（1）中种子的消毒和幼苗的移栽均在超净工作台中进行，海马齿种子杀菌、消毒：先用无菌水清洗3次，再用75 vol %乙醇消毒1 min，然后用10 vol % NaClO消毒15 - 20 min，最后用无菌水清洗5 - 6次，除去残留的次氯酸钠；所述播种培养基：MS培养基 + 30 g / L蔗糖 + 8 g / L琼脂粉，pH 5.6 - 5.8。
上述步骤（2）中腋芽增殖诱导培养基：MS 培养基 + 0.5 - 3.0 mg / L ZT +0.05 - 0.4 mg / L NAA + 30 g / L蔗糖 + 8 g / L琼脂粉，调节pH至5.6 - 5.8。
步骤（3）中所述生根培养基：1 / 2 MS培养基 + 15 g / L 蔗糖 + 8 g / L琼脂+ 0.2 - 0.8 mg / L IBA或0.2 - 0.8 mg / L IAA，调节pH至5.6。
步骤（4）中所述基质:沙子质量比为2 : 1；所述营养的组成成分包括：大量元素：0.625~1.25mM NH4Cl，0.15~0.3mM KH2PO4，0.175~0.35mM K2SO4，0.2~0.4mM MgSO4·7H2O，0.1875~0.375mM CaCl2，0.312~0.625mM Ca(NO3)2；微量元素：0.01~0.02mM H3BO3，0.0045~0.009mM MnCl2·4H2O，0.16~0.32mM CuSO4·5H2O，0.385~0.77mM ZnSO4·7H2O，0.195~0.39mM NaMoO4·2H2O，10~20mM NaFe EDTA。
本发明的优点在于：本发明的方法不受外界环境的限制，一年四季都可以提供充足的海马脱毒植株，另外，也不会受到相关病虫害侵染，减低感病率。本发明是采用芽繁的方式，在植物生长调节剂的作用下进行增殖培养，增殖系数高，有利于转抗性基因的海马齿植株的种质资源保存。
附图说明
：图1 海马齿腋芽扩繁过程。A：海马齿无菌苗培育；B：腋芽增殖过程（第0天和第90天）；C：诱导生根（第10天和第24天）；D：生根苗的移栽（第8天）。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
实施例1：
一种高效的海马齿腋芽组培快繁方法，包括以下几个步骤：
（1）海马齿无菌苗的准备：首先配置海马齿播种培养基：4.43g / L MS培养基粉末+ 30 g / L蔗糖 + 8 g / L琼脂粉，调节pH为5.8，配置好培养基后，在121 ℃下高压灭菌25 min，冷却至50 ℃时倒入培养皿或组培玻璃品中。然后对盐生植物海马齿种子进行杀菌、消毒，该操作是在超净工作台中进行。先用无菌水清洗3次，再用75 vol %乙醇消毒1min，然后用10 vol % NaClO消毒15 min，最后用无菌水清洗5次，除去残留的次氯酸钠。消毒结束后，将已消毒的种子播种至播种培养基中，待其萌发后将海马齿实生苗移栽至含有播种培养基的组培玻璃瓶中，每瓶接种3棵海马齿幼苗，在温度25 ℃，湿度70 %，光周期16h光照 / 8 h黑暗的组培室中培养，获得海马齿无菌苗。
（2）腋芽的增殖诱导：先配置好腋芽增殖诱导培养基：4.43 g / L MS培养基 + 30g / L蔗糖 + 8 g / L琼脂粉，调节pH至5.8，在121 ℃下高压灭菌25 min，待培养基冷却至50 ℃时，加入相应的植物生长调节剂1.0 mg / L ZT + 0.3 mg / L NAA，混匀后倒入已灭菌的组培玻璃瓶中，每瓶30mL。在超净工作台中，选取步骤（1）中的海马齿无菌苗，在无菌滤纸上，用解剖刀切除海马齿茎段上原先的叶片并剪切成含有4个腋芽节点的茎段外植体，将茎段外植体垂直或斜插到含有腋芽增殖诱导培养基的组培玻璃瓶中，每个玻璃瓶中接种4个外植体。用封口膜封好后放置在温度为25 ℃，湿度为70 %，光周期为16 h光照 / 8 h黑暗的人工培养室中培养。培养14天后开始长出1 - 2 cm的再生芽，长至再生芽数达到10 -12。
（3）生根培养：配置生根培养基：2.22 g / L MS培养基 + 15 g / L蔗糖 + 8 g /L琼脂粉，调节pH至5.6，在121 ℃下高压灭菌25 min，待培养基冷却至50 ℃时，加入相应的植物生长素0.6 mg / L IBA 。剪取步骤（2）含有3个腋芽节点的再生芽，同时剪去靠近茎段基部的第一个腋芽节点上的叶片，然后插入到生根培养基中，注意的是靠近茎段基部的第一个节点要插到生根培养基里面。在人工培养室中光照培养10天后开始长出不定根，培养24天后生根率达到91.7 %，根数达到36 - 39根，形成完整的植株，
（4）生根苗的移栽及管护：待步骤（3）中的生根苗长至6 - 8 cm且叶片绿色浓郁时进行炼苗移栽。移栽前打开玻璃瓶盖，加入少许清水覆盖住培养基表层，放置两天，使生根苗提前适应环境。然后倒出培养基，用清水清洗生根苗根部残留的培养基，移栽至含有已灭菌的基质和沙子2:1的育苗穴盘中，盖上透明塑料罩子，保持基质水分。等到生根苗完全适应环境后移除罩子，并15天浇灌营养液。营养液的组成成分包括：大量元素：1.25mM NH4Cl，0.3mM KH2PO4，0.35mM K2SO4，0.4mM MgSO4·7H2O，0.375mM CaCl2，0.625mM Ca(NO3)2；微量元素：0.02mM H3BO3，0.009mM MnCl2·4H2O，0.32mM CuSO4·5H2O，0.77mM ZnSO4·7H2O，0.39mM NaMoO4·2H2O，20mM NaFe EDTA。
实施例2：
一种高效的海马齿腋芽组培快繁方法，包括以下几个步骤：
（1）海马齿无菌苗的准备：首先配置海马齿播种培养基：4.43 g / L MS培养基粉末 + 30 g / L蔗糖 + 8 g / L琼脂粉，调节pH为5.6，配置好培养基后，在121 ℃下高压灭菌25 min，冷却至50 ℃时倒入培养皿或组培玻璃品中。然后对盐生植物海马齿种子进行杀菌、消毒，该操作是在超净工作台中进行。先用无菌水清洗3次，再用75 vol %乙醇消毒1min，然后用10 vol % NaClO消毒15 min，最后用无菌水清洗5次，除去残留的次氯酸钠。消毒结束后，将已消毒的种子播种至播种培养基中，待其萌发后将海马齿实生苗移栽至含有播种培养基的组培玻璃瓶中，每瓶接种3棵海马齿实生苗，在温度25 ℃，湿度70 %，光周期16 h光照 / 8 h黑暗的人工培养室中培养，获得海马齿无菌苗。
（2）腋芽的增殖诱导：先配置好腋芽增殖诱导培养基；4.43 g / L MS培养基 +2.0 mg / L ZT + 0.05 mg / L NAA + 30 g / L蔗糖 + 8 g / L琼脂粉，调节pH至5.6。腋芽增殖诱导培养基配置时4.43 g / L MS培养基 + 30 g / L蔗糖 + 8 g / L琼脂粉在121℃下高压灭菌25 min，待培养基冷却至50 ℃时，加入相应的植物生长调节剂2.0 mg / LZT + 0.05 mg / L NAA，混匀后倒入已灭菌的组培玻璃瓶中，每瓶30 mL。在超净工作台中，选取步骤（1）中的海马齿无菌苗，在无菌滤纸上，用解剖刀切除海马齿茎段上原先的叶片并剪切成含有4个腋芽节点的茎段外植体，将茎段外植体垂直或斜插到含有腋芽增殖诱导培养基的组培玻璃瓶中，每个玻璃瓶中接种4个外植体。用封口膜封好后放置在温度为25 ℃，湿度为70 %，光周期为16 h光照 / 8 h黑暗的人工培养室中培养。培养大约14天后开始长出1 - 2 cm的再生芽，长至再生芽数达到8 - 10。
（3）生根培养：配置生根培养基：2.22g / L MS培养基 + 15 g / L蔗糖 + 8 g /L琼脂粉，调节pH至5.6，在121 ℃下高压灭菌25 min，待培养基冷却至50 ℃时，加入相应的植物生长素0.8 mg / L IBA 。剪取步骤（2）含有3个腋芽节点的再生芽，同时剪去靠近茎段基部的第一个腋芽节点上的叶片，然后插入到生根培养基中，注意的是靠近茎段基部的第一个节点要插到生根培养基里面。在人工培养室中光照培养10天后开始长出不定根，培养24天后生根率达到33.3 %，根数达到25 - 27根，形成完整的植株。
（4）生根苗的移栽及管护：待步骤（3）中的生根苗长至6 - 8 cm且叶片绿色浓郁时进行炼苗移栽。移栽前打开玻璃瓶盖，加入少许清水覆盖住培养基表层，放置两天，使生根苗提前适应环境。然后倒出培养基，用清水清洗生根苗根部残留的培养基，移栽至含有已灭菌的基质和沙子2:1的育苗穴盘中，盖上透明塑料罩子，保持基质水分。等到生根苗完全适应环境后移除罩子，并15天浇灌营养液。营养液的组成成分包括：大量元素：1.25mM NH4Cl，0.3mM KH2PO4，0.35mM K2SO4，0.4mM MgSO4·7H2O，0.375mM CaCl2，0.625mM Ca(NO3)2；微量元素：0.02mM H3BO3，0.009mM MnCl2·4H2O，0.32mM CuSO4·5H2O，0.77mM ZnSO4·7H2O，0.39mM NaMoO4·2H2O，20mM NaFe EDTA。
实施例3：
一种高效的海马齿腋芽组培快繁方法，包括以下几个步骤：
（1）海马齿无菌苗的准备：首先配置海马齿播种培养基：4.43 g / L MS培养基粉末 + 30 g / L蔗糖 + 8 g / L琼脂粉，调节pH为5.8，配置好培养基后，在121 ℃下高压灭菌25 min，冷却至50 ℃时倒入培养皿或组培玻璃品中。然后对盐生植物海马齿种子进行杀菌、消毒，该操作是在超净工作台中进行。先用无菌水清洗3次，再用75 vol %乙醇消毒1min，然后用10 vol % NaClO消毒15 min，最后用无菌水清洗5次，除去残留的次氯酸钠。消毒结束后，将已消毒的种子播种至播种培养基中，待其萌发后将海马齿实生苗移栽至含有播种培养基的组培玻璃瓶中，每瓶接种3棵海马齿实生苗，在温度25 ℃，湿度70 %，光周期16 h光照 / 8 h黑暗的人工培养室中培养，获得海马齿无菌苗。
（2）腋芽的增殖诱导：先配置好增殖诱导培养基，4.43 g / L MS培养基 + 1.0 mg/ L ZT + 0.1 mg / L NAA + 30 g / L蔗糖 + 8 g / L琼脂粉，调节pH至5.8，在121 ℃下高压灭菌25 min，待培养基冷却至50 ℃时，加入相应的植物生长调节剂1.0 mg / L ZT +0.1 mg / L NAA，混匀后倒入已灭菌的组培玻璃瓶中，每瓶30 mL。在超净工作台中，选取步骤（1）中的海马齿无菌苗，在无菌滤纸上，用解剖刀切除海马齿茎段上原先的叶片并剪切成含有4个腋芽节点的茎段外植体，将茎段外植体垂直或斜插到含有诱导培养基的组培玻璃瓶中，每个玻璃瓶中接种4个外植体。用封口膜封好后放置在温度为25 ℃，湿度为70 %，光周期为16 h光照 / 8 h黑暗的人工培养室中培养。培养大约14天后开始长出1 - 2 cm的再生芽，长至再生芽数达到6 - 10。
（3）生根培养：配置生根培养基，2.22 g / L MS培养基 + 15 g / L蔗糖 + 8 g /L琼脂粉，调节pH至5.8，在121 ℃下高压灭菌25 min，待培养基冷却至50 ℃时，加入相应的植物生长素0.2 mg / L IAA。剪取步骤（2）含有3个腋芽节点的再生芽，同时剪去靠近茎段基部的第一个腋芽节点上的叶片，然后插入到生根培养基中，注意的是靠近茎段基部的第一个节点要插到生根培养基里面。在人工培养室中光照培养10天后开始长出不定根，培养24天后生根率达到66.67 %，根数达到15 - 17根，形成完整的植株。
（4）生根苗的移栽及管护：待步骤（3）中的生根苗长至6 - 8 cm且叶片绿色浓郁时进行炼苗移栽。移栽前打开玻璃瓶盖，加入少许清水覆盖住培养基表层，放置两天，使生根苗提前适应环境。然后倒出培养基，用清水清洗生根苗根部残留的培养基，移栽至含有已灭菌的基质和沙子2:1的育苗穴盘中，盖上透明塑料罩子，保持基质水分。等到生根苗完全适应环境后移除罩子，并15天浇灌营养液。营养液的组成成分包括：大量元素：1.25mM NH4Cl，0.3mM KH2PO4，0.35mM K2SO4，0.4mM MgSO4·7H2O，0.375mM CaCl2，0.625mM Ca(NO3)2；微量元素：0.02mM H3BO3，0.009mM MnCl2·4H2O，0.32mM CuSO4·5H2O，0.77mM ZnSO4·7H2O，0.39mM NaMoO4·2H2O，20mM NaFe EDTA。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
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